茵栀黄注射液对体外四氯化碳致肝细胞损伤的保护作用

［收稿日期］ 20100628(005) ［基金项目］ 国家自然科学基金项目(30701109) ［第一作者］ 任永申，博士，主要从事临床中药学研究工作，E- mail:godreny@ 163. com。 ［通讯作者］ * 肖小河，Tel:010-66933322，Fax:010-63879915， E-mail:pharmacy302@ 126. com * 张萍，Tel:010-66933322，Fax:010-63879915，E- mail:zhp1231@ 126. com 茵栀黄注射液对体外四氯化碳致肝细胞损伤的保护作用 任永申1，2，张萍1* ，鄢丹1，段慧娟1，李正明1，肖小河1* (1. 解放军三○二医院 中西医结合肝病诊疗与研究中心，北京 100039; 2.成都中医药大学 药学院，成都 610075) ［摘要］ 目的:研究茵栀黄注射液对四氯化碳(CCl4)所致大鼠肝细胞损伤的保护作用。方法:采用 CCl4 熏蒸法造成体外 肝细胞损伤模型，观察不同厂家生产的茵栀黄注射液与复方茵陈注射液及其有效成分黄芩苷及香豆素的保护作用。结果:各 厂家生产的茵栀黄注射液均能能显著降低丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及丙二醛(MDA)的含量，提高谷胱甘 肽-过氧化物酶(GSH-Px)的活性，降酶作用以复方茵陈注射液样品的作用最强。结论:茵栀黄注射液及其主要有效成分黄芩苷 及香豆素对 CCl4 所致大鼠肝细胞损伤具有保护作用，各厂家正常样品药效作用具有较好的一致性。 ［关键词］ 茵栀黄注射液;复方茵陈注射液;四氯化碳;肝细胞损伤;保护作用 ［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2010)18-0115-04 Study on Protective Effect of Yinzhihuang Injection on Hepatic Cell Damage Caused by Carbon Tetrachloride in vitro REN Yong-shen1，2，ZHANG Ping1* ，YAN Dan1，DUAN Hui-juan1，LI Zheng-ming1，XIAO Xiao-he1* (1. China Military Institute of Chinese Materia Medica，302 Military Hospital，Beijing 100039，China; 2. Pharmacy College，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China) ［Abstract］ Objective:To study the protective effect of Yinzhihuang Injection on hepatic cell damage caused by Carbon tetrachloride (CCl4)in vitro. Method:CCl4 fumigation method was adopted to duplicate hepatic cell damage in vitro，and the protective effect of Yinzhihuang Injection and Fufang Yinchen Injection and their main active ingredients，baicalin and coumarin，from different companies were investigated. Result:The ALT，AST and MDA of damaged cells could be decreased and GSH-Px could be elevated by Yinzhihuang Injections from different factories，and the strongest protective effect was originated by Fufang Yinchen Injection. Conclusion:Both Yinzhihuang Injection and their main active ingredients，baicalin and coumarin，could prevent the hepatic cell damage caused by CCl4 in vitro，and the protective effect of normal samples from different companies had good consistency agreed with each other. ［Key words］ Yinzhihuang Injection;Fufang Yinchen Injection;carbon tetrachloride(CCl4);hepatic cell damage;protective effect 茵栀黄注射液(Yinzhihuang Injection)是根据传 统中医药理论和现代制药技术由茵陈蒿汤研制而成 的中药注射剂，其前身是解放军第 302 医院研制开 发的复方茵陈注射液 (6912 注射液)，由茵陈 Artemisia capillaries Thumb，栀子 Gardenia jasminoides Euis，黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi 及金银花 Lonicera japonica Thumb 4 味中药经提取制成，主要 功效为清热、解毒、利胆、退黄，具有清热、解毒、抗 ·511· 第 16 卷第 18 期 2010 年 12 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 16，No. 18 Dec.，2010 菌、消炎、解痉、利胆、退黄、降酶、利尿、抗病原微生 物、增强机体免疫功能、保肝和抗肝纤维化等药理作 用［1-4］，常用于治疗肝胆湿热、小便黄赤、急慢性肝炎 等病症［5-6］，其临床应用广泛且疗效显著［7-8］。 茵栀黄注射液临床常用于新生儿黄疸及急性黄 疸型肝炎等，为临床常用的中药注射剂品种，生产厂 家较多，产品质量不一，质控水平较低(仅以黄芩苷 含量测定作为控制指标)，为临床应用带来一定的混 乱和风险，特别是近年来频现的中药注射剂不良反 应，更引起人们对茵栀黄注射液安全性和有效性的 关注。为体现茵栀黄注射液生市场主要供应厂家产 品质量的一致性和差异性，本文以体外评价其抗肝 损伤作用的一致性为切入点，以黄芩苷和香豆素为 对照，考察了 5 批不同厂家生产的茵栀黄注射液及 复方茵陈注射液对四氯化碳(CCl4)所致大鼠肝细胞 损伤的影响，结果报道如下。 1 材料 1. 1 药物 石家庄神威药业茵栀黄注射液(批号 07040341，SW);山西太行药业茵栀黄注射液(批号 070502，TH);北京双鹤药业茵栀黄注射液(批号 070414，SH);解放军第 302 医院医院制剂复方茵陈 注射液(批号 070620，FF);石家庄神威药业茵栀黄 注射液高温加速样品(批号 SW07040341，于 60 ℃高 温环境保存 7 d，GW);黄芩苷对照品(baicalin)和香 豆素对照品(coumarin)由中国药品生物制品检定所 提供。 1. 2 试剂 DMEM 培养基(批号 12800082)，优级 胎牛 血 清 (批 号 16000044)，胰 蛋 白 酶 (批 号 25200056)，美国 Gibco 公司;Ⅱ型胶原酶(批号 9001121)，美国 Sigma 公司;四氯化碳(CCl4)，北京 化工厂生产。谷丙转氨酶 (ALT)，谷草转氨酶 (AST)，丙二醛 (MDA)，谷胱甘肽-过氧化物酶 (GSH-Px)测试盒，南京建成生物工程研究所提供 (批号均为 20090618)。 1. 3 动物 SD 大鼠，SPF 级，军事医学科学院实验 动物中心提供，动物合格证号 SCXK(军)2008-0001。 2 方法 2. 1 大鼠原代肝细胞的制备与培养 采用在体灌流方法制备与培养大鼠原代肝细 胞［9］。将大鼠以 10% 乌拉坦麻醉，门静脉插管，先 以无钙灌流液冲洗肝脏，再以Ⅳ型胶原酶灌流液消 化肝组织间质，将肝细胞分散入平皿内，以 D-Hanks 液吹打清洗过滤肝细胞，以 DMEM 培养基(含 10% 胎牛血清，10 000 U 青霉素，100 U 链霉素)制成 1 × 109 cell / L 肝细胞悬液。分离的肝细胞经 0. 6%台盼 蓝拒染法测得细胞活力大于 90%，高碘酸雪夫反应 显示糖原法鉴定 99% 为肝实质细胞。将上述肝细 胞混悬液加入 24 孔板中，每孔 1 mL，将装有细胞混 悬液的细胞培养板放入 37 ℃含 5% CO2 的恒温孵 箱中培养 24 h，更换培养基。 2. 2 各茵栀黄注射液样品对 CCl4 所致大鼠肝细胞 损伤的影响 取一块 24 孔板，各孔中加入 1 × 109 /mL 的单细 胞混悬液，每孔 1. 1 mL，将细胞培养板放入 37 ℃含 5% CO2 的恒温孵箱中培养 24 h，更换培养基后继 续培养 24 h，吸取上清液检测 ALT，AST 含量，MDA 和 GSH-Px 的活性，作为空白对照。 另取两块 24 孔板，各孔中加入 1 × 109 /mL 的单 细胞混悬液 1 mL，以 6 孔为 1 组，设置以下组别:① 分别加入上述 4 种茵栀黄注射液样品(SW，SH，TH， FF，GW)各 100 μL，使各注射液样品的终浓度分别 为 0. 1 g·mL － 1，作为供试品组;②分别加入 100 μL 以培养基溶解的黄芩苷对照品(baicalin)和香豆素 对照品(coumarin)，使终质量浓度分别为2 g·L － 1与 1 g·L － 1，作为对照品组;③每孔加入 100 μL 培养 基，作为模型对照组。将上述细胞培养板放入 37 ℃ 含 5% CO2 的恒温孵箱中培养 24 h 后，置密闭塑料 盒中，内置 0. 4 mol·L － 1(体积)的 CCl4，37 ℃温孵 90 min，造成肝细胞损伤模型。更换培养基后继续培养 24 h，吸取上清液，检测 ALT，AST 含量，MDA 和 GSH-Px 的活性，评价肝细胞的损伤程度。 3 结果 采用分光光度法，测定各板各孔细胞培养液上 清液 ALT，AST 含量，MDA 和 GSH-Px 的活性，结果 见表 1。结果表明:①与空白对照组比较，模型组 ALT，AST 及 MDA 显著升高(P < 0. 01)，而 GSH-Px 活性则显著下降，表明 CCl4 熏蒸法所复制的肝细胞 损伤模型成功;② 与模型对照组比较，神威(SW)、 太行(TH)及双鹤(SH)药业生产的茵栀黄注射液样 品能显著降低 ALT，AST，MDA 的含量，提高 GSH-Px 的活性(P < 0. 01 或 P < 0. 05)，降酶作用以复方茵 陈注射液样品 (FF)作用最强，显著优于其他注射 液样品;③与同批正常样品相比较，神威高温加速试 验样品(GW)的保肝降酶活性显著降低(P < 0. 05); ·611· 第 16 卷第 18 期 2010 年 12 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 16，No. 18 Dec.，2010 ④ 与茵栀黄注射剂样品中等含量［5］的黄芩苷 (baicalin)及香豆素 (coumarin)对照品溶液也能显 著降低转氨酶及 MDA 的含量(P < 0. 01 或 P < 0. 05)，并显著提高 GSH-Px 的活性(P < 0. 05)。 表 1 各茵栀黄注射液样品对 CCl4 致大鼠原代肝细胞 损伤的影响(珔x ± s，n = 6) 组别 剂量 / g· L － 1 ALT /U·L － 1 AST /U·L － 1 MDA /μmol·L － 1 GSH-Px /μmol·L － 1 空白对照 － 7. 57 ± 1. 14 97. 25 ± 21. 027 5. 47 ± 1. 16 134. 33 ± 26. 43 模型 － 20. 44 ± 1. 75 218. 52 ± 18. 655 10. 60 ± 1. 88 81. 59 ± 22. 06 SW 100 10. 15 ± 1. 842) 146. 48 ± 21. 971) 8. 68 ± 1. 38 188. 57 ± 38. 922) TH 100 9. 40 ± 1. 122) 86. 11 ± 14. 002) 7. 83 ± 0. 151) 207. 94 ± 10. 492) SH 100 10. 27 ± 0. 052) 120. 45 ± 6. 332) 8. 23 ± 0. 531) 224. 76 ± 3. 432) FF 100 6. 49 ± 0. 862) 117. 30 ± 0. 272) 6. 50 ± 1. 322) 122. 22 ± 53. 421) GW 100 12. 40 ± 2. 02 1)191. 34 ± 17. 791) 9. 49 ± 0. 89 184. 45 ± 25. 722) 黄芩苷 2 18. 56 ± 1. 77 146. 02 ± 2. 021) 4. 02 ± 0. 592) 133. 02 ± 23. 411) 香豆素 1 5. 32 ± 0. 152) 116. 76 ± 3. 522) 4. 53 ± 0. 392) 112. 70 ± 13. 881) 注:与模型对照组比较1)P < 0. 05，2)P < 0. 01。 4 讨论 肝细胞是肝脏中数目最丰富和最主要的细胞， 也是各种活性氧(reactive oxygen species，ROS)攻击 的主要目标，氧自由基的损伤作用是肝炎发生的重 要机制之一。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自 由 基，能 攻 击 生 物 膜 中 的 多 不 饱 和 脂 肪 酸 (polyunsaturated fatty acid，PUFA)引发脂质过氧化 反应，生成的脂质过氧化物如:MDA、氢过氧基以及 新的氧自由基等，脂质过氧化作用不仅把活性氧转 化成活性化学剂即非自由基性的脂类分解产物，而 且通过链式或链式支链式反应放大活性氧作用。一 般认为［10］，四氯化碳造成肝损伤是 CC14 进入肝细 胞后，由于脂质过氧化使肝细胞膜脂质溶解，致使肝 细胞变性、坏死。肝细胞膜在受损伤的同时可产生 大量新的活性氧基团，促发脂质过氧化的链式反应， 因此而产生的脂质过氧化物可以损伤肝脏中的各种 细胞，故肝细胞膜的脂质过氧化是肝细胞损伤时的 主要作用机制之一。因而测试 MDA 的含量可反映 体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程 度。 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛 存在的一种重要的过氧化物分解的酶，它特异地催 化还原型谷胱甘肽(GSH)对氢过氧化物的还原反 应，一般认为它在细胞内能清除有害的过氧化物代 谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，从而起到保护细 胞膜结构和功能完整的作用;因而，GSH-Px 活力可 以衡量机体抗氧化水平。本文则通过对上述指标的 考察，反映不同厂家茵栀黄注射液及其主要药效组 分的主要药效学差异，并用于产品的品质的客观评 价与质量控制。 研究结果表明，茵栀黄注射液及复方茵陈注射 液均具有体外抗 CCl4 致大鼠肝细胞损伤的作用，并 以复方茵陈注射液作用最强;不同厂家茵栀黄注射 液的体外抗肝损伤作用基本一致，提示各主要厂家 产品药效作用具有较好的一致性;高温加速样品(为 研究目的特制变质样品)体外抗肝损伤作用显著降 低，提示高温对产品质量影响较为明显，同时产品质 量的改变可显著影响产品药效作用的发挥，并可能 导致产品临床使用风险的提升，提示茵栀黄注射液 易受保存环境影响，故需要建立合理的临床使用规 范与保存环境。 茵栀黄注射液中，茵陈的主要有效成分为香豆 素(coumarin)，黄芩的主要有效成分为黄芩苷 (baicalin)，本研究结果表明，黄芩苷组、香豆素组和 茵栀黄注射液组均能降低血清 ALT，AST，可以有效 降低肝组织匀浆的 MDA 含量;同时，与等剂量的茵 栀黄注射液样品相比，黄芩苷与香豆素降低转氨酶 及 MDA 含量、升高 GSH-Px 活力的能力较茵栀黄正 常样品低，提示中药复方注射剂(茵栀黄注射液)保 肝降酶、抗肝细胞损伤药效作用较单体成分更强，并 表现出良好的协同增效作用。 可以推测，降低转氨酶、抗脂质过氧化，防止过 氧化损伤，减少过氧化脂质的生成等可能是茵栀黄 注射液及其主要成分黄芩苷、香豆素等抗 CCl4 致肝 细胞损伤作用机制的重要方面。综上所述，茵栀黄 注射液对 CC14 所致大鼠肝细胞损伤的保护作用，可 能与该注射液的有效成分黄芩苷及香豆素有关，具 体的作用机制，有待进一步研究阐明。 ［参考文献］ ［1 ］ 陈辉扬，陈军，温平康 . 茵栀黄注射液的药理作用与 临床应用评价［J］. 药品评价，2005，2(2):122. ［2 ］ 邹堂斌，刘娟 . 茵栀黄注射液对鸭疫里默氏菌的抑 制及抗氧化作用试验［J］. 中国兽医杂志，2008，44 (8):58. (下转第 121 页) ·711· 第 16 卷第 18 期 2010 年 12 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 16，No. 18 Dec.，2010 Kangjs［5-6］等的研究结果一致，也与 Wilder J 等［7］研 究显示的雌激素诱发子宫内膜癌可能与其下调 ERα 基因转录有关相一致。而二仙汤、淫羊藿、仙茅可明 显上调 ERα 和 ERβ 在子宫组织中的表达。由此，我 们推测二仙汤对大鼠生殖器官的影响不同于己烯雌 酚，在子宫形态上则表现为子宫内膜厚度和上皮细 胞的高度无明显改变，提示二仙汤对子宫内膜组织 无雌激素样促增殖作用。 综上所述，二仙汤可以通过雌激素受体直接作 用于雌激素的靶器官—子宫，发挥植物雌激素样作 用，为临床用于治疗与雌激素水平相关的疾病提供 一定的理论指导。但详细理解其与雌激素受体之间 是如何相互影响还有待进一步阐明。 ［参考文献］ ［1］ 徐叔云，卞如濂，陈修 . 药理实验方法学［M］. 北京:人 民卫生出版社，1994:178. ［2］ Jefferson W N，Elizabeth P B，Clark G，et al. Assessing estrogenic activity of phytochemicals using transcrittional activation and immature mouse utero- trophic responses ［J］. Chromatography B，2002，777:179. ［3］ 廖柏松，胡燕，鞠躬，等 . 二仙汤对 18 月龄雌性大鼠下 丘脑-垂体-卵巢轴功能的调节［J］. 山东中医学院学 报，1996，20(6):396. ［4］ Shelby M D，Newbold R R，Tully D B，et al. Assessing environmental chemicals for estrogenicity using a combination of in vitro and in vivo assays ［J］. 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