紫外分光光度法测定维生素B12注射液的含量

实验四 紫外分光光度法测定维生素B12注射液的含量 一、实验目的 1、理解紫外—可见分光光度法定性分析、定星分析的原理。 2、掌握紫外—可见分光光度法测定维生素B12含量的原理。 3、掌握 UV—7502PC 紫外—可见分光光度计的结构、原理与操作。 二、原理 分子中的电子发生跃迁需要的能量约在 1~20eV 之间，其对应的吸收光的波长范围大部 分处于紫外和可见光区域，通常将分子在这一区域的吸收光谱称为电子光谱或紫外—可见吸 收光谱。物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的 光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不 同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物 质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高 低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根 据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。 紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律，即物质在一 定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比。在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波 长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸 收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。 1. 紫外-可见分光光度计的基本结构 紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录系统组成。 图 1 紫外—可见分光光度计基本结构图 2. 透光率和吸光度 如图 2 所示：入射光强度 I0，吸收光强度 Ia，透过光强度 It， 反射光强度为 Ir I0 ═ Ia + It + Ir 被测溶液和参比的吸收池同样和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为 I0 ═ Ia + It 透光率愈大，溶液对光的吸收愈少； 反之，透光率愈小，溶液对光的吸收愈多 透光率的负对数称为吸光度，用符号 A 示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。 3. 朗伯—比尔定律 朗伯—比尔定律是光吸收的基本定律，它可表述为：当一束单色光穿过透明介质时，光 强度的降低同入射光的强度、吸收介质的厚度、溶液的浓度成正比。用表达为： A = lg I0/I = k c l 当 l 以 cm，c 以 g/L 为单位时，k 称为吸光系数，用 a 表示，即： A = a c l； 当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的 单位为L mol-1 cm-1，即： A = εc l 维生素B12吸收光谱上有三个吸收蜂：分别为(278±l) nm、(361±1) nm、(550±1) nm， 三个吸收峰均可以根据吸收曲线扫描得到。选择其中最大的吸收峰，根据朗伯-比尔定律， 以曲线法测定维生素B12的含量。 图 1 UV-7502 紫外—可见分光光度计 图 2 样品对入射光的作用 图3 UV-7502紫外—可见分光光度计图2 样品对入射光的反射及透射作用 三、仪器与试剂 UV—7502PC紫外—可见分光光度计，石英吸收池，维生素B12注射液、维生素B12标样 四、实验步骤 1、标准溶液和待测标准溶液的配制 将维生紊B12标样配制成标准溶液，其浓度分别为 6ug/ml、12ug/ml、18ug/ml、24ug/ml、 30ug/ml。根据维生素B12注射液的标示含量配制成一定浓度的待测溶液。 2、吸收曲线的绘制 （1）开启 UV—7502PC 紫外—可见分光光度计电源，开机后使仪器预热 20 分钟，至 仪器自动佼正后，显示器显示“546.0nm 0.000A”仪器自检完毕。 （2）开启计算机电源，进入操作系统，点击相应的 UV—7502PC 应用软件，运行该软 件时，先选择通讯串口，然后选择工作方式，等待至电脑显示屏上显示“PC-CONN”表示 联机成功，进行通讯自检、仪器自检后，进入软件操作界面。 （3）任意选择一个标准溶液浓度，进行光谱扫描，得吸收光谱曲线和最大吸收峰的位 置，该最大吸收峰用作下面的测量。 3、利用标准曲线测量待测样品含量 选择最大吸收峰(278±l) nm 或(361±1) nm，以蒸馏水最为空白溶液，分别测量浓度为 6ug/ml、12ug/ml、18ug/ml、24ug/ml、30ug/ml 的标样的吸光度。之后点击[线性方程]和[相 关系数]按键，得到标准曲线线性方程和相关系数。 测量待测样品的吸光度，再利用此线性方程和相关系数得到待测样品的含量。 3、整理关机 将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净，倒立晾干。关电 源，盖上防尘罩，做好使用登记，得到管理老师认可方可离开。 五、注意事项 (1) 空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。 (2) 测定时，除另有外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用 1cm 的石英 吸收池。 (3) 一般供试品溶液的吸收度读数，以在 0.3～0.7 之间的误差较小。 (4) 吸收池应选择配对，否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透光率相差小于 0.5％的吸收池作配对，在必要的情况时，须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。 (5) 由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数， 再计算含量。 (6) 在使用过程中，如需开启试样室盖时或暂时停止测试时，必须及时推入光门钮杆（使光 电管前光门关闭），保护光电管，以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。 (7) 在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池 3～4 次，用干净绸布或擦镜纸 擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。 (8) 取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用 测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中， 防尘保存。 六、思考题 1、朗伯-比尔定律表达式是怎样的？透光率与吸光度如何换算？ 2. 分光光度计的主要部件及其作用是怎样的？ 3. 如何提高测定灵敏度和准确度？