新药的方法学考察

3.方法学考察 新药可以引用药典或文献收载的与其相同成分的测定方法,但因品种不同,与自行建立新方法一样.均要进行方法学考察研究。一般考察项目如下: (1)提取条件的选定优选提取条件对测定结果有直接影响、特别对于制剂中含有药材原粉的,即由组织细胞中提出有关成分,提取方法的选择尤为关键,常见的提取方法有冷浸、热浸回流、索氏提取器提取、超声波提取等,滤除残渣即得提取液。对提取液的取舍一般有两种方法,一种为取全量,即充分洗净残渣,并将洗涤液合并于提取液中;另一种为取一定量,即在提取前精密加入定量溶剂,称重,提取后.再补充提取过程损失的溶剂,摇匀,过滤,精密吸取-定量的提取液.进行含量测定,最后结果按相当的样品量计算,即得。 提取条件的确定,一般要有不同溶剂、不同提取方式、不同时间以及不同温度、PH值等条件比较而定,可参考文献,重点对比某种条件.也可用正交试验全面优选条件,再配合回收率试验或与经典方法比较,从而估计方法的可靠性。 (2)分离纯化根据被测成分的性质,采用一定方法,排除干扰物质,使供试样品达到一定纯净度。特别是气相、液相色谱更应注意此点,以提高分析准确性并可保护色谱柱。 (3)测定条件的选择如比色法、高效液相、薄层扫描法中最大吸收波长的选择,液相色谱法中固定相、流动相、内标物的选择,薄层扫描法层析与扫描条件的选择等。 (4)空白试验在色谱法中常用阴阳对照法,即以被测成分或药材与除去该成分或该药材的成药作对照,可考察被测成分的斑点(或峰)位置是否与干扰组分重迭,以确证测定指标(如吸收度、蜂面积)是否仅为被测成分的响应,防止假阳性的误判。紫外分光光度法或比色法中的空白对照液常见的有溶剂空白、试剂空白(溶剂加显色剂),对复方制剂也须同色谱法做阴性对照.确证吸收度仅为被测成分的响应。对单一成分或大类成分测定,均须做此试验。 (5)样品浓度与响应值样品浓度与吸收度或色谱峰面积(或峰高)之间的线性关系考察、即标准曲线的制备。 紫外分光光度法或比色法须制备标准曲线,用以确定取样量并计算含量。色谱法一般均采用对照品比较法如外标法或内标法测定,但也必须进行线性考察,目的有三:a.确定样品浓度与峰面积或峰高是否呈线性关系;b.确定线性范围,即适用的样品点样或进样量的确定; c.直线是否通过原点,以确定是以一种或二种对照品量(即一点法或二点法)测定并计算。标准曲线相关系数应在0.999以上,薄层扫描法可在0.995以上。 (6)测定方法的稳定性实验此项考察目的是选定最佳的测定时间范围。用紫外分光光度法、比色法或薄层扫描法等测定时,应对被测液或薄层色谱斑点的吸收度值稳定性进行考察,即每隔一定时间测定一次,延续3-4小时,视其是否稳定,以确定适当的测定时间。 (7)精密度试验如气相、液相色谱法对同一供试液多次进样测定,簿层扫描法对同一薄层板及异板多个同量斑点扫描测定,可考察其精密度,对同一薄层斑点连续进行多次测定,则可考察仪器精密度。 (8)重复性试验按拟定的含量测定方法,对同一批样品进行多次测定(平行试验至少5次以上,即n>5),计算相对标准偏差(RSD),一般要求低于5%。同一人测定多次称重复性,不同人或实验室测定称再现性。 (9)检测灵敏度及检测下限的测定,分析方法的灵敏度一般以工作曲线的斜率表示。其值越大.方法的灵敏度就越高。色谱法的灵敏度可以用峰高(mm)/对照品量(mg)表示。最小检出量即检测下限,一般按经验法设计数个不同进样量,以目测估计最小俭出量。有时常把最小检出量理解为灵敏度,实际上两者概念不同。 (10)回收率试验含测方法的建立,多以回收率估计分析的误差和操作过程的损失,以评价方法的可靠性。回收率实验设计也有多种,在中成药分析中常见的有以下几种; ①加样回收,即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品,依法测定。用实测值与原样品中含测成分之差,除以加入纯品量计算回收率。此法不用制备空白对照,模拟真实性好。对单味药材的回收率测定,因不易制备除去被测成分的药材空白对照品,只能用加样回收法,如用提净被测成分的药渣作空白,则意义不大,因为在除去被测成分的同时,干扰成分也被除去了。 在加样回收实验中首先须注意纯品的加人量与取样量中被测成分之和必须在标淮曲线线性关系范围之内;外加纯品的量要适当,过小则引起较大的相对误差,过大则干扰成分相对减少,真实性差。一般加入量与所取样品含量之比控制在1:1左右。 对于加样回收的计算方法,也有用实测值除以理论总量(样品中所含被测成分量与加入纯品旦之和)计算的,但仍以前述计算方法为公认。 ②以成药空白(即除去欲测药材后制成的成药),精密加入被测化学成分纯品,依法测定。以加入纯品量为理论值,由实测值计算回收率。此法理论值较准确,但其不足是缺少成药中被测药材本身的杂质干扰条件,模拟真实性差,特别是被测药材组分复杂,如人参被测成分为人参皂苷Re、因与该成分共存的同系物或类同成分人参皂苷较多,其自身分离度重现性差,而只以加入纯品测定回收率,与人参皂苷Re的干扰情况则无从反映。故此种回收率测定只能用于被测药材成分较为单一者。 ③取成药空白,精密加人已知被测成分含量的药材,依法测定。以加入药材所相当的被测成分量为理论值,再由实测值除以理论值计算回收率。此法模拟真实性好,能反映被测药材中其它成分的干扰情况,但由于已知含量药材也是同法测得的平均值,故其理论值实际包括正负误差在内,有时也能掩盖系统误差。特别是单味原料(药材)制剂,仍以采用加样回收法为宜。回收率试验至少需进行5次试验(n=5),或三组平行试验(n=6),在同一批样品中加入相同或不同纯品量,后者可进一步验证测定方法中取样量多少更为合适。 回收率一般要求在95~105%,一些方法操作步骤繁复,可要求略低至少不小于90%。 4含量测定方法实验设计中应注意的几个问 (1)提取问题对含药材原粉的制剂,如采用取部分提取液的测定方法,不宜将样品粉末直接置容量瓶中定容,因为中药含量测定的取样量往往较大,且药粉不溶于水,其固体体积不可忽视。例如将0.5g九分散于10m1容量瓶中,以刻度吸管加入溶剂约7mL即已至量瓶刻度。可将样品称人具塞锥形瓶中,精密加入溶剂10m1计算全量。 (2)测定大类成分如总黄酮、总皂苷等问题 ①如所测总成分以某一单体成分为对照品制定标推曲线并计算,应首先考虑对照品溶液与供试品溶液最大吸收波长是否一致,有的相差很大或供试品溶液根本无最大吸收,方法则不能成立。 ②阴性(空白)对照液即除去欲测成分的药材原料制备的样品液,依法测定其吸收图谱,与基线吻合,或略有吸收,在无其它方法可循的情况下,其吸收值若低至样品吸收值5%以下可忽略不计。因考察中药多为天然药物,含量幅度较大,又为大复方,不可认为无吸收峰即视为无干扰。 ③按上述方法制备背景空白以消除干扰是不可行的。例如样品吸收值为0.6,而阴性对照液吸收值为0.2,即以0.6一0.2=0.4计算样品含量。由于处方原料不相同,工艺未知,配制出的背景空白不可能条件相同,吸收值差异较大,故此方法无推广价值。只有在原料来源不变,工艺稳定的情况下作为企业内部的质控方法暂时使用。 ④为了消除其它组分干扰,采用导数光谱或二波长,三波长等方法测定单一或大类成分,仅可用于药味较少的制剂,其空白试验取多批次样品测定,结果一致才可采用。因中药复方与西药不同,后者所谓干扰组分均为结构已知具有一定规格的成分,而中药则大部为未知成分且不衡定,有些测定只有一次性的意义,不具重现性。 (3)回收率测定问题在一些实验设计中,常见到所谓的加样回收测定,不是在称样开始时即加入纯品,而是将其加至制备好的供试品溶液中,这样不能考察提取、纯化过程中被测成分是否损失;也有在薄层扫描试验中,于薄层板上依次点对照品溶液、供试品溶液及对照品与供试品重叠点于同一原点上,测定后计算,这只能反映板上的回收率,而不能代表全部含量测定方法的回收率。 (4)对照品问题含量测定用对照品只能用化学纯品,不可用药材对照品,因为不可能得到所含成分含量同一的样品。 测定大类成分如皂苷也不宜采用总皂苷为对照品,因总皂苷组分复杂,各成分比例不稳定,不同批次的皂苷难于保持一致,从而使含量测定结果不稳定。测定总皂苷时,采用同系物之一的化学单体并以其计算,定出限度是可行的。如测定人参总皂苷,以人参皂苷Rbl、Re等作对照品并计算。但如处方中含有的不同药味皂苷成分结构差异较大,有的甚至不是皂苷而是其它各种苷类,例如处方中有黄芪、人参、地黄、知母、赤芍等,而以黄芪甲苷或人参皂苷Re为对照品测定并计算含量,科学根据不足,不能成立。 5含量限度的制定 含量限度是在检验方法确定的基础上,积累足够的数据后总结提出的。成药的合格是建立在药材原料的质量保证上的。日本对栽培药材常收集上百件样品进行测定,对结果做分布分析,有的下限取在去除约5%样品的数值上,即将占总量5%的质量最差、分布极小的样品判为不合格。我国则根据宝贵的传统鉴别经验,将药材样品依质量优劣顺序排列,如所测成分含量高低与之相应,则将质次但仍可药用者取为下限。必须强调的是,含量限度的制定应有足够的、具代表性的样品数据为基础。否则就不能反映实际情况,实践中势必会遇到种种问题。新药申报生产时应积累10批以上的含量数据,提出限度。 中药制剂含量限度规定的方式,根据现行各级标准有以下几种。一种是规定下限,如药典中收载戊己九,对所测成分如黄连中总生物碱以盐酸小劈碱计不得少于3.0%,六味地黄丸,山茱萸中熊果酸、丹皮中丹皮酚分别为不得少于0.020%、0.070%(大蜜九);一种是规定幅度,如部颁标推进口西洋参药材含人参总皂为5~10%,含西洋参制剂则应根据处方量及工艺制相关数值规定制剂含量幅度;另一种为规定标示量,如2005版药典中收载华山参片,规格为0.12mg/片,规定含生物碱以其莨菪碱计应为标示量的80.0~120.0%。 应该强调指出中成药与某些制剂不同,如甘草流浸膏类可根据甘草酸的含量调节甘草浸膏的投料量,而中药则必须保证处方不变,成品率稳定。因此只有投入合格的原料才能保证成药的质量。 关于中成药的含量表示方法,有%、mg/片、g/丸、mg/m1(液体制剂)等。凡药品中规定有含量测定项的,其原料药材必须对成品中所测成分规定含量限度,防止盲目投料,可限定为本制剂专用的原料药材规格,暂不要求代表全国各地药材的质量,达不到要求者可以不进货,不投料,以保证产品质量。 六、质量标准起草说明 起草说明是质量标淮制定的详尽的技术资料。对质量标准中各项均应作逐项说明。名称、处方、制法、功能主治、用法用量等,在申报资料中各有要求,故在起草说明中可以简要概述,但不可从略。而有关检定该药真伪优劣各项均应重点详细说明。 对鉴别、含量测定药味各测定成分的选择依据,方法原理,实验条件的选择和方法学考察资料和数据,空白试验说明杂质干扰及排除情况,附有关图谱如最大吸收波长选择图、标准曲线图,色谱图包括空白试验图,薄层色谱附彩色照片,显示色谱的真实性。 阐明确定检查及含量限(幅)度的意义和依据。新药申报生产或标准试行期满转为部颁标准前至少应有10批以上产品的测定数据。 值得强调的是,应阐明其它曾经做过的试验,包括不成熟的尚待完善或失败、暂末收载或不能收载于正文的检定方法的理由,并提供详尽的实验资料,以便有关部门审查其实验设计是否合理,以确定为主观原因或客观原因,从而判定是否需要作进一步实验的依据。 起草说明的写格式应按质量标准项目依次予以说明,其与研究不同,不能以综述性讨论代替。