表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定

第23卷第6期 中 目预防兽医学报 V01．23，No．6 2001年11月 ChineseJoumalofPreventiveVekrinaryMedicine Nov．2001 表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗 的安全性试验与最小免疫剂量测定 王云峰，智海东，王玫，仇华吉，周艳君，田志军，张绍杰，童光志+ (中国农业科学院啥尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室．黑龙江喑尔滨150∞1) 摘要：将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(腓ⅡJT‰B)通过鸡胚成纤维细胞培养，加入适当 的保护剂制成冻干疫苗。取3批冻干疫苗，生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种14日龄和50日龄sPF鸡，接种 剂量为5×106P兀j，接种后3天出现局部反应．5天局部肿胀达到最大，接种鸡无其它全身反应，精神、食欲以及发育等均不受 影响，说明重组病毒对试验鸡是安全的。取其中的200003批疰苗，用生理盐水作210～～210。5稀释后，翅内侧无血杼处皮= 接种40日龄SPF鹃，免疫后4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株，结果表明，重组病毒对试验坞翅内帆 皮下接种能产生良好的免疫力，在接种剂量为210-。～210—0．1r出鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应，当接砷帮瞪 为210～02m山7鸡时可以使部分试验鸡(s／ls)产生局部反应，鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为210—o．1ml(相当于10∞ PFU)。攻毒试验结果进一步{芷明，当接种剂量为210～0．1ral(相当于1000Pn『)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力，抵抗传染性 喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒102株的攻击，降低鸡群的发病率和病死率。这些结果说明，疫苗接种后的局部反一董与 重组疫苗的免疫效力之间具有相关性，疫苗对接种鸡的局部作用反应了疫苗的免疫效力，我们研制的重组疫苗的最／J、免疫刺 量为1000PFU，这就为我们进一步考察疫苗的免疫效力试验奠定了基础。 关键词：传染性喉气管炎； 鸡瘟i 重组鸡瘟病毒； 最小免疫剂量 中圈分类号：$95265；0784 文献标识码：A 文章编号：1008．0589(2001)()6>0441．04 SafetyEvaluatlonandM丘lljIImmllniHune—dosesDetectionoftheRecombinantFowlPox VirusExpressingGlyeoprotdnBofInfectiousLarngotraeheitis wANGYun—feng．珊H丑i·,tong．w伽Mei，QmHua-ji，ZHOUYan-jun，删71ai-jun． z删GShao-jie．"lONGGuang-zhi’ (N血c,nal断taboratet3,dVetefinm'yBioteehnology．Harbinx．retefinaryR∞cH小lrt日iRtleofChinese Aedemy0r埘砌删sci∞。口，Harbin15G00t，Ghirm) 煳喇：B_ecombinmatFowlpoxvlma叩咄咖删出B(庐)geneofInfoedomLaryngatraehai6svirus(IⅢ)“pmpagated in她ctfcken唧岫ofibmblnstscells，dtertheproteeti缯啦m蝴added，thelyop心v'aeelne哪—删．Threelotsof啦dncs姑陀 ehose,／1anddilmedinthesalinewater14-day．oldand50-day-oldSPFChicke佃讹reiIl0捌intheendotheliumunderthe“她ofchicken (st,r)mthedoseof5×106PFU／cblcken，】州瑚“咖8pF哪『edthreedayslater，localswellbecazlel喇atthe,Jar5，Theinoculmed clfiekenshowednOsignofotherd㈣orls。andinspirit，appetiteanddevelopmeatwerethe姐me∞eontrals．Theresultsindicatedthatthe vaccineissafehcKcken，仳vacelne(10tb；o．200003)w曲dilutedtO2x10～一2x10_。，andthe40-day-oldSPFChickeaaswe≈inocu— lated船above，andchaU州withltffeetiousLaryngatmeA-teifisvirus蜘nWGarId删g'train1024weeks曲eri删afton，theresults showedthatthevaccineinoeulaledintheendetheliumunderthewi理ofchickenecnddindueesolidimmunity．Theehickem打meula．e【lLnthe d姗rangeof2x10-2t02×10-。0．1ml眦induce10ealreaati帆．andtheinoculum0f2x100e．mlinclueeloealreactionpartially(5／'15) ‰resulbfurthersll删thatthemmlunedosewas2x10～couldimlucesolidimmunity，cflneffectivelypmteetchickenq画n或thecheJlenge 0fthe、4mlemvirusTheaeresultsindieatethatthelocalreaatlonandtheefficiemTⅢ_巳eo一坨la埘‰localreacfioncanreflectthedlicien— cy0f岫vaccine．仉mitfiraⅡndosedthevaccmeblfl3咿FU．A1ltheseresults埘岫fotaldallalhftmhar啊Illa七吨the函d删dthevaedne Keys：InfecfiousLaryngotraeheifis；FowlPox； Reeorabinantfowlpox咖；Minimum岫une妇 *Corresporldingauthor．E—mail：gztong@imblic．hr．111．cn 基金项目：国家863资助(101—05—03—1) *通讯作者E—mail：gnong@public．hr．hi．cn 收稿日期：2000一皿一23 万方数据 yhfeng 铅笔 yhfeng 铅笔 yhfeng 铅笔 yhfeng 铅笔 yhfeng 铅笔 yhfeng 铅笔 yhfeng 铅笔 中国预防兽医学报 2001年 鸡传染性喉气管炎(ET)是由传染性喉气管炎 病毒(r【Jw)引起的鸡的一种急性上砰吸道传染病， 已成为危害养禽业的重要疫病之一⋯，目前国内外 普遍采用弱毒疫苗防制本病。尽管弱毒疫苗具有较 好的免疫效果，但由于弱毒疫苗的免疫原性与其毒 力有正相关性，所以疫苗株还残存着毒力；弱毒疫苗 株和强毒株一样也能引起潜伏感染"o；在应激状态 下，鸡体能排出弱毒，能将该弱毒传染给非免疫 鸡13．4J，鸡群与鸡群之问传播能引起毒力返强，使其 成为潜在的传染源【5J。因此，鸡传染性喉气管炎弱 毒疫苗仅限于在该病流行地区使用，清净鸡群一旦 发生本病将引起肼暴发，导致重大损失，这是ⅡJT 防制中存在的主要问题。所以，研制既安全又有效 的新型疫苗成了我们兽医科研人员所需解决的一大 课题㈨。 研制重组活病毒载体疫苗为鸡传染性喉气管炎 的防制提供了一个可能途径。我们已经构建了表达 鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘 病毒，而且证明该重组鸡痘病毒能在鸡胚成纤维细 胞中忠实稳定地表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白 邸基因，可以使免疫鸡产生保护一J。本试验测试了 重组疫苗对鸡的安全性以及测定了对鸡的最小免疫 剂量，论证了该重组病毒作为候补疫苗毒株的可能 性，为进一步的中试和推广作铺垫。 1试验材料 1．1 重组鸡痘病毒(胛v—ILl、：gB)表达传染性喉 气管炎病毒妒基因的重组鸡痘病毒椰v一Ⅱ肌出 由本研究室构建。该重组病毒含有Pll启动子控制 下的太肠杆菌【丑cz基因、由禽痘病毒早晚期启动子 u)2EP2控制下的鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白邓 基因，这两个外源基因在重组病毒感染的鸡胚成纤 维细胞上都能正确表达。病毒教价为5107P兀J／盯d。 1．2鸡痘病毒标准强毒鹃痘病毒102株k(0．Jg 1997．5．21)，引自中国兽药监察所。经过绒毛屎囊 膜接种lO日龄SPF鸡胚复壮和传代，收集具有明显 痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，研磨后分装，低温保存，用 于试验鸡的攻毒试验。羽毛囊涂擦攻毒的剂量为 10～，病毒涂擦鸡的毛囊开始红肿．之后变为黄白色 干酪样物，结血痂，呈融合状态，3周后脱痂，脱痂后 皮肤损伤严重，表面粗糙。 1．3传染性喉气管炎病毒wc株由中国农业科 学院哈尔滨兽医研究所监察室提供。攻毒前先通过 10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜传代，收集具有明显水 肿和痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，研磨后分装，低温保 存。用于试验鸡的攻毒试验，对50日龄SPP鸡的毒 力为10～0．2d。 1 4免疫试验用SPF鸡1日龄的SPF白色来杭 鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中 心提供，实验期间饲养于中国农业科学院哈尔滨兽 医研究所实验动物中心禽病感染室的负压隔离器 中。 1 5 SPF鸡胚用于培养鸡痘病毒和传染性喉气 管炎病毒以及制备鸡成纤维细胞的9～10日龄SPF 鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。 2试验方法与试验分组 2．1重组疫苗的安全性试验取200。01、200002和 200003批疫苗，用生理盐水稀释至原倍体积，对14 日龄和60日龄的SPF鸡进行翅内侧皮下注射．每只 鸡接种0．1d(5×106PFU／羽，相当于50个免疫剂 量)．试验的分组情况见表1。接种后观察鸡群的精 神状态吼及局部的反应情况。 2．2重组疫苗的最小免疫剂量测定将40日龄的 SPF鸡分为五组。组l，翅内侧皮下注射作210_2稀 释的2㈣3批疫苗，每只鸡接种0．1m；组2，翅内侧 皮下注射作2100稀释的200003批疫苗，每只鸡接 种0．1训；组3，翅内侧皮下注射作210“稀释的 200003批疫苗，每只鸡接种0．1d；组4，翅内侧皮下 注射作2100稀释的200003批疫苗．每只鸡接种O． 1ITll；组5，不作疫苗注射。各试验组免疫接种后30 天，将各个试验组再随机分为2个小组，将第1组的 2个小组命名为Al和A2，第2组的2个小组命名为 Bl和B2，其它各组以此类推，直至EI和E2。对 A1、Bl、c1、D1、El组试验鸡用IO-2稀释的WG株传 染性喉气管炎病毒攻击，每只鸡堠囊内接种0．2．d， 对A2、B2、C2、D2、E2组的试验鸡用lO’2稀释的102 株鸡瘟病毒攻击，攻击强毒后每厢8小时观察鸡群 1次，并记录鸡群的发病与死亡’情况。 3结果 3．1 重组疫苗的安全性试验2肿00l、200002和 2蝴批疫苗接种试验鸡后3天，所有试验鸡的注 射局部均出现肿胀，5天肿胀的厚度达到最大，此后 肿胀开始消退，未见注射局部的结痂现象，但两个日 龄组的试验鸡的肿胀消失时间略有差异，14日龄试 验鸡肿胀消失的时问要长于50月龄的试验鸡。所 有试验鸡均无其他全身反应，精神食欲不受影响，发 万方数据 第6期 王云峰，等表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价 育正常。结果见表1。结果表明，即使用原倍的重 组病毒注射试验鸡也不会引起试验鸡严重的临床反 应，重组疫苗是安全的，既可用于4周龄以上鸡的免 疫，又可用于2周龄雏鸡的免疫。 表1重组疫苗的安全性 Table1 SafetyofreD∞nbiII跚tvaodne 3．2重组疫苗的最小免疫剂量测定试验证明，重 组疫苗对鸡具有良好的免疫力。第l组到第3组的 试验鸡注射疫苗后均出现明显的局部反应，注射5～7 天皮厚达到最大，对传染性喉气管炎病毒和鸡痘强 毒攻击均能产生保护，最小免疫剂量为210一。 210_5盘有5／15的试验鸡出现局部反应．不能对鸡痘 强毒的攻击产生完全保护。试验结果见表2和表3。 表2传染性喉气管炎病毒WG株攻毒后鸡群的发病情况 Table2 lnddemeofeldekem由蚰e哩神wi山ILTVWGstrain 表3鸡瘟病毒1122株攻毒后鸡群的发病情况 Table3 Inddellee0fehkk自asebau酬winIFPV{102)straln 4讨论 前面的试验已经证实．将传染性喉气管炎病毒 gB基因插人鸡痘病毒s一刚一017基因组中不会影 响病毒的复制，重组病毒不仅能在鸡胚成纤维细胞 中稳定地传代，而且也能在鸡体内稳定地遗传，是一 个良好的重组疫苗候选毒株。本试验通过强毒的攻 毒试验再次证明了重组病毒的遗传稳定性及其外源 基因表达的忠实性，接种鸡后能产生可靠的保护，i 抵抗鸡痘强毒和传染性喉气管炎强毒的攻击，显菩 降低免疫鸡群的发病率，缓辫发病鸡的疾病严重程 度。通过对3个批次的冻干疫苗的安全性试验证 明，重组病毒无论是对50日龄以上的中雏，还是仅 14日龄的小雏都是安全的，小雏接种后的局部反应 要强于中雏，肿胀消退的时间延长了I～4天，结果 一方面与鸡个体大小有关，另一方面也与接种的剂 量有关，提醒我们可以根据使用对象的不同适当调 整接种病毒的剂量，这样就扩大了重组病毒的适用 范围，重组鸡痘病毒(rFPV—ILTV出)可以用于2周 龄以上的各种年龄段鸡群的免疫接种。 试验结果表明，重组病毒对试验鸡翅内侧皮下 接种能产生良好的免疫力，在接种剂量为210～一 210—40．2r∥鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部 反应，当接种剂量为210_。0．2ml／鸡时可以使部分试 验鸡(5／15)产生局部反应，但仍有一定的免疫力。 鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为210—0．1rnl(相 当于1000PFU)。攻毒试验结果进一步证明，当接种 剂量为210～0．1ml(相当于1000PFU)可以使免疫鸡 产生可靠的免疫力，抵抗对传染性喉气管炎病毒WG 抹强毒和鸡痘病毒102株的攻击，降低鸡群的发病 率和病死率。这些结果说明，疫苗接种后的局部反 应可以从一个侧面反面重组疫苗的免疫效力，我们 研制的重组疫苗的最小免疫剂量为1000PFU，这就为 我们进一步考察疫苗的免疫效力试验奠定了基础。 万方数据 第23卷第6期 2O01牟I1月 中国预防兽医学报 ChineseJournalofPreventi’'eVeterinary?I{／ed／cine V01．23．No．6 Nov．200l 鸡沙门氏菌弱毒冻干苗的研制 潘志明，焦新安+，黄金林，张小荣，孙林，刘文博，甘军纪，高崧，张如宽，刘秀梵 (扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室．扛苏扬州225009) 摘要：由减毒鸡沙门氏菌97A疫苗株作为制苗用菌种．经普通琼脂培养、冷冻真空干燥等工艺生产鸡沙门氏菌弱毒疫苗4 批，每批疫苗分别以免疫剂量接种6Et龄从肉鸡，免疫第14王时，用强毒抹s99和sp4攻击，免疫组死亡保护率均达90％以 上，试验结果表明，该苗具有良好的安全性和免疫效果。 关键词：鸡沙门氏茁弱毒茁；安全性；免疫效力；增重 中图分类号：$858．31 文献标识码：A 文章编号：1008-0589(刍001)06dN44-04 Development0fs{Ill瑚mellaGaIIiImmmA恤糊mtedFreezeDriodVaccine PANZK-面f．g，皿旧Xir}an，HUANGJin-lin，Z㈣GXi卧rong SINIAn，LIUW吼-b0．GANJun-jl，GAOSong，z}IANGRu-kuan，LIU)(iu-tim (Minimykey出0fA而【T-lh曲iⅫDiseases，1i副IUniversity，Y咖·卿．China) Ab血删：Attenuateds舭，叫如剐im啪97Av∞c“m枷n懈cultuxedinthenutrlent89盯llle击unl，andbymeans。f丘俄恐dry． ingtodevelop4bateb,esvaccine、11】eage6_dav_ddchicke峭we盹acalmyimedated“tl-thedose0f5×1旷c兀』／d悄【lIe8cllbatelavaeeine 1kchi&emwerecl讪er删“山strongsh血B0f与毋虮dsp4attile14thday，肌dtI-epr帆d饨r咄0fthein础edgmut*we陀over 90％．‰瑚山indicated岫thevaexXnehad酬sffei3'刊immunity Key研or凼：AttenuatedS．g洲in叽唧vaccine；Sdety；I【11删瑚ettieie¨t．v；Livewei出98irI 基金顶目：江苏省农业科技攻关项目(BD9326) *通讯作者 收稿日期：2000一01—08 {}f}#}f}#}#}*}e÷e}≠}#}f}#}{}f}e}#}卡}自÷#}#}§}f}阜}e}f}{}#}f}#}}}f}#}e}#}#}f}毕÷f}#}e}#}#}#}十}—鼯 构建重组病毒的亲本毒是鸡痘S-FPV-017株， 该病毒是目前普遍使用的一个预防鸡痘的弱毒株， 长期的使用实践证明该疫苗株具有良好的免疫效 果，但仅限于6周龄以上的鸡的免疫接种，对6周龄 以下的鸡接种毒性较大，不提倡使用。我们的试验 {正明，由于外源基因的插人，使重组病毒的毒力有一 定的下降，所以对2周龄的雏鸡也是安垒的，在实际 的应用中，给鸡的免疫接种根本达不到试验的剂量， 所以可以用于雏鸡的免疫。 传染性喉气管炎病毒重组鸡痘病毒的研制成 功，可以达到使用一种疫苗预防两种疫病的效果，从 而大大降低了生产的成本和劳动力。另外，在此基 础上也可以将其它禽病病原(如新城疫病毒)的保护 性抗原基因插入该重组病毒，构建成多价基因 疫苗，达到一针预防多种疾病的目的。本研究为其 它病毒活载体疫苗的研制提供了借鉴，具有重大的 科学意义。 致谢：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心 的全体工作人员，特别是张坦先生和夏长友先生等对本实验 的顺利进行提供了大力帮助，在此表示谢意! 参考文献 [J]B昭蚪T．J．刊Sc．J鲫瑚，删蛐e正P棚竹【础：c妇kBw Bm瑚It．J．Be口dC．W．由l10由d。1㈣StateUn№ityP垴8． 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