高效液相色谱电化学法测定大鼠不同脑区的单胺类神经递质

·162· 坐i!垦堕匿堑!塑!至!旦筮!!鲞箜!塑婪鲤!盟苎旦!鱼!!垫§!!些!!堕塑!生垦!垫!!!竺：!!!!!!!!：!!!型!：! 高效液相色谱一电化学法测定大鼠不同脑区的单胺类神经递质 王娜1’2，吴红海1，侯艳宁1▲ (1．解放军白求恩国际和平医院药剂科，石家庄050082；2．河北医科大学，石家庄050017) 摘要：目的：建立同时测定大鼠脑组织中单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5一HT)的高效液相色谱一电 化学检测法(HPLC—ECD)。方法：采用DiamonsilC。。柱，以Na：HP0；一枸橼酸-EDTA一庚烷磺酸钠一甲醇一水(80：40：2：7：32：89)为流动 相，流速：1．2ml／min。大鼠脑组织样品经高氯酸沉淀除去蛋白后，电化学检测脑内NE、DA和5一HT的含量。结果：脑组织中NE、 5一HT的线性范围为0．50一lO．oOng，DA的线性范围为O．25—30．00ng。脑组织样品的相对回收率为91．7％一llO．2％，日内、日问 变异均小于15％。经初步研究，正常雄性sD大鼠不同脑区内NE、DA和5·HT的含量分别为伏隔核(508±203)、(3140±486)、 (60l士105)ng／g，腹侧被盖区(695±152)、(746±143)、(1049±222)ng／g，下丘脑(2032±351)、(332±236)、(847±218)ng／g，纹状 体(790±205)、(5816±805)、(538±112)ng／g。结论：该方法具有准确、灵敏、样品制备简便等优点，可用于大鼠部分脑区内单胺类 神经递质的分离测定。 关键词：神经递质；脑区；色谱法，高压液相；电化学；大鼠 中图分类号：R446．8 文献标识码：A 文章编号：1009_0878(2006)03加162_03 MeasurementofMonoamineTmnsmittersinDiscreteRatBrainRegionsbyHigh-PerformanceLiquidChromatographyCoupledto ElectrochemicalDetectiOn wANGNal一，wUHong_hail，HOuYan·nin91(1．DepartmentofPha肋acy，BethuneIntern8tionalPeaceHospit8lofPLA，Shijiazhuang 050082，China；2．HebeiMedicaluniversily，Shijiazhuang050017，China) Abstract：objective：Arapidandsimplechromatographicprocedureforsimultaneousdete瑚inationofnorepinephrine(NE)，dopamine (DA)and5．hydroxytryptamine(5一HT)indiscretebrainareasofratswasestablishedbyusingh培h·performanceliquid—chromatographycou— pledtoelectrochemicaldetection(HPLC—ECD)．Methods：MonoaminetransmiIterswereisolatedbyHPLCwithDiamonsilC18columnwith mobilephaseconsistingofNa2HP04一citricacid·EDAT—sodiumheptanesulfonate—cH，0H·H20(80：40：2：7：32：89)at1．2ml／minnowrate． Afterperchloricacidwasaddedtoprecipitatetheproteins，thecontentsofNE、DAand5·HTinratbrainhomogenateswereassayedwith HPLC—ECD．Results：ThelinearcalibrationcurvesofNEand5一HTwereobtainedinthecontentr8ngeof0．50～10．OOng；thecurveofDA wasobtainedinthecontentrangeofO．25—30．OOng．Therecoveriesofmonoamineswerebetween91．7％一110．2％．ThecoefficientofVar— iationwaslessthan15％(几=5)withinrIlnandbetweennlns．ThecontentsofNE，DAand5-HTinratbrainregionswere(508±203)， (3140±486)and(601士105)ng／g(nucleusaccumbens)；(695±152)，(746±143)and(1049±222)ng／g(Ventraltegmentalarea)； (2032±351)，(332±236)and(847±218)ng／g(hypothalamus)；(790±205)，(5816±805)and(538±112)ng／g(striatum)，re- spectively．Conclusion：HPLC·ECDwasfbundtohavehighsensitivityandgoodaccuracyindetectingeachofthemonoaminetransmitters． Theprocedurewassuitableformeasuringcontentsofthemonoaminetransmittersinratencephalicregionssimultaneously． Keys：Neurotmnsmilter；Encephalicregion；Cllromatography，high—perfbrmanceliquid；Electrochemicaldetection；Rat 单胺类神经递质包括儿茶酚胺和吲哚胺等，前者 主要指去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素 和多巴胺(dopamine，DA)，后者主要指5-羟色胺(5- hydmxytryptamine，5．HT)¨1。单胺类神经递质在中枢 神经系统中参与脑缺血、镇痛和学习记忆等多种生理 过程。此外，它们在吗啡依赖的形成和复吸过程中也 具有重要的作用旧1。因而，准确测定脑组织中单胺类 神经递质的含量具有重要的意义。目前关于脑内单胺 递质的检测方法很多，包括荧光分光光度法日1、高效液 相色谱一电化学检测法(HPLc-EcD)Hjl、高效液相色 ▲通讯作者：侯艳宁，电话：031l一87978480；传真：0311-83023466； E—mail：houyn@163．com 谱．荧光法哺川及质谱法¨1等。而其中HPLc．ECD是报 道最多以及应用最广泛的方法，我们参考有关文献，根 据本实验室的条件，建立了一种实用、灵敏、简便的 HPLC．EcD，并测定了大鼠不同脑区内NE、DA和5．HT 的含量，为进一步研究单胺类神经递质的生理和药理 作用奠定理论基础。 1材料和方法 1．1 仪器和试剂 HPLC-ECD检测系统，配有LC- 10AT泵、L—EcD．6A检测器和cT0—10A柱温箱(日本 岛津公司)；EC2000色谱数据处理工作站(大连依利特 分析仪器有限公司)；DIA×900电动匀浆机(德国Hei— dolph公司)；高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器 厂)。NE、DA品(Fluka公司)；5-HT标准品(sig— 万方数据 ma公司)，庚烷磺酸钠(B7，日本东京化成工业株式会 社)，3，4一二羟基苄胺(3，4-dihydroxybenzylamine，DH— BA，A1drichchem公司)，甲醇为色谱纯，其他试剂均为 分析纯，实验用水为市售纯净水。 1．2溶液的配制 1．2．1标准品溶液的配制：精密称取NE、DA和5-HT 标准品适量，以0．1mol／LHCl溶解，分别配成浓度为 1 g／L的储备液，临用前将O．1mol／LHcl稀释浓度为 0．125、0．250、0．500、1．000、2．000、5．000、10．000、 15．000¨g／L的系列标准液。 1．2．2蛋白沉淀液的配制：取0．7mol／L高氯酸溶液 和0．01mol／LEDTA溶液适量，用水稀释为含高氯酸 0．1mol／L和EDTA0．1mmol／L的蛋白沉淀液。 1．2．3内标工作液的配制：精密称取DHBA适量，以 蛋白沉淀液溶解配成浓度为2mg／L的内标工作液。 1．3脑组织中单胺类神经递质的提取取雄性SD大 鼠10只，河北省实验动物中心提供(清洁级，合格证号 DK0511106)，体重200—250g，动物断头处死，开颅迅 速取出整个脑组织，在4℃的生理盐水中分离伏隔核 (nucleusaccumbens，NAc)、腹侧被盖区(ventralteg— mentalarea，VTA)、下丘脑(hypothalamus，Ht)和纹状体 (striatum，S)，称重后一70℃保存备用。将重量小于 50mg(湿重)的脑组织样品加入270斗1蛋白沉淀液和 250 如0 150 鼍 一100 出 普50 0 0 ·163· 30斗l的内标工作液，将重量大于50mg的脑组织样品 加入450¨1蛋白沉淀液和50斗l的内标工作液，冰浴 下电动匀浆，匀浆液于15000r／min下低温离心 30min，上清液于15000r／min再次低温离心25min， 取上清液20恤l进样检测。另取3只雄性SD大鼠，取 全部脑组织混合后匀浆，作为方法学实验中的对照脑 匀浆。 1．4 色谱条件 色谱柱为DiamonsilC，。反相柱 (150mm×4．6mm，5斗m，迪马公司)；流动相为 200mmol／LNa2HP04：150mm01／L枸橼酸：0．1mol／L EDTA：150mmol／LB7：甲醇：水=80：40：2：7：32 ：89，使用前经0．45恤m微孔滤膜过滤2次，并超声脱 气20min；流速为1．2ml／min；柱温30℃。电化学检测 为玻璃工作电极，Ag／AgCl参比电极，工作电压 为+0．75V。 1．5统计学分析数据以(孑±s)表示，采用线性回归 最小二乘法计算单胺类神经递质的标准曲线。 2结果 2．1 色谱行为 在本实验条件下，脑组织样品中的 NE、DA和5．HT得到了良好的分离，其他杂质不干扰 测定结果。待测物质和内标的色谱图见图1，NE、DA、 5．HT和内标保留时间分别为3．6、9．5、25．O和 6．3min． A．空白脑组织；B．空白脑组织中加入2ng标准品和2ng内标；C．伏隔核；D．腹侧被盖区；E．下丘脑；F．纹状体 1．去甲肾上腺素；2．多巴胺；3．5一羟色胺；4．内标 图1 sD大鼠不同脑区单胺类神经递质及内标色谱图 2．2标准曲线和线性范围 精取NE、DA、5-HT系列 标准液各50¨1(对照脑组织以0．1mol／LHCl代替)， 内标工作液50斗l，加入均匀对照脑组织匀浆400斗l， 使每份加入的NE和5．HT浓度为0、0．125、0．250、 0．500、1．000、2．000、5．000、10．000¨g／L，DA的浓度 为0、0．125、0．250、0．500、1．000、2．000、5．000、 m mⅫ一^Ⅲ)旷∞％胄 A —i ●●●■niiiiiii 一 一 ij¨mⅢⅢⅢⅢⅢ胁ⅢⅢ叫州¨埘删删¨同韭l—引刈。 E 一矗 ‘●^iiiiil，lL — l●Hjjiiii二iiiii¨＼ 一I D ～一2 万方数据 ·164· 15．000¨g／L。依样品中单胺类递质提取方法操作后， 取20斗l以HPLC—ECD分析，测定NE、DA、5．HT的峰 高与内标峰高比，减去对照脑组织的峰高比值，以峰高 比差值Y对浓度x进行线性回归，结果见表l。 2．3准确度与精密度按2．2项操作，于同日内和不 同日内分别测定NE、DA和5一HT低、中、高加入量为 1．00、3．00和10．00ng的对照品脑组织匀浆样品，计 算脑组织匀浆样品的日内、日问变异及方法回收率，结 果见表2。 表1 雄性sD大鼠脑组织中单胺类神经递质的回归方程、 相关系数、线性范围和最低检测限 表2雄性sD大鼠脑组织中单胺类神经递质的日内、日间测定精密度及方法回收率(n=5) 2．4雄性SD大鼠脑组织内单胺类神经递质的含量 下丘脑内NE的含量最高，伏隔核、伏侧被盖区和纹状 体内NE的水平相近；而纹状体内DA的水平最高，伏 隔核次之，下丘脑最低；5．HT的水平在腹侧被盖区最 高，下丘脑次之，伏隔核和纹状体内相近，见表3。 表3雄性SD大鼠部分脑组织 内单胺类神经递质的含量(i±s，ng／g，n=10) 3讨论 本实验显示，改变流动相中甲醇的比例是缩短测 定NE、DA和5-HT等物质保留时间的关键，加入甲醇 可以明显缩短分析时间，尤其是对5一HT影响较大，但 甲醇加入过多会使NE与杂质峰重叠，影响分析结果。 B7可以延长分析时间，但不如甲醇明显，B7过少时也 影响NE与杂质峰的分离效果。经过多次反复实验， 结果表明，B7的含量为4．2mmol／L，甲醇的含量在 12．8％是最合适的比例，26分钟即可测定1份样品。 但本方法尚待完善的是内标与其前一个杂质峰及DA 与其后的一个杂质峰的分离，在不同脑组织内这两个 峰的响应不同，是否为两个代谢物峰尚待进一步研究 证实。 在处理脑组织样品时，使用两次离心可以改善NE 与杂质峰的分离，若有条件进行高速离心 (40000r／min左右)，效果可能会更好。本实验中样品 的处理是关键，脑组织在一70℃保存1个月以上时， 各种单胺类神经递质均明显降解，在一70℃保存2个 月以上时，则不能测到DA与5-HT，而NE含量也明显 下降。脑组织匀浆液在0℃放置12小时后，NE水平 下降约30％，而5．HT水平下降50％以上，一20℃可 以保存l周左右，所以样品应及时处理、测定。 本研究结果显示，单胺类神经递质在雄性SD大鼠 不同脑区中的分布是不均一的，具有显著差异，测定结 果与报道相符∞1。此外，我们对大鼠额叶皮质和海马 内3种单胺类神经递质的含量也进行了测定，发现在 本实验条件下，不能检测到这两个脑区内DA的含量。 本实验采用HPLc．EcD检测技术，以DHBA为丙 标，建立了同时测定大鼠部分脑区中3种单胺类神经 递质NE、DA和5一HT的方法，本方法灵敏度高，简便实 用。本实验条件下，还可同时测定肾上腺素，其保留时 间为5．1分钟左右。 参考文献： [1]邹刚，主编．基础神经药理学[M]．第2版．北京：科学出 版社，1995．167_252． [2]谌红献，郝伟．阿片类药物成瘾机制的研究进展[J]．中国 临床心理学杂志，1999，7(4)：253．256． [3]何美霞，可君，李志刚．脑组织中单胺类神经递质含量测定 [J]．河南医科大学学报，1996，(下转165页) 万方数据 笙j!垦堕垦堑!Q!!堡!旦箜!!鲞箜!塑坚!!!堕!!望生!!也g!!堡竺垫型!些鱼!堡!!!!!：!塑!!!!!：!!!型!：! 国产和进口氟康唑胶囊剂的人体生物等效性研究 于洋，张运好，王金，侯艳宁 (解放军白求恩国际和平医院药剂科，石家庄050082) ·165· 摘要：目的：以进口氟康唑胶囊为参比制剂，研究两种国产胶囊剂在健康人体的相对生物利用度，评价其生物等效性。方法：18名健 康志愿者按照3制剂3周期优化拉丁方，分别单剂量口服参比制剂和两种受试制剂(A：每粒50mg；B：每粒150mg)，剂量均为 300mg，HPLc法测定人血浆中氟康唑的浓度。结果：受试制剂A、B和参比制剂的主要药代动力学参数：c～分别为(5．39±o．90)、 (4．96±O．62)和(5．13±O．72)斗g／ml；t。。分别为(1．6±0．9)、(1．7±O．7)和(2．2±O．8)h；Auco-12n分别为(215．8±31．8)、(207．5 ±37．1)和(213．5±38．5)斗g·h·ml～；Auco．。分别为(237．8±39．0)、(232．4±52．o)和(234．O±48．7)斗g·h·ml～；tl／2分别为 (34．7±5．9)、(35．7±9．4)和(33．1±6．5)h。受试制剂A、B相对于参比制剂的相对生物利用度分别为(102．5±15．8)％和(97．9 ±12．1)％。结论：受试制剂A、B与参比制剂具有生物等效性。 关键词：氟康唑；色谱法，高效液相；相对生物利用度；生物等效性 中图分类号：R978．5 文献标识码：A 文章编号：1009．0878(2006)03-0165-03 Bioequivalence0fDOmesticandImponedFlucOn毗OkCapsulesinHealthyVolunteers YuYang，zHANGYun．hao，WANCJin，HOUYan—ning(Dep8rtmentofClinicalPha珊8cology，BethuneInternationalPeaceHo叩italofPLA， Shijiazhuang050082，China) Abstract：objectiVe：ToinvestigatethebioavailabilityoftwobrandsofdomesticFluconazolecapsules(preparationAandB)inhealthymale volunteerssoastoevaluatetheirbioequivalencewithanimportedFluconazolecapsulesasreference(preparationR)．Methods：In83一prepa— rationand3-periodoptiInizedLatinsquaredesign，l8healthymalevolunteersweregivenasingleoraldoseof300mgtestorreferencecap— sules．TheconcentrationsofFluconazoleinhumanplasmaweredete珊inedwithHPLCmethodwithultra-violetdetector．ResuIts：Themain pharIIlacokineticparametersofthetestandreferencecapsules，preparationA，BandRwereasfollows：c。缸were(5．39±O．90)，(4．96± O．62)and(5．13±O．72)扯g／ml；t。“(1．6±0．9)，(1．7±O．7)and(2．2±O．8)h；AuCo．120hwere(215．8±31．8)，(207．5±37．1)and (213．5±38．5)pg·h·ml一1；AuCo．。were(237．8±39．O)，(232．4±52．O)and(234．O±48．7)斗g·h·ml‘1；tl／2were(34．7± 5．9)，(35．7±9．4)and(33．1±6．5)h，respectively．Therelativebioavailabilitiesofthetwotestdomesticcapsules，preparationAandB， were(102．5±15．8)％and(97．9±12．1)％，respectively．Conclusion：Thetwotestdomesticpreparations，AandB，werebioequivalentto theimportedref宅rencepreparation． KeywOrds：Fluconazole；Chromatography，high—ped-o瑚8nceliquid；Bioavailability；Bioequivalence 氟康唑(Fluconazole)为氟代三唑类广谱抗真菌 药，可高度抑制真菌的细胞色素P450酶，使真菌细胞 损失正常的甾醇而发挥抑菌作用。该药已在国内外上 市多年，具有口服吸收迅速、体内分布广、半衰期长、耐 受性好、不良反应少等特点⋯。本试验以辉瑞制药有 限公司生产的氟康唑胶囊(商品名为大扶康@)为参比 制剂，研究石家庄格瑞药业有限公司研制的两种氟康 唑胶囊A(为每粒50mg)、B(规格为每粒150mg) 在健康男性志愿受试者体内的生物等效性，为药品注 册和临床合理用药提供依据。 (上接164页)31(1)：113一114． [4]DuineJM，nocnF，cannMc，eI以．simultaneousmeasure— mentofmonoamines．theirmetab01itesand2．3．and2．5．di． hydroxybenzoatesbyHPLCwithelectrochemicaldetection． Applic8tiontoratbraindialysates[J]．JchromatogrBBi— omedSciAppl，1998，716：350·353． [5]李俊，汤晓林，徐叔云．高效液相电化学检测器检测大鼠 中枢单胺递质[J]．安徽医科大学学报，1996，31(4)：264- 266． [6]LakshmanaMK，RajuTR．Anisocraticassayfornorepineph— rine，dopamine，and5-hydroxytryptamineusingtheirnative [7] [8] nuorescencebyhigh—pedbrmanceliquidchromatographywith nuorescencedetectionindiscretebrainareasofrat[J]．Anal Biochem，1997，246：166一170． 张雷，卢英俊，邓同乐，等．高效液相色谱一荧光检测流速 梯度法测定去卵巢小鼠脑内单胺类神经递质[J]．色谱， 2005，23(1)：76-78． TasAC，0dinkJ，tne-Noever．de．BrauwMC，甜口Z．Derivatiza． tionandmassspectl．ometricbehaviourofcatecholaminesand their3一O—methylatedmetabolites[J]．JChromatogr，1984， 310：243-250． (收稿时间：2006_01．20修回时间：2006．03．20) 万方数据