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兔眼虹膜色素上皮细胞自体视网膜下移植的研究

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兔眼虹膜色素上皮细胞自体视网膜下移植的研究兔眼虹膜色素上皮细胞自体视网膜下移植的研究 兔眼虹膜色素上皮细胞自体视网膜下移植 的研究 眼科研究2007年11月第25卷第11期?823? ? 实验研究? 兔眼虹膜色素上皮细胞白体视网膜下移植的研究 陈艳罗敏张健 Experimentalstudyontransplantati0n cellintorabbitsubretinaspace ofautologousirispigmentepithelial ChenYah,LuoMin,ZhangJian.DepartmentofOphthalmology...
兔眼虹膜色素上皮细胞自体视网膜下移植的研究
兔眼虹膜色素上皮细胞自体视网膜下移植的研究 兔眼虹膜色素上皮细胞自体视网膜下移植 的研究 眼科研究2007年11月第25卷第11期?823? ? 实验研究? 兔眼虹膜色素上皮细胞白体视网膜下移植的研究 陈艳罗敏张健 Experimentalstudyontransplantati0n cellintorabbitsubretinaspace ofautologousirispigmentepithelial ChenYah,LuoMin,ZhangJian.DepartmentofOphthalmology,ShanghaiNinthPeople’SHospital,Shanghai JiaotongUniversity,Shanghai20001J,China Abstract0bjectiveIrispigmentepithelial(IPE)cellscanhopefullyreplacetheautologoustransplantationofRPEcells, andcanalsobeusedinthetreatmentofage—relatedmaculardegeneration(A MD)andotherdiseases.Presentstudyaimedto investigatetheautologoustransplantationofIPEcellsofrabbiteyesandobservemorphologicallytransplantedcellsinsubretina. MethodsTenirisesfromNewZealandrabbitswereobtainedduringiridectom ysurgery,andIPEcellswereisolatedbythe enzyme—mechanicdissection—enzymedigestionmethod.Primarycultur edIPEcellsandthefirstgenerationofcellswerelabeled with5-Brdu.SuspensionofautologousIPEcellswasinjectedintothesubretinalspaceofthefelloweyesusingtheinternal approachmethod.Experimentaleyeballswereextirpated2,4and6weekslaterrespectivelyfortheexaminationoflightand electronmicroscope.ResultsIPEcellsofrabbiteyeswereisolatedandincubatedinDMEMcontaining10%FBSandwere identifiedandpurifiedusingimmunologicalmethod.Afterthesurgery,transplantedIPEcellsformedorlecontiguouslayeronthe topofnativeRPEunderthelightmicroscopeandcellularapicalmicrovilliconnectedtotheoutersegmentofthephotoreceptor undertheelectronmicroscope.Noinfiltrationoflymphocytesormacrophageswasf0und.Theadjacentrodoutersegmentsremained regularthroughouttheexperimentalperiod.ConclusionInternalapproachescouldsuccessfullytransplantthecellssuspension liquidintothesubretinalspaceofrabbits.TheautologousIPEcellscouldsurviveandgrowsimilartotheoriginalRPEcellsinthe subretinalspaceuntil6weeksaftertransplantationwithoutinfluenceonabjectphotoreceptors. Keywordsirispigmentepithelium;internalapproaches;autologoustranspla ntation 摘要目的探讨兔眼虹膜色素上皮(IPE)细胞的自体移植技术并进行术后移植区的细胞形态学观察.方法 通过虹膜全切法获取1O只新西兰白兔的虹膜,采用酶一机械分离一酶消化的方法分离IPE细胞,用5溴脱氧尿嘧啶(5一 Brdu)标记原代或一代的细胞.将标记过的IPE细胞悬液通过内路法分别植入对侧眼的视网膜下腔.术后2,4,6周摘 除眼球对移植区进行光镜,电镜检查.结果经免疫学鉴定纯化培养了兔眼IPE细胞.术后光镜显示移植的IPE细胞 成单层贴附在原始的视网膜色素上皮(RPE)细胞上.电镜结果证实移植的IPE细胞尖端微绒毛与光感受器外节连接, 邻近的光感受器细胞显示正常结构.结论采用内路法可成功地将细胞悬液植入家兔视网膜下腔.6周内移植的自 体IPE细胞在视网膜下腔存活,与原先的RPE细胞生长状态类似,邻近的光感受器细胞无形态改变. 关键词虹膜色素上皮;内路法;自体移植 分类号R773文献标识码A文章编号1003-0808(2007)l1-0823-04 视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE) 细胞移植起自20世纪80年代,在老年性黄斑变性 (age—relatedmaculardegeneration,AMD)等疾病的治疗 方面取得一定效果….随着对虹膜色素上皮(iris 本课题为上海市高等学校技术发展基金资助(02BK04) 作者单位:200011上海交通大学附属第九人民医院眼科[陈艳(硕 士研究生,现在安徽省立医院眼科,合肥230001),罗敏,张健(硕士研 究生,现在上海市杨浦区中心医院眼科)] 通讯作者:陈艳(Email:Chenyan122@126.com) pigmentepithelium,IPE)细胞形态及功能研究的深入, IPE细胞有望取代RPE细胞用于自体移植,从而避免 了异体RPE细胞移植的免疫排斥反应和自体RPE取 材困难的问题.我们探讨兔眼IPE细胞的自体移植 技术,并进行移植区的细胞形态学观察,为人眼IPE细 胞的体外培养及自体移植提供实验基础. 1材料与方法 1.1IPE细胞的分离与培养 1.1.1虹膜的获取1.6,2.5kg的新西兰白兔共l0 只,由上海农学院提供.术前用氯氨酮和速眠新?l:l 混合液肌内注射麻醉,虹膜全切术获取兔右眼约3/4 虹膜,立即置于PBS液中. 1.1.2IPE细胞的分离培养将手术取下的新鲜虹 膜用PBS液漂洗;置于盛有0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液的培养皿中,37?培养箱中消化l0 , 30min.用虹膜恢复器轻轻刮下IPE细胞.用上述 消化液继续消化5,10rain.含20%胎牛血清(FBS) 的等量DMEM培养液终止消化.将上述液体移入离 心管,l000r/min离心8min,弃上清,加入含20%FBS 的DMEM培养液吹打成细胞悬液,计数,接种于35mm 的培养皿中.台盼蓝法测细胞活力,置培养箱中培养. 当细胞生长至近融合状态时,吸出培养液,PBS液洗 涤.0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化 约5min.镜下观察细胞开始收缩变圆,终止消化.将 细胞悬液移入离心管,l000r/min离心10min,弃上 清,加入含10%FBS的DMEM培养液,吹打均匀,按 l:2至l:3比例传代培养. 1.2IPE细胞的免疫组织化学鉴定及标记 1.2.1IPE细胞的免疫组织化学鉴定将细胞接种 在预先放置盖玻片的培养皿中,待细胞生长接近融合 后取出盖玻片,10%甲醛溶液固定30min;3%过氧化 氢(H,O,)室温作用15min;0.2%TritonX-100作用 40min;滴加l:100稀释的一抗AE1/AE3抗体 100L,4?冰箱过夜;加入酶标二抗;DAB显色,苏木 素复染,脱水,透明,封片. 1.2.2IPE细胞的Brdu标记向未融合的IPE细胞 中分别加入40p~mol/L的Brdu溶液.48h后再更换 同样终浓度的Brdu培养液. 1.3兔眼IPE细胞的移植 1.3.1移植细胞的制备取Brdu标记的原代或一代 培养的新西兰白兔的IPE细胞.吸去培养液,PBS液 漂洗.加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化液 消化约5min,终止消化.将细胞悬液移入离心管, 800r/min离心10min.弃上清,加入PBS液约50L, 吹打均匀.使其细胞密度为l000,3000个/50IxL. 分别编号,放入4?冰箱备用. 1.3.2IPE细胞的视网膜下腔移植取出与IPE细 胞编号对应的l0只新西兰白兔.肌内注射麻醉,固定 于手术台,常规消毒铺巾.开睑器开睑,固定上直肌, ChinOphthaIRes,November2007,Vo1.25,No.1I 放置角膜表面接触镜,ll点钟方向做一结膜瓣,暴露 巩膜.角巩膜缘后4mm经睫状体平坦部进入玻璃体 腔.将4号移植针头固定在OT针筒上,吸取约50L 的IPE细胞悬液,经穿刺口进入眼内.显微镜下观察 针头到达视网膜下腔后,选择视乳头颞侧无血管区,在 助手协助下缓缓推进细胞悬液,并进针的大致位 置.观察到视网膜扁平隆起时,退出针头.关闭巩膜 切口,复位球结膜.2只同法同部位注射平衡盐溶液 作对照.术后第2d用直接检眼镜观察眼底,此后约 每周观察1次并记录其眼底的变化.在第2周(n= 3),4周(n=3),6周(n=6)时将新西兰白兔过量麻醉 致死,摘除眼球对移植区进行光镜和电镜检查. 1.4光镜和电镜标本的制作 1.4.1光镜标本制作摘除移植眼,剪去眼外附着组 织.将眼球置于用乙醇一甲醛一冰醋酸配置的固定液 中,24h后将移植区域切成2—4块约0.5cm×1.5cm 大小的组织块,脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续切 片,常规苏木精一伊红染色,封片. 1.4.2免疫组织化学的染色将切片脱蜡至水;3% H,O,室温作用15min;2mol/L的HCL室温下作用lh 抗原修复,晾干,0.1mol/L的NaOH作用2s,流水冲 洗,PBS液漂洗;滴加l:100稀释的单克隆抗Brdu抗 体,置4?冰箱过夜;加入酶标二抗;DAB显色,苏木 素复染,脱水,透明,封片. 1.4.3透射电镜标本的制作及观察摘除移植眼,剪 去眼外附着组织,角巩膜缘后切开眼球壁,置于4? 2.5%戊二醛固定液固定.24h后将移植区域切成数 个3mm×4mm大小的组织块.再将标本用l%锇酸 固定,6l8包埋液与环氧丙烷浸透,包埋.半薄切片定 位,做超薄切片.枸橼酸铅电子染色后,用HITACHI H-500透射电镜观察,照片. 2结果 2.1兔IPE细胞培养及鉴定 原代分离的IPE细胞活力为87%,93%.细胞 接种后5,7d以集落方式增生,逐渐融合成片.原代 培养的细胞经过l4,l8d后达到融合,呈上皮样单层 生长(图1).对传一代以上培养的IPE细胞行广谱细 胞角蛋白单克隆抗体AE1/AE3染色,几乎所有细胞胞 浆显示出棕黄色,胞核呈蓝紫色(图2). 2.2移植结果及眼底观察 l0只兔自体IPE细胞的视网膜下腔移植均获成 功.术中观察移植眼造成了视网膜局部脱离,细胞悬 液弥散到较远部位.2只兔注射时出现细胞悬液返 眼科研究2007年11月第25卷第11期 图1倒置相差显微镜下原代IPE细胞的第16d,细胞融合呈六角形或多角形,呈上皮样单层 生长(×100)图2IPE细胞角蛋白免疫组织化学染色,胞浆成棕黄色阳性反应(×100) Fig.1PrimaryculturedIPEcellsformedamonolayerwithperfecthexagonalo rpolygonalshapein the16thdayunderthephase—contrastphotographs(×100)Fig.2IPEcellswe restainedinto yellow-brownbycytokeratinunderthelightmicroscope(×100) 流,进行了二次注射.1周后观察移植眼眼底视网膜 基本平复.术后2只兔出现玻璃体混浊,1只兔出现 晶状体混浊. 2.3光镜观察 术后2周光镜检查,视网膜神经层大体贴附,视网 膜下腔可见染色较深成圆形或椭圆形的细胞,成单层 贴附于RPE细胞层上.少数细胞游离于视网膜下腔 (图3A),细胞数较正常的对照眼增 多.术后4周视网膜神经层和移植细 胞层与2周时无明显变化(图3B). 术后6周光镜检查IPE细胞成单层贴 附在原始的RPE细胞层上,无粒细胞 及单核巨噬细胞的浸润(图3C). 术后6周移植眼的病理切片行 抗Brdu抗体的免疫组织化学染色. 发现视网膜下腔有核染成棕黄色的 细胞成单层贴附在RPE细胞层上 (图4). 术后6周的透射电镜显示在原 始的RPE细胞层上移植的IPE细胞存活,形成具有极 性的单层细胞,细胞成圆形或椭圆形,尖端微绒毛与光 感受器细胞相连.邻近的光感受器细胞通常显示正常 的核层及长的外节(图5).相邻的细胞问未出现明显 的细胞连接,移植细胞内含有较多的色素颗粒,胞浆内 可见线粒体,溶酶体,粗面内质网等细胞器结构.细胞 质内还观察到摄入的吞噬体(图6). 图3术后视网膜下腔可见数个椭圆形或圆形细胞位于原始的RPE 细胞层(箭头,HE×400)A:术后2周B:术后4周C:术后6周图4 术后6周的Brdu免疫组织化学检测显示视网膜下腔有被染成棕黄 色的细胞(箭头,×400)图5移植术后6周,视网膜下腔可见存活的成椭 圆 形的IPE细胞(箭头),邻近移植细胞的光感受器细胞显示正常的核层 和外节(×3400)图6存活的IPE细胞可见椭圆形的细胞核,胞质内可 见较多的色素颗粒及线粒体,内质网等细胞器.胞质内含有吞噬的脱 落的外节膜盘(箭头),细胞顶部有较多的微绒毛与周围的光感受器细 胞外 节接触(x9700) Fig.3AlotofcellscouldbeseeninthesubretinalspacetoattachtotheprimaryRPEcellsaftersurgery,showingovalorround(arrow)inshape(HE, ×400)A:2weeksaftersurgeryB:4weeksaftersurgeryC:6weeksaftersurgeryFig.4Somecellsinthesubretinalspacewerestainedinto yellow.brownbyBrdu(arrow)6weeksaftersurgery(×400)Fig.5Theovalcellsinthesubretinalspacewereseen(arrow),andadjacentphotoreceptors discl0sedanormalnuclearlayerandlongoutersegments6weeksaftersurgery undertheelectronmicrographs(×3400)Fig.6Thenumerous mitochondfia,roughendoplasmicreticulum.melanosomesandtheintactnuc leuswereseenintransplantedIPEcellswithmicrovilliadjacenttophotorecepter ROS.ThefragmentsofphagocytosedphotorecepterROSwereobservedinph agosomesinthecytoplasmofIPEcells(arrow)(×9700) ? 826? 3讨论 视网膜下腔被认为是视网膜移植比较安全的地 方.然而一旦移植破坏了正常的血一视网膜屏障,其 免疫赦免的环境就会遭到破坏.造成移植细胞被 吞噬或坏死,凋亡.目前常用的移植方法有经巩膜的 外路法和经睫状体平坦部的内路法.外路法不能直接 观察移植区,易造成脉络膜出血,将移植物误植入玻璃 体腔而造成牵拉性视网膜脱离等.我们参考了国内外 的文献,进行了反复的预试验,采用了经睫状体平坦部 的内路法.选择合适的移植器械是手术成功的关 键.经试验选择了直径为300m的4号钝头针头,连 接在OT针管上,沿所做的玻璃体隧道进入眼内到达 视网膜.但操作时可能会造成较大的视网膜裂口,细 胞悬液可能从裂口返流人玻璃体内.周朝晖等采 用输入泵注射器进行视网膜下注射可明显减少医源性 的损害,提高手术成功率. 术后2例发生了玻璃体混浊,考虑可能是穿刺时 损伤了玻璃体所致,也可能是细胞悬液返流人玻璃体 所致.屈宏波等认为增生性玻璃体视网膜病变 (proliferativevitreoretinopathy,PVR)的发生可能与细 胞返流有关,所以主张有细胞返流时行玻璃体切割术. 我们在术中发现只要进针部位准确,基本不会发生细 胞悬液返流,细胞悬液会弥散到视网膜较远区域,所以 我们未行玻璃体切割术.术后6周没有明显的PVR 出现.术后光镜观察到移植细胞成单层贴附在 Brueh’S膜上或是原来的RPE细胞层上,少数细胞游 离于视网膜下腔.移植后的细胞没有增生,这与文献 报道的一致’. 电镜显示存活的IPE细胞具备极性,细胞顶部有 较多微绒毛,将光感受器细胞的外节包埋.邻近的光 ChinOphthalRes,November2007,Vo1.25,No.11 感受器细胞显示了正常外节和核层,说明移植的IPE 细胞在一定程度上起到了保护光感受器细胞的作用. 移植细胞内含有较多的黑色素颗粒,色素颗粒存在于 正常IPE细胞中,对维持光感受器细胞的正常功能非 常重要.细胞培养中,随传代次数增加,色素颗粒 会逐渐减少.实验中使用的是原代或一代培养的细 胞,所以移植区存活的IPE细胞仍含有较多色素颗粒, 与文献报道一致.移植后的IPE细胞的细胞质内也 发现了外节膜盘的吞噬体,与Enzmann等报道一 致,说明IPE细胞具备一定的吞噬代谢功能.我们在 实验中未发现细胞之间形成明显的桥粒连接.移植到 视网膜下腔的IPE细胞是否具有其他维持视网膜新陈 代谢的功能目前尚不清楚. 参考文献 1BinderS,KerbsI,HilgersRD,eta1.Outcomeoftransplantationof autologousretinalpigmentepitheliuminage—relatedmaculardegeneration :a prospectivetrial[J].InvestOphthalmolVisSci,2004,45(11):4151—4160 2AlgverePV,BerglinL,GourasP,eta1.TransplantationofRPEinage- relatedmaculardegeneration:observationsindisciformlesionsanddryRPE atrophy[J].Grae~’SArchClinExpOphthalmol,1997,235(3):149—158 3EnzmannV,FaudeF,WiedemannP,eta1.Immunologicalproblemsof transplantationintothesubretinalspace[J].ActaAnat,1998,162: l78一l83 4CrafoordS,GengL,SeregardS,eta1.Photoreceptorsurvivalin transplantationofautologousirispigmentepithelialcellstothesubretinal space[J].ActaOphthalmolScand,2002,80(4):387—394 5周朝晖,HenryJK.鼠视网膜色素上皮显微移植方法的比较研究[J]. 中华眼科杂志,2004,40(8):549—551 6屈宏波,成霄黎.兔视网膜色素上皮细胞移植的实验研究[J].山西医 科大学,2002,33(5):402—405 7AbeT,TomitaH,KanoT,eta1.Autologousirispigmentepithelialcell transplantationinmonkeysubretinalregion[J].CurrEyeRes,2000,4: 268—275 (收稿:2006—12—14修回:2007—09—19) (本文编辑:胡纯钢王璐璐) 眼科研究编辑部致作者 尊敬的作者,首先感谢您对《眼科研究》的厚爱和大力支持.《眼科研究》在广大作者和读者的关心和支持下,学术水平和办刊 质量逐年提高,连续列入”中国中文核心期刊”和”中国科技论文统计源期刊”,已被多家国内外着名检索机构收录.为了了解本刊 所发表文章的获奖情况以及所获重大社会和经济效益情况,特向您作如下调查: 1.2006年以来在本刊发表的文章获地(厅)级以上(包括国家级,省部级,地厅级)的科研成果奖和评为优秀论文者,包括自然 科学奖,科技进步奖,发明奖,星火奖和火炬奖等,请提供成果奖和优秀论文的题目及发表在我刊的何年,何期,何页以及获奖证书 复印件等. 2.2006年以来所发表的成果奖获重大社会效益和经济效益,请提供证明材料的复印件. 获奖名单将定期在本刊上刊登,予以表彰. (本刊编辑部)
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