实验六__琼脂糖凝胶电泳

实验二 琼脂糖凝胶电泳 1. 实验目的： 1掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 2.学会使用电泳仪。 3.了解实验室有毒药品的处理和保护措施。 二.仪器及试剂 1.仪器及耗材： 水平电泳槽，电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板。100ml或250ml锥形瓶、量筒、吸头等。 2.试剂及配制： 50×TAE缓冲液的配制：2mol/L Tris-乙酸，0.05mol/L EDTA(Ph8.0) 配制1000ml Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA 100ml 加入600ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1L后。高温高压灭菌，室温保存。 1×TAE缓冲液的配制： 称量20ml的50×TAE缓冲液，在加入980ml的去离子水。 溴化乙啶贮存液：10mg/ml 溴化乙啶 配制：100ml 称取1g溴化乙啶，置于100ml烧杯中，加入80ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100ml后，转移到棕色瓶中，室温保存。 6×上垟缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。 配制：10ml 溴酚蓝 25ml 二甲苯青FF 25ml 甘油 3ml 用6×TAE缓冲液定容至10ml,分装成1ml/管。-200C保存。 其他试剂：DNA样品、DNA Ladder、琼脂糖。 三、操作步骤 1．制备1%琼脂糖凝胶（大胶用70ml，小胶用50ml）:称取0.7g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中加入70ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2．胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。去透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽至于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到650C左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶液完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。 3．加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压5V/CM，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。 5．电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20min，再用清水漂洗10min。 6．观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。 四、常见问题及注意事项 1．配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。 2．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 3．电泳时应注意电源线路，预防触电。 4．溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。 5．紫外线对人体有损伤作用，开关时间不宜太长，注意防护。 6．DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。 7．质粒DNA的存在形式有3种，①共价闭环DNA(cccDNA)，常以超螺旋形式存在；②开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；③线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA＞线状DNA＞ocDNA。 五、思考题： 1．采用琼脂糖凝胶电泳分离DNA的有效分离范围是多少？采用什么方法分离巨大的DNA分子？ 2．一般情况下碱裂解法提取的质粒在琼脂糖凝胶电泳中会出现几条带？各条带有什么不同？ 3．在电泳时可采取几种方式使DNA带上溴化乙锭？