药学毕业论文一种复配型玛咖保健品对小鼠免疫功能的影响

药学毕业一种复配型玛咖保健品对小鼠免疫功能的影响 X X 大学 毕业论文 一种复配型玛咖保健品对小鼠免疫功能的影响 姓 名:__________ 2014年6月25日 一种复配型玛咖保健品对小鼠免疫功能的影响 作者:金文闻，张永忠，敖明章，余龙江 【摘要】 目的 探讨一种添加了西洋参总皂苷的玛咖保健品对小鼠细胞免疫 功能、体液免疫功能、巨噬细胞吞噬功能以及NK细胞活性的影响。 实验 组小鼠每日分别灌胃高、中、低剂量的复配玛咖根干粉，连续30天，然后分别 进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、小鼠半数溶血值(HC50)测定、小 鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和NK细胞活性测定。结果 与对照组比较， 各剂量组均能提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力、小鼠巨噬细胞吞噬能力 和小鼠NK细胞活性(P,0.05 或 P,0.01)，在中、高剂量组能提高小鼠的半数 溶血值(P,0.01)。结论 复配玛咖根干粉对小鼠各项免疫功能指标均有显著提 高作用，可见该复配型玛咖保健品具有增强免疫力的功效。 【关键词】 玛咖;免疫功能;保健品 【Abstract】 Objective To evaluate the effects of a Maca healthy product compounded with ginsenosides on cell-mediated immune function，humoral immune function，macrophage phago-function and NKC activity of mice.Methods Mice in the treatment group were perfused by the test compound in three different dose (high: 1.000 g/kg BW;medium:0.200 g/kg BW;low:0.020 g/kg BW) continuously for 30 days，then the research on the experiments on immune regulation，including ConA-induced lymphocyte transformation test total hemolytic complement assay (HC50 assay)，peritoneal macrophage phago-function mensuration and NKC activity assay were taken.Results In comparison with control group，the lymphocyte transformation rate，the ability of phagocytosis and the NKC activity significantly increased in the treatment group in all dose (P,0.05 or P,0.01)， and the HC50 value significantly increased in high and medium dose (P,0.01).Conclusion Powdered Maca root compounded with ginsenosides could significantly improve the immune function of mice，and the compounded Maca healthy product possessed the effects in enhancing the immunity. 【Key words】 Maca (Lepidium meyenii.);immune function;healthy product 玛咖(Maca， Lepidium meyenii.Walp)为十字花科独行菜属的一年生或两年生草本植物，原产于秘鲁海拔3500米以上的安第斯山区。数千年来玛咖根作为食物、草药被广泛用于增强精力，抗疲劳，提高生育力，治疗女性更年期综合征，抗抑郁和抗贫血等,1,3,，近十年更在国际上被开发成多种保健食品，受到全球保健人士的青睐,4,。我国也在3年前引入了玛咖保健品，但目前产品功能单一，与国际上产品在功效上有比较大差距。国际上已经流行将玛咖根粉进行浓缩或者进行复配，这不仅提高了玛咖保健品的功效，更赋予“Maca”这一国际知名品牌产品更多的适用范围，例如将玛咖与鹿茸、银杏提取物等天然产品复配后得到的产品，均得到国际消费者的喜爱。 玛咖具有显著的增强精力和抗疲劳作用,5,，而它虽然具有“适应原”样作用，但免疫调节作用并不显著,4,。鉴于抗疲劳和免疫调节具有密切联系,6,，添加合适比例的具有增强免疫力作用的天然植物提取物将可能使玛咖保健品具有抗疲劳和增强免疫力双重作用。我们将药食两用植物西洋参(Panax quinquefolium L.)的功效成分——西洋参总皂苷按照合适的比例添加到玛咖根干粉中，以此为原料制备成一种复配型玛咖保健食品。本文就是通过实验对该产品在小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞吞噬功能以及NK细胞活性等方面的影响进行考察，从而评价其在增强免疫力方面的功效。 1 与方法 1.1 材料 玛咖根干粉是由秘鲁利马AGRO NATURALES S.R.L.于2004年9月提供;西洋参总皂苷粉是由中国广东省深圳思味特科技有限公司于2004年10月提供，含西洋参总皂苷?80%。玛咖根干粉和西洋参总皂苷粉按照重量比 93:7进行均匀混合，制备成复配型玛咖根干粉。常温保存，供实验用。 1.2 实验动物及受试方式 实验动物选用BALB/C清洁级雌性小鼠120只，体重18,22g，均由湖北省实验动物中心提供。将小鼠随机均分为8组，其中4组为免疫?组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定;另4组为免疫?组，进行小鼠半数溶血值(HC50)测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。 参考国内外玛咖根干粉和西洋参总皂苷的食用量，初步本次实验的剂量为每日0.200 g/kg BW，上下再各设1个剂量组1.000g/kg BW 和0.020g/kg BW。因此免疫?组和?组各自的4组小鼠分别对应高、中、低3个剂量组和对照组。样品用蒸馏水配置，对照组以蒸馏水代替受试物。每日灌胃1次，每次20ml/kg BW，连续30天后测定各项指标。 1.3 实验方法 1.3.1 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验,7, 小鼠颈椎脱臼处死后，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液。用Hank’s液洗3次，每次1000rpm离心(德国CHRiST冷冻离心机)10min。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中，计数活细胞数，调整细胞浓度为2×106个/ml。将细胞悬液分2孔加入24孔培养板中，每孔1ml，在其中1孔加50μl ConA液(相当于5μg/ml)，另1孔作为对照，置5% CF-autoflow型CO2细胞培养箱(美国NuAir Inc.)中，37?培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5 mg/ml)50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到酶标微孔板中，每孔做3个平行孔，用?960型全自动酶标仪(美国Metertech Inc.)，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增值能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值示。 1.3.2 半数溶血值(HC50)的测定,8，9, 取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2%(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC 0.2ml进行免疫。5天后，小鼠摘眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为400倍，取1ml置试管内，依次加入10%(v/v，用SA缓冲液配制)压积SRBC 0.5ml，补体1ml(用SA缓冲液按1:10稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37 ?恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000rpm离心10min，取上清1ml，加都氏试剂3ml。同时取10%(v/v，用SA缓冲液配制)压积SRBC 0.25ml，加都氏试剂至4ml于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算: HC50=样品光密度值〖〗SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数(400) 1.3.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验,8，9, 小鼠颈椎脱臼处死后，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液4ml/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开1个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2ml于试管内。用1ml加样器吸取腹腔洗液0.5ml加入盛有0.5ml 1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器(装大针头)吸取0.5ml混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37?孵育15min。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40倍显微镜计数吞噬率和吞噬指数。 吞噬率%=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 计数的巨噬细胞数×100 吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数 计数的巨噬细胞数 1.3.4 NK细胞活性的测定,8，9, 实验前24h将靶细胞YAC-1进行传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗3次，1500rpm离心10min，在用2ml含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液重悬，用台酚兰染色计数(活细胞数应在95%以上)，调整细胞浓度为2×107个/ml，使效靶比为50:1。取靶细胞和效应细胞各100μl，加入U形96孔培养板中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5% Triton各100μl;上述各项均设3个平行孔，37?，5%CO2培养箱中培养4h，将96孔板以1500rpm离心5min，每孔吸取上清100μl置酶标板中，加入LDH基质液100μl，反应10min，然后每孔加入1mol的HCl溶液30μl终止反应，在酶标仪490nm处测OD值，NK细胞活性按下式计算: NK%=反应孔OD-自然释放孔OD 最大释放孔OD-自然释放孔OD×100 1.4 实验数据统计 采用Origin统计软件对实验结果进行单因素方差分析和多个实验组与1个对照组间均数的两两比较方法进行统计学处理，实验数据结果采用x?s表示，差异显著性通过P值判定。 2 结果 2.1 受试物对小鼠细胞免疫功能的影响 见表1。 表1 复配型玛咖根干粉对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力的影响 (x?s，n=15)剂量组 注:与对照组相比，**P,0.01 经口给予小鼠不同剂量的复配型玛咖根干粉30天，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力检测，通过表1的实验结果和统计数据可以发现，各剂量组与对照组比较，差异均有非常显著性(P,0.01)。即复配型玛咖根干粉在各剂量组均能提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力。 2.2 受试物对小鼠体液免疫功能的影响 见表2。 表2 复配型玛咖根干粉对小鼠半数溶血值(HC50)的影响 (x?s，n=15) 注:与对照组相比，**P,0.01 经口给予小鼠不同剂量的复配型玛咖根干粉30天，进行血清溶血素水平检测，通过表2的实验结果和统计数据可以发现，中、高剂量组与对照组比较，差异均有非常显著性(P,0.01)，低剂量组与对照组比较虽然HC50值略有提高，但差异无显著性。即复配型玛咖根干粉在中、高剂量组均能提高小鼠半数溶血值(HC50)，具有增强小鼠体液免疫功能的作用。 2.3 受试物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 见表3、4。 表3 复配型玛咖根干粉对小鼠巨噬细胞鸡红细胞吞噬率的影响 (x?s，n=15) 注:与对照组相比，*P,0.05，**P,0.01 表4 复配型玛咖根干粉对小鼠巨噬细胞鸡红细胞 注:与对照组相比，*P,0.05 经口给予小鼠不同剂量的复配型玛咖根干粉30天，进行小鼠巨噬细胞鸡红细胞吞噬率和吞噬指数的检测，通过表3、4的实验结果和统计数据可以发现，受试物对吞噬率影响较大，中、高剂量组与对照组比较，差异均有极显著性(P,0.01)，低剂量组差异也有显著性(P,0.05);受试物对吞噬指数影响较小，低剂量组与对照组比较没有显著差异，中、高剂量组则有显著差异。但总体看，复配型玛咖根干粉在各剂量组均具有增强小鼠巨噬细胞吞噬功能的作用。 2.4 受试物对小鼠NK细胞活性的影响 见表5。 表5 复配型玛咖根干粉对小鼠NK细胞活性的影响 (x?s，n=15) 注:与对照组相比，**P,0.01 经口给予小鼠不同剂量的复配型玛咖根干粉30天，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力检测，通过表1的实验结果和统计数据可以发现，各剂量组与对照组比较，差异均有非常显著性(P,0.01)。即复配型玛咖根干粉在各剂量组均能提高小鼠NK细胞活性。 3 结论 T细胞在体外受到非特异性有丝分裂原如ConA的作用后能转化、增殖为淋巴母细胞，其转化率可以反映机体的细胞免疫功能;而半数溶血值的测定反映了B细胞的增殖分化以及与补体结合后向体液中分泌溶血素的能力，溶血素是特异性抗羊红细胞抗体，可用于评价受试物对机体的体液免疫功能;巨噬细胞能非特异性的吞噬多种抗原，故测定巨噬细胞吞噬功能可反映机体非特异性免疫功能的强弱;NK细胞在抗病毒感染中具有重要作用，对NK细胞活性的测定也反映了机体对多种肿瘤和病毒感染的靶细胞的杀伤能力。 本文通过以上免疫学实验方法对一种含有西洋参总皂苷的复配型玛咖根干粉进行了免疫功能评价，实验结果表明:该复配型玛咖根干粉对小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞吞噬功能以及NK细胞活性均有提高作用，它可以协同ConA增强小鼠脾T细胞产生淋巴因子的能力，明显增强小鼠脾NK细胞活性，而且增强免疫的功效在一定范围内随着剂量增大有增强作用，有一定剂量关系，因此考虑高、中、低剂量组在4项免疫功能评价中的表现以及原料的成本 等，0.200g/kg BW剂量组为最佳，而对于开发用于增强人体免疫力的保健品则采用0.020g/kg BW左右的剂量比较合适。以此剂量和原料制备的复配型玛咖保健品不仅能发挥玛咖根干粉的抗疲劳作用，也具有增强免疫力的保健功效，其作用机理可能是一方面通过西洋参总皂苷的免疫调节作用，另一方面也与玛咖根干粉中丰富的营养素有关系，例如氨基酸和锌等，适量的补充这些物质都具有促进机体的免疫能力的作用。这种复配型保健产品中的成分对机体的相互作用关系非常复杂，进一步探讨其保健功效和作用机制还需继续深入研究。 【参考文献】 1 Quirós CF， Cárdenas RA，Hermann M，et al.Andean roots and tubers:ahipa，arracacha， maca and yacón.Rome (Italy). 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