阿司匹林对内毒素致热的家兔脑脊液中枢神经递质的影响

综合实验 性#实验# 目：阿司匹林解热时对家兔脑脊液中枢神经递质和发热介质的影响 单 位： 学 员 旅 一 队 专业班级： 2010级 学生姓名： 兰聪 学号： 3012010155 学生姓名： 彭景 学号： 3012010132 日 期： 2012年12月24日 阿司匹林解热时对家兔脑脊液中枢神经递质的影响 实验背景：阿司匹林是一类局悠久历史的解热镇痛抗炎药，在临床上广泛使用。其机制主要是非选择性抑制花生四烯酸代谢通路中的环氧酶cox，进而影响后续体温正向调节介质PGE的合成，下调体温调定点达到解热作用。但阿司匹林的应用也会产生很多的不良反应，如胃肠道反应、凝血障碍、过敏、瑞夷综合症和水杨酸反应。水杨酸反应表现为头痛、眩晕、恶心、呕吐、耳鸣、视力减退、听力减退。我们怀疑水杨酸反应的出现是因为阿司匹林改变中枢神经递质的浓度。因此本实验中我们测定阿司匹林用于解热抗炎时脑脊液中的中枢神经递质的的前后变化，进而为我们的猜想提供实验证据。 实验目的：研究阿司匹林解热时对家兔脑脊液中中枢神经递质的影响。 实验假设： 1） 脑脊液代替兔中枢神经递质的内环境 2） 以直肠温度作为兔的体温 实验对象：家兔 实验器材与药品：健康家兔50只、脂多糖；IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN、CRH、PGE2、AVP 放射免疫试剂盒、α-MSH ELISA（α-黑素刺激素）试剂盒、 电子体温计，高效液相色谱仪。 兔手术包：兔手术台, 立体定位仪, 麻醉穿刺包, 手术刀, 剪刀, 血管钳, 牙科钻, 缝针, 缝线, 牙科粉, 空针, Eppendorf 管, 2%碘伏, 消毒棉球, 20%乌拉坦注液, 实验原理：应用内毒素来复制家兔的发热模型，应用阿司匹林解热，通过取脑脊液来测定家兔中枢神经递质的浓度。在一定时间内每隔一段时间测量家兔体温，并通过导管抽取一定量的家兔脑脊液，运用试剂盒以及高效液相色谱来来测定各时间点家兔脑脊液中中枢神经递质和发热介质的浓度。最后将所得的数据做统计分析 ，找出受阿司匹林影响而发生显著变化的中枢神经递质。 实验步骤与方法： 1. 动物准备以及基础体温测定 动物饲养环境为常规日夜周期，单笼饲养，自由进食食物、水。实验前五天将家兔置于实验环境中并进行手术安好导管，然后后分笼饲养，模拟实验操作( 包括捉拿、固定、安放温度计) 以使其适应实验条件。实验前三天每天上午10 时用电子体温计记录直肠温度，所有探头均经温度计校正。测温时将兔置于固定盒中，温度计探头涂以石蜡油，插入肛门内10 cm 并用小夹固定于尾根部，待兔稳定后每1 h 记录直肠温度1 次共3 次，取3 d 的均值作为基础体温，选取基础体温在38． 5 - 39． 5 ℃的兔，第4 d 开始正式实验。 手术操作： 1.由耳缘静脉注入20%乌拉坦( 7 ml /kg 体重)麻醉兔后, 俯卧位固定于兔手术台上, 颅顶部剪毛,消毒手术野。 2．沿额顶正中线向枕骨隆突处纵形切开皮肤及皮下组织( 约1.5 cm) , 显露颅骨, 彻底止血。 3．手术者与助手固定头部, 在中线距枕骨隆突0.5 cm 的两旁约0.3 cm 处选择操作点( 注意避开已暴露的骨皮质内的血管) 。以牙科钻斜45°方向向下钻开颅骨, 以硬膜外导管向枕骨大孔方向置管( 带侧孔端进入约2.0 cm) , 见有清亮脑脊液顺管内流出, 以血管钳距颅骨5 cm 处夹管。 4.缝合皮肤及皮下组织, 将导管与兔毛一同固定, 防止兔头部甩动时导管脱落。将导管残端烧闭后再缝合固定在皮肤上, 防止兔清醒后抓挠脱落。 2. 模型复制及实验分组 用无热原生理盐水将内毒素配成1 μg /mL 悬液，按0.3 mL /kg 剂量经家兔耳缘静脉注射，建立合格的家兔发热模型。50 只家兔，每组10 只，随机分为对照组( 灌胃生理盐水10 mL/kg+耳缘静脉注射生理盐水0.3 mL /kg) 、发热组( 灌胃生理盐水10 mL /kg+耳缘静脉注射内毒素悬液0.3 mL /kg) 、阿司匹林1组( 灌胃阿司匹林10 mL /kg +耳缘静脉注射内毒素悬液0.3 mL/kg) 、阿司匹林2 组(阿司匹林10 mL/kg+耳缘静脉注射内毒素悬液0.3 mL /kg) 、阿司匹林3 组(阿司匹林10 mL /kg +耳缘静脉注射内毒素悬液0.3 mL /kg) 。先按分组予家兔阿司匹林溶液灌胃，然后立即耳缘静脉注射内毒素悬液0.3 mL /kg; 对照组家兔予生理盐水灌胃，然后立即耳缘静脉注射生理盐水0.3 mL /kg。 3． 指标 实验开始后，每1 h 记录肛温一次，共8h，体温变化值( ΔT) = 各时点体温－基础体温。按上述给药方法同样造模，并采集脑脊液，其操作如下： 1.采样时以剪刀剪除夹闭处, Eppendorf 管收集顺管内流出的脑脊液, 待采集量达到后继续夹管固定直至下次采集( 每次最大采集量为1.2 ml, 采集过程中不可轻易调整导管、更不可抽吸脑脊液, 防止颅内血管破裂造成血性脑脊液, 若每次采集量> 0.8 ml,最好不要短时间内重复采集) 。 2．将Eppendorf 管编号、置于- 70℃冰箱备用。 3．采用放射免疫法测定脑脊液中IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量和脑脊液中CRH、PGE2、AVP 的含量，采用ELISA 测定脑脊液中α-MSH 的含量，所有检测均严格按照试剂盒说明书进行。 4. 用液相色谱仪测定以下神经递质的浓度： 乙酰胆碱 单胺类：多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺 氨基酸类：谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸 肽类： 阿片样肽：β-内啡肽、脑啡肽和强啡肽 胃肠肽：胆囊收缩素（CCK）、促胰液素、胃泌素、胃动素、血管活性肠肽、胰高血糖素 其它：一氧化氮 4． 实验数据的统计学处理 4.1统计描述 各时间点每组的家兔的各指标表示成x±s的形式，并作图呈现。 4.2统计推断 4.2.1 检验发热模型是否复制成功，将对照组与发热组的各时间点体温进行两样本t检验，根据p值判断发热模型是否复制成功。 4.2.2 检验阿司匹林对中枢神经递质的影响，将各实验组的各时间点各指标测定值与发热组各指标进行多样本均数的F检验，以p纸大小判断组间差异。进而筛选出含量有显著差异的中枢神经递质。 实验误差来源： 手术操作会对家兔的机体造成不可预知的影响 参考文献： [1] 金惠铭，王建枝． 病理生理学［M］． 第七版． 北京: 人民卫生 出版社 [2] 凌宝东，药理学[M] 第七版 科学出版社 [3] 华峰, 刘军 . 连续、无血污染的兔脑脊液的采集. 南京医科大学学报( 自然科学版). 2008 年2 月.28(2):263-264 [4] 王娜 吴红海 侯艳宁 . 高效液相色谱一电化学法测定大鼠不同脑区的单胺类神经递质. 华北国防医药.2006年6月.18(3):162-165 [5] 放射免疫分析技术：http://wenku.baidu.com/view/d4c1144aa8956bec0975e344.html [6] 上海西塘生物科技有限公司： http://www.westang.com/