实时荧光定量PCR检测转基因小鼠外源基因拷贝数方法的建立和应用

实时荧光定量 PCR检测转基因小鼠外源基因 拷贝数方法的建立和应用 郑杰辉，林炤华，徐 瑛，刘 军，周常文 ( 福建医科大学细胞生物学与遗传学系、细胞与发育研究中心，福州 350004) 摘 要: 目的 建立实时荧光定量 PCR方法检测 CaMKⅡα － Cre转基因小鼠外源基因拷贝数的方法。方法 以 CaMK Ⅱα － Cre转基因首建鼠及其仔代阳性鼠为研究对象，利用绝对定量的实时荧光定量 PCR 法检测转基因小鼠的拷贝数，并 筛选出纯合子小鼠再经遗传育种方法以确定为纯合子小鼠。结果 绝对定量曲线公式为: △Ct = － 2. 402log5N ( 拷贝 数) + 8. 654，相关系数为 0. 9999，扩增效率为 95. 4%。三只 CaMKⅡα － Cre首建鼠的拷贝数分别为 19、7、5; 三个转基 因小鼠品系均成功获得纯合子小鼠。结论 成功建立了检测转基因小鼠外源基因拷贝数的实时荧光定量 PCR方法，该方法 可用于检测各种转基因小鼠中外源基因的拷贝数。 关键词: 转基因小鼠; 拷贝数; 实时荧光定量 PCR; SYBR Green Ⅰ; Ct值 中图分类号: R －332 文献标识码: A 文章编号: 1006 － 9534 ( 2011) 02 － 0034 － 04 Establishment and application of the method for detecting copy number of foreign gene in transgenic mice with Real － Time Fluorescent Quantitative PCR． ZHENG Jie － hui，LIN Zhao － hua，XU Ying，LIU Jun，ZHOU Chang － wen． ( Depart- ment of Cell Biology and Genetics，and Center of Cellular and Developmental Engineering，Fujian Medical University; Fuzhou，Fujian 350004) Abstract: Objective: To develop a novel method to determine transgene copy number in Genome of CaMKⅡα － Cre Transgenic Mice by using the real － time fluorescent quantitative PCR． Methods: The CaMKⅡα － Cre founder mice and their offsprings were studied． The transgene copy numbers in transgenic mice were determined by real － time fluorescent quantitative PCR，then the homo- zygote mice was obtained and proved by genetic breeding． Results: The equation of absolute quantitative standard curve was △Ct = － 2. 402log5N + 8. 654． The correlation coefficient was 0. 9999，E = 95. 4% ． Three CaMKⅡα － Cre founders were detected to have the transgene copies of 19，7，5，respectively． The homozygote transgenic mice were obtained successfully． Conclusion: A real － time fluorescent quantitative PCR method was successfully established，which might be used for determining transgene copy number in various transgenic mice． Key words: Transgenic Mice; Copy number; Real － time fluorescence quantitative PCR; SYBR GreenⅠ; Threshold cycle ( Ct) 条件性基因打靶是将某个基因的修饰限制于某些特定 类型的细胞或小鼠发育的某一特定阶段的一种特殊的基因 打靶方法。目前条件性基因打靶主要使用来源于大肠杆菌 P1噬菌体的 Cre / loxP系统。该技术是将一种组织特异性表 达 Cre的转基因小鼠与另一种目的基因片段两侧带有 loxP 位点的基因打靶小鼠杂交，从而实现时间与空间特异性的基 因敲除。因此，建立时空特异性表达 Cre 的转基因小鼠，对 于制备条件性基因敲除小鼠至关重要。 目前，一般采用组织特异性启动子对 Cre 基因表达进行 时间和空间特异性的控制。为此，我们选择 CaMKⅡα 启动 子控制 Cre基因在神经细胞中特异性表达，制备了 CaMKⅡα － Cre转基因小鼠。为了建立转基因的纯系小鼠，并为表型 和基因功能研究创造条件，需要鉴定转基因小鼠的基因 型并确定外源基因插入的拷贝数。 传统鉴定转基因拷贝数的方法是 Southern blot 法，该法 应用普遍、结果可靠，却费时、费力，并需要大量的基因组 DNA。目前，real － time PCR( 实时荧光定量 PCR) 方法已广 基金项目:福建医科大学科研发展基金( XZ04005) 通讯作者:周常文 泛应用于 DNA 和 RNA 的定量检测［1］。有研究表明，South- ern杂交与 real － time PCR两种方法对转基因拷贝数进行检 测的结果很接近，只有小部分结果不一致，表现为 real － time PCR法检测的拷贝数多于 Southern 杂交法的检测结果。理 论上讲，real － time PCR 检测出的拷贝数可能更接近于实际 数值［2 － 4］。因此，我们尝试建立了 real － time PCR 检测 CaMKⅡα － Cre转基因小鼠拷贝数的方法，为进一步研究外 源基因在转基因小鼠中的遗传和表达奠定基础。 材料与方法 1．转基因质粒构建 运用 PCR技术，从 C57BL /6J小鼠基因组中分步扩增了 CaMKⅡα基因 5＇端两段调控序列，长度为 5． 26kb。经部分测 序鉴定后，将片段分别连接于 pCre － EGFP 载体的 Cre 基因 上游，构建了神经细胞特异性表达 Cre 重组酶的表达载体 pCaMKⅡα － Cre － EGFP Ⅰ( PCCE Ⅰ) 。 2．受精卵的显微注射 转基因质粒酶切线性化、回收、纯化、显微注射及转基因 小鼠的制备由上海南方模式生物科技发展有限公司完成。 本研究遵循国家实验动物管理条例及国家实验动物管理实 ·43· 中国优生与遗传杂志 2011 年第 19 卷第 2 期 施细则。 3．小鼠基因组 DNA提取 剪取小鼠鼠尾约 1 cm，置于 1． 5 ml EP 管中，每管加入 500 μl SNET裂解液( 20 mmol /L Tris － Cl，pH 8． 0; 5 mmol /L EDTA，pH 8． 0; 400 mmol /L NaCl; 1% SDS) ，5μl蛋白酶 K溶 液( 50mg /mL) ，55℃消化过夜。加入等体积 Tris 饱和酚，首 尾颠倒混匀 20min，4 ℃12000r /m 离心 8min。吸取上清加入 一新的 1． 5ml EP管中，加入等体积酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇( 25∶ 24 ∶ 1) ，首尾颠倒混匀 20min，4℃ 12000r /m离心 8min。吸取上 清加入一新的 1． 5ml EP管中，加入等体积氯仿，首尾颠倒混 匀 20min，4℃12000r /m离心 8min。吸取上清，加入 2． 5 倍体 积无水乙醇，混匀 5min，置于 － 20℃冰箱中 20min，将絮状 DNA挑出至 1mL 75% 乙醇中洗一遍，室温 7500r /m 离心 8 min，吸弃乙醇，室温晾干，加入 100μl的双蒸水溶解［5］。 4．引物及合成 根据构建成功的 PCCE I 质粒的基因序列设计引物 F1 / R1、F2 /R2，根据小鼠管家基因 β － actin基因序列设计引物 β － actin F / R，根据 PCCE I 质粒中的 Cre 基因序列设计引物 rtcreF / R，见表 1。 表 1 PCR和实时荧光定量 PCR分析中使用的引物序列 引物 序列( 5＇－ 3＇) F1 GGAACACAGGGCGTTTCGAGAG R1 CGACCAGTTTAGTTACCCCCAGGCT F2 GTTTCACTGGTTATGCGGCGG R2 CTGCTTCCTTCACGACATTCAACA rtcre F CAACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA rtcre R TATTCAACTTGCACCATGCCGCC β － actin F TACGCCAACACAGTGCTGTCTG β － actin R CTGCTTGCTGATCCACATCTGC 5． PCR鉴定基因型 取 50 ng小鼠 gDNA，PCR检测 CaMKⅡα － Cre转基因首 建者小鼠及其仔代小鼠基因型。用 F1 /R1、F2 /R2 两对检测 引物同时进行基因型的检测，F1 /R1 引物的扩增片段长 975 bp; F2 /R2 引物的扩增片段长 918 bp。每个小鼠的 PCR检测 均重复两遍。 6．实时荧光定量 PCR法对外源基因拷贝数的检测 ( 1) 标准品对照的设置: 将含 Cre 基因的转基因质粒 PCCE I与野生型 C57BL /6J小鼠 gDNA混合，设置含有 1 个、 5 个、25 个、125 个、625 个转基因拷贝数的标准品对照。设 置公式如下:假设含有转基因片段的大小为 a bp，野生型小 鼠基因组 DNA用量为 b ng，小鼠基因组 DNA单倍体大小为 3 × 109 bp，转基因片段完全随机插入一条染色体上，那么 b ng的转基因阳性 founder 代小鼠基因组 DNA 含有一个转基 因拷贝的质量( ng) 为: a 3 × 109 × 2 × b。 以 rtcre F /R扩增转基因片段，以 β － actin F /R扩增管家 基因 β － actin作为内参标化基因组 DNA的量。rtcre F /R引 物的扩增产物 126 bp; β － actin F / R 引物的扩增产物 200 bp。将转基因片段检测引物 rtcre 扩增 Ct( rtcre) 减去相应的 β － actin 基因的扩增 Ct( β － actin) ，得到的△Ct，再对样品的拷贝 数的对数值作图得到绝对定量的标准曲线［6］。 ( 2) 实时荧光定量 PCR 采用 20 μl PCR反应体系( SYBR Premix Ex TaqTM，TaKa- Ra，见表 2) ，反应组分在冰上加入到八联管中 ( MicroAmp Optical 8 － Tube Strip，0． 2 ml，ABI) 并用超净光盖( MicroAm- p Optical 8 － Cap Strip，ABI) 封口。离心混匀后，放入 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪中，条件按试剂盒说明设置，95℃ 30s; 95℃ 5 s，60℃ 34 s ( 40 个循环) ; 95℃ 15 s; 60℃ 60 s; 95℃ 15 s。反应结果使用 ABI 7500 software 和 Excel 软件收 集、分析。所有的样品都在同一块板中做三次重复。数值以 珋x ± s表示。 表 2 实时荧光定量 PCR反应体系 组分 使用量( μl) 终浓度 SYBR Premix Ex TaqTM ( 2 × ) 10 1 × PCR Forward Primer( 10μM ) 0． 4 0． 2μM PCR Reverse Primer( 10μM ) 0． 4 0． 2μM ROX Reference Dye Ⅱ( 50 × ) 0． 4 1 × DNA模板( 50ng /μl) 1． 0 ddH2O( 灭菌双蒸水) 7． 8 Total 20. 0 7．纯合子转基因小鼠的筛选 将 CaMKⅡα － Cre转基因首建者小鼠与野生型 C57BL / 6J小鼠杂交后获得 F1 代小鼠，再将 F1 代 PCR 阳性小鼠相 互交配得到 F2 代小鼠，取 PCR阳性小鼠进行 real － time PCR 鉴定转基因拷贝数。将 F2 代转基因小鼠拷贝数与首建鼠拷 贝数进行比较，筛选出纯合子转基因小鼠。 使用经典遗传育种的方法，将 real － time PCR 鉴定获得 的纯合子转基因小鼠与野生型 C57BL /6J 小鼠交配，至少获 得 3 窝总计不少于 30 只仔鼠。通过 PCR方法鉴定仔鼠基因 型以证明是否为纯合子转基因小鼠。 结 果 1． CaMKⅡα － Cre转基因首建者小鼠及其仔代小鼠基因 型检测 转基因片段 Cre上游为 5． 26kb的小鼠 CaMKⅡα启动子 序列，驱动 Cre在小鼠前脑细胞中特异表达，下游为 HSV TK poly A。显微注射后，我们共得到 CaMKⅡα － Cre 转基因首 建者小鼠 7 只，阳性率为 8． 64%。( 图 1A) 将首建者小鼠分别与野生型 C57BL /6J 小鼠杂交，使用 PCR方法筛选出仔代小鼠中的转基因阳性鼠。( 图 1B) 2．转基因小鼠中 Cre基因的实时荧光定量 PCR检测 ( 1) 绝对定量标准曲线 为了确定 real － time PCR 扩增中 Ct 他值与初始拷贝数 的关系，我们制备了分别含有 1、5、25、125、625 个拷贝的标 准品对照，以 rtcre F /R 扩增转基因片段( 扩增产物 126bp) ， 以 β － actin F /R扩增管家基因 β － actin作为内参( 扩增产物 200bp) ，每个反应重复三次，取平均 Ct 值，将转基因片段检 测引物扩增 Ct( rtcre) 减去相应的 β － actin 基因扩增 Ct( β － actin) ， 得到△Ct，将△Ct 对样品拷贝数的对数 ( log5N) 作图得到改 进的绝对定量标准曲线( 图 2) 。 ·53·中国优生与遗传杂志 2011 年第 19 卷第 2 期 图 1 转基因小鼠构建及 PCR鉴定基因型 A: CaMKⅡα － Cre转基因片段示意图，同时显示基因型鉴定引物 F1 /R1 和 F2 /R2 的相对位置; B: PCR鉴定转基因 小鼠基因型; 1 ～ 6 与 1＇～ 6＇为相同样品; 1、1＇为阳性对照; 2、2＇为阴性对照; 3、3＇为空白对照; 4、4＇为转基因首建者小 鼠; 5、5＇、6、6＇为仔代小鼠; M为 Marker。 本实验实时分析精确度高、重复性好，同一标准品的 3 次重复 Ct 值变化很小( 表 3) ，根据文献报道，一般单个样品 扩增反应 Ct 值的标准偏差小于 0． 3，可以认为能够精确测定 样品的拷贝数［7］。以△Ct 对样品拷贝数的对数( log5N) 作绝 对定量标准曲线，计算公式为: △Ct = － 2． 402log5N ( 拷贝 数) + 8． 654，R2 ( 相关系数) = 0． 9999，引物的扩增效率为 95． 4%，因此可以确定实验结果真实可信。 图 2 A:倍比稀释标准品的 rtCre扩增曲线; B:绝对定量标准曲线 表 3 标准品对照 rtcre扩增 Ct 值 珋x ± s 标准品对照( 拷贝数) rtcre引物荧扩增光阈值 Ct 625 17． 52 ± 0． 10 125 19． 65 ± 0. 07 25 22． 17 ± 0． 10 5 24． 56 ± 0. 09 1 27． 13 ± 0. 02 ( 2) PCR扩增过程中的溶解曲线分析 SYBR GreenⅠ为一种 DNA 双链结合染料，其在 PCR 扩 增中无特异性，因此需进行融解曲线分析来判断 real － time PCR中是否有非特异性条带出现。本实验的两个融解曲线 均在 85℃附近有且只有一个单峰，表明两个引物的特异性 强，在 PCR过程中无非特异性条带出现。 ( 3) 转基因首建者小鼠及其仔代阳性鼠的拷贝数鉴定和 纯合子仔代鼠的筛选 采用 real － time PCR 鉴定转基因小鼠拷贝数的方法，我 们对三只首建者阳性鼠及其仔代阳性鼠进行了检测，三只首 建者小鼠的平均△Ct 值分别为 4． 5、5． 7、6． 1，计算得出转基 因拷贝数分别为 19、7、5。 PCR方法鉴定为阳性的 F2 代小鼠再经 real － time PCR 鉴定转基因拷贝数，将其与首建鼠拷贝数进行比较，三个品 系转基因小鼠均已获得纯合子转基因小鼠。将获得的纯合 子转基因小鼠与野生型 C57BL /6J 小鼠交配，至少 30 只小 鼠，PCR鉴定所产小鼠均为阳性。因此可以证实三个品系转 基因小鼠均成功获得纯合子转基因小鼠。 讨 论 转基因小鼠模型成功建立的首要步骤是外源基因拷贝 数的检测。本实验建立了 SYBR GreenⅠreal － time PCR鉴定 转基因小鼠拷贝数的方法，利用已知起始拷贝数的标准品可 作出标准曲线，通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进 行定量分析，计算出起始拷贝数。 因为 SYBR GreenⅠ荧光染料能结合于所有 DNA 双链， 不能特异性检测某一特定模板，所以引物的高特异性是实验 成功的关键。本实验通过熔解曲线分析对引物扩增的特异 性进行很好的质控，确保实验结果真实可信。此外，我们还 选择了小鼠管家基因 β － actin 作为内参，对基因组 DNA 浓 度进行标化。内参检测引物 β － actinF /R和转基因片段检测 引物 rtCre F /R的扩增片度大小相近，Tm 值基本相同，很好 地发挥了内参的作用。 本实验建立的 SYBR GreenⅠreal － time PCR 设计简单， 仅需要 2 对引物，且能够进行熔解曲线分析检验扩增反应的 特异性，成本低、通用性好。应用此法已准确高效地检测了 转基因小鼠的转基因拷贝数，并获得了纯合子转基因小鼠。 ( 下转第 80 页) ·63· 中国优生与遗传杂志 2011 年第 19 卷第 2 期 产索与受体结合达饱和状态时，再加大剂量效果并不增 加［4］。 卡孕栓系前列腺素 F2a( PGF2a) 衍生物，又叫卡前列腺 甲酯栓，对平滑肌有较强的收缩作用，已广泛用于终止妊娠、 人工流产术及催产、钳刮术、宫腔检查、绝经后取环术前软化 宫颈、扩张宫口，还可用于治疗产后子宫收缩乏力性出血、开 腹术后肠麻痹以及子宫颈癌根治术后膀胱麻痹等［5］。它能 选择性地直接兴奋子宫平滑肌，增强子宫收缩力及收缩频 率，迅速引起子宫强直性收缩，压迫子宫肌层血管而血。其 半衰期为 30min，可持续作用 6h，弥补了催产素半衰期及持 续时间短的缺点，且对其他器官很少产生副作用。因此胎儿 娩出后将卡孕栓放入直肠内增强宫缩，预防产后出血。从解 剖特点来看，直肠粘膜为柱状上皮，粘膜薄，局部吸收药栓的 速度快，起效快，且不被阴道血液冲洗，可更好的保持药效。 建议把药置于距肛门 6 cm以上，不易脱落且粘膜血运丰富， 药物吸收快。在第三产程早期经直肠给药，方便且污染性 少，又能减少口服给药造成的胃肠道反应。本研究观察到产 妇使用卡孕栓前后，心率和血压无明显波动。副反应少对产 妇无不良影响。 本研究结果表明: 卡孕栓直肠用药可缩短第三产程，减 少产后出血量，且直肠用药方法简便，不受任何条件限制，尤 其适用于基层医院，值得临床推广。 参 考 文 献 ［1］乐杰，主编．妇产科学［M］．北京:人民卫生出版社，2001． 244． ［2］乐杰，谢幸，丰有吉．妇产科学［M］． 6 版．北京:人民卫生出版社， 2003． 224． ［3］彭剑丽．一次性计血量产妇纸在产科中的应用［J］． 川北医学院 学报，2007，22( 1) : 33 － 34． ［4］爱明，魏塞梅．缩宫素配伍米索前列醇预防产后出血的临床应用 ［J］．中国妇产科临床杂志，2006，7( 1) : 53 － 58． ［5］倪伟，冷波．卡孕栓不同给药途径预防产后出血临床观察［J］．中 华医学实践杂志，2004，3( 4) : 39． － 40． 收稿日期: 櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀 2010 － 07 － 29 ( 上接第 17 页) ［19］Allen TJ，Mikala G． Effects of temperature on human L － type cardi- ac Ca2 + channels expressed in Xenopus oocytes［J］． Pflugers Arch， 1998，436( 2) : 238 － 247． ［20］Watanabe H，Koopmann 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参 考 文 献 ［1］Ingham DJ，Money S，Hansen G． Quantitative real － time PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants［J］． Bio- techniques，2001，31: 132 － 134，136 － 140． ［2］Weng H B，Pan A H，Yang L T，et al． Estimating number of transgene copies in transgenic rapeseed by real － time PCR assay with HMG I /Y as an endogenous reference gene［J］． Plant Molecular Biology Report- er，2004，22: 289 － 300． ［3］Song P，Cai C，Skokut M，et al． Quantitative real － time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERSTM － derived transgenic maize［J］． Plant Cell Reports，2002，20: 948 － 954． ［4］王育花，赵森，陈芬，等．利用实时荧光定量 PCR法检测转基因水 稻外源基因拷贝数的研究［J］． 生命科学研究，2007，11 ( 4 ) : 301 － 305． ［5］DW SJ． Molecular Cloning A Laboratory Manual［M］． Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York: 2001． ［6］王晓建，杨旭，宋晓东，等．实时荧光定量 PCR法检测转基因小鼠 拷贝数［J］．中国实验动物学报，2007，15( 3) : 170 － 174． ［7］Bubner B，Baldwin IT． Use of real － time PCR for determining copy number and zygosity in transgenic 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