油红敏 蛋白质作业 答案

一、根据免疫共沉淀和pull down技术的原理分析其用途和优缺点（8分）。 答：1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。　其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 用途：这种方法常用于：①鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合；②也可用于筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点是：①相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；②蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。 缺点：①需要高质量的抗体进行IP； ②两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；③检测不到弱或瞬时的相互作用。 2、pull down技术是指: 用固相化的、已标记的诱饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质（诱饵蛋白）固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的蛋白。 用途：1.鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用2.筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质。 优点：①灵敏、周期短②不需要构建基因文库③抗体质量要求不高④可鉴定直接相互作用 缺点：需要纯化的蛋白。体外相互作用（假阳性、假阴性）。 二、简述药物蛋白质组学的定义及主要研究领域。试举例说明其在药物靶点的发现和确认中的应用（8分）。 药物蛋白质组学是在药物发现和发展中运用蛋白质组技术。利用蛋白质组学发现和确定所有可能的药物靶点以及这些靶点所有可能的化合物。在临床研究中，它包括在蛋白质分析的基础上应用特殊蛋白质作为治疗、诊断和疾病分型的标志。和药物基因组学、药物遗传学一起，药物蛋白质组学将在个性化药物的发展中发挥重要的作用。 药物蛋白质组学的研究领域 ：①临床前研究：发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物；应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；②临床研究方面：发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。 药物作用靶点（drug target）：具有重要生理或病理功能，能够与药物分子相结合并产生药理作用的生物大分子及其特有的结构位点。 举例 ：疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测 ：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针125I-DCG-04（偶联生物素）打靶，然后通过抗DCG-04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组；通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质—falcipain 1。从数据库筛选到falcipain 1的抑制剂YA29-Eps，结果证实YA29-Eps可阻断疟原虫的入侵红细胞。 三、简述蛋白质组学研究中常用的样品制备技术及2-DE技术的特点（10分）。 双向电泳是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。其原理是根据蛋白质的两个一级属性：等电点和分子质量，将一种蛋白质进行两次方向垂直的电泳将蛋白质分离开来。在第一个方向上按等电点的高低进行分离，称为等点聚焦；在与第一次电泳成直角的方向上按分子质量大小进行分离。其基本流程是：①蛋白质样品制备②第一向电泳(IEF) ③IPG胶条的平衡（IPG strip equilibration) ④第二向电泳（SDS-PAGE） ⑤胶上蛋白质的检测（staining） 样品制备是最关键的一步，2-DE常用的样品制备技术包括：激光捕获显微切割技术（LCM）、高丰度蛋白去除技术、自由流电泳技术（FFE） （1）激光捕获显微切割技术：是在显微状态或显微镜直视下，通过显微操作系统对欲选取的材料（组织、细胞群、细胞、细胞内组分或染色体区带等）进行切割、分离，获取均匀性很好的目标细胞，以用于后续研究的显微分离收集技术。 LCM 的特点：①、从任何组织中快速、精确地分离出 从任何组织中快速、精确地分离出纯纯的特异 的特异 细胞及细胞群。可以分离收集到核仁、包涵体 细胞及细胞群。可以分离收集到核仁、包涵体及染色体特异区带等细微的对象。 及染色体特异区带等细微的对象。 ②在组织细胞或染色体的原位取材，所取材料 、在组织细胞或染色体的原位取材，所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。 的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。 ③保证所取材料一定层次上的同质性。 FCM也是一种强有力的同质细胞分离技术，但是只能处理悬浮液中的细胞；而且， FCM需要各种特殊的标志物才能完成分离。 ④适用于苏木素伊红染色、免疫组化、荧光标记等多种染色方式，可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。 （2）高丰度蛋白去除技术： 抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白。 染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。 ⑶自由流电泳技术：在无固相基质的薄矩形分离腔中，以缓冲液为分离介质的电泳技术。能够分离各种带电样品，特别是蛋白质、蛋白复合体、膜、细胞器或完整的细胞。为蛋白质组学研究提供了一种高通量、高重现性、高灵敏度、操作简便快速的解决。 2-DE技术的特点：优点1）. 分辨率非常高，可以将上千种不同的蛋白质分离开来 ，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息。 3）.可检测翻译后和翻译过程的蛋白质修饰 4)对未处理样本耐受性好- 不需要预纯化 (如：色谱层析) 5)与后续分析技术兼容性好 (如. MDLC) 2）.如果双向电泳后续接一系列自动化操控，就能大大增加蛋白质分析与鉴定的能力 虽然双向电泳技术具有其他蛋白质分技术无可比拟的分离能力， 目前仍然存在着一些 术细节上的挑战和缺陷。主要有以下几个方面： 缺点：1蛋白样品制备效率偏低2疏水性膜蛋白的难于分离与检测3极端酸性或碱性蛋白质的难于分离4蛋白质的动态分辨率有待提高5自动化程度需进一步提高6蛋白质定量的准确性不高。另外还有.操作稍繁琐，试剂耗费量大、 成本高、 程序繁琐、 技术难 以掌握等缺点， 从而出现蛋白质斑点的拖尾、 粘连扩散和纹理现象等问。 四、如何鉴定亚细胞蛋白质组学研究中的样品纯度？（8分） 亚细胞蛋白质组是蛋白质组学领域中的一支新生力量,已成为蛋白质组学新的主流方向,通过多种策略和技术方法,一些重要的亚细胞结构的蛋白质组不断的得到分析,而且已经深入到亚细胞器和复合体水平;另外,不仅局限于对亚细胞结构的蛋白组成进行简单分析,而且更注重功能性分析,将定量技术和差异分析引入亚细胞蛋白质组学,来观察此亚细胞结构的蛋白质组在某些生理或病理条件下的变化,这已经成为亚细胞蛋白质组学新的发展方向. 亚细胞蛋白质组研究常用两种不同的技术策略对蛋白质进行鉴定：①基于胶体系的蛋白质鉴定策略； ②基于非胶体系的蛋白质鉴定技术路线，即多维色谱鉴定技术（鉴定技术（MudTIP ） 1、一般从三个方面对亚细胞器（线粒体）的纯度进行评价：①电子显微镜检测 ②标志酶活性测定③Western blot 五、为什么不能单从mRNA水平来探讨蛋白质的表达以及为什么需要以组学的研究方式来研究蛋白质？(10分) 答：1、不能单从mRNA水平来探讨蛋白质的表达原因如下： ⑴一个基因组对应着多个蛋白质组（动态的蛋白质组）⑵premRNA通过可变剪接生成不同的成熟mRNA ⑶mRNA表达：①与相应的蛋白表达存在时间上的差异 ②与相应蛋白执行功能的部位有所不同 ⑷不同mRNA的稳定性和翻译效率不同，有的甚至不翻译 5 基因和mRNA也不能反映 1 不同蛋白质间稳定性的差异（结构蛋白、信号分子）②不同蛋白质间修饰方式和程度的不同，而修饰（如磷酸化和糖基化）明显影响蛋白质的活性及功能③蛋白质之间的相互作用 。 另外mRNA翻译成成熟的蛋白质，要经过可变剪接和翻译后修饰。 可变剪接：premRNA经此可被剪成不同组合，进而翻译出不同的蛋白质。如此，同一基因可在不同时间/环境中选择性表达出不同蛋白质，以增加生理状况下系统的复杂性和适应力。 翻译后修饰：是指蛋白质共价加工的过程。翻译后修饰方式有400多种。常见的修饰方式有以下几点： 磷酸化—加入磷酸基团至丝、苏、酪、或组aa ；糖基化—将糖基加入天冬酰胺、丝或苏aa ；乙酰化—通常于蛋白质的N末端加入乙酰基；甲基化—在赖、精aa等的侧链氨基上加入甲基。 2、需要以组学的研究方式来研究蛋白质的必然性： 蛋白质组学指利用高分辨的蛋白分离技术和高效的蛋白鉴定技术，全景全息式地研究在各种特定情况下的蛋白质谱及其变化规律，包括蛋白质谱的组成成份、表达水平、修饰状态和蛋白质之间的相互作用等，以揭示蛋白质功能及其与生命活动的关系，即在蛋白质水平上整体、动态和定量地研究生物体。它是本世纪生命科学与生物技术的重要战略前沿、主要突破口和各国争夺最激烈的战略制高点之一 。要以组学的研究方式来研究蛋白质的必然性有以下几点： ⑴一种生命现象的发生涉及多个蛋白质 ⑵在执行生理功能时，这些蛋白质之间交织成网络，并且呈动态变化。 传统的对一种或几种蛋白质的研究难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动。所以，只能在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。 ⑶传统的对单个蛋白质的研究方式已无法满足后基因组时代的要求 。 ⑷相应支撑技术和条件的日渐成熟。 另外，基因组研究（如HGP）的具有一定的局限性。所以，蛋白质组学应运而生。 六、试述蛋白质组学研究的发展趋势和所面临的挑战（8分）。 蛋白质组学：利用高分辨的蛋白分离技术和高效的蛋白鉴定技术，全景全息式地研究在各种特定情况下的蛋白质谱及其变化规律，包括蛋白质谱的组成成份、表达水平、修饰状态和蛋白质之间的相互作用等，以揭示蛋白质功能及其与生命活动的关系，即在蛋白质水平上整体、动态和定量地研究生物体 随着蛋白质组学的快速发展及其在多个领域中的广泛应用，其研究的发展重点也逐渐发生了转变： 1）从全蛋白质组向锁定特定目标物的蛋白质组研究转变 (如亚细胞/功能蛋白质组学） 2）从定性描述向定量分析转变 3）由蛋白组研究向修饰蛋白组研究转变 4）由体外研究向体内研究转变 5）从实验室研究向临床应用拓展 6）数据产出由数量向质量转变 7）由简单积累向有效整合以及知识挖掘转变 8）发展新方法，同时，整合并存的各种方法，实现互补 9）蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源 2、面临的挑战：较基因组学更为复杂和困难： ①蛋白质数目大大超过基因数目 ②蛋白质表达（种类和量）随时、空而变 ③每一蛋白质并非只有一种分子实体（via PTM） ④没有PCR等价物，难以对低丰度蛋白/多肽进行分析和比较 ⑤氨基酸之间没有碱基之间的专一性互补配对关系 ⑥经过质谱鉴定的蛋白质还需要传统的方法来验证 因此，当前的主要任务:发展高通量、高灵敏度和高准确性的研究技术平台 3、蛋白质定量的难点：①低丰度蛋白质难于检测。 可忽略？NO！！！ ⑴其种类远多于高丰度蛋白质⑵往往与生物体功能的关系更密切 2 蛋白质表达量差异很小：差异在50%以下时，精确定量成为瓶颈 3 白质表达的瞬时性 解决办法：提高生物质谱分析能力；减少样品制备过程中蛋白质的损失;同时，要发展富集技术（对低丰度蛋白） 七、试简述Western Blotting 实验技术的一般流程(10分) Western Blotting技术：是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。 其原理是在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 一般流程：1、蛋白样品的制备：①水溶液提取法②低温有机溶剂提取法③水溶性多聚物沉淀法④ 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白 ①水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。 ②低温有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。 ③水溶性多聚物沉淀法 聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。 ④ 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白 重组蛋白质可利用融合蛋白质的特性进行纯化。 制备好蛋白样品需要进行蛋白定量：①紫外吸收法②Bradford法③其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。④凯氏定氮法⑤福林-酚法（Lowry法）、双缩脲法、 ①紫外吸收法：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各异，因此A280值不同。 ②Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) ③其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。 ④凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓NaOH作用，产生氨气，吸收于硼酸溶液中，用标准酸直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），换算出蛋白的含量。 ⑤福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。 2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳: 在不连续SDS-PAGE时,采用了两种缓冲液浓度、pH值和凝胶孔径。上层胶为pH6.8的浓缩胶（大孔径），下层胶为pH8.8的分离胶（分子筛）。 原理：蛋白质进行PAGE时，其迁移率取决于所带的净电荷量以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分子中的二硫键还原。 SDS使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。大量的SDS结合后，各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量。 SDS-PAGE 凝胶成份：丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）、TEMED、过硫酸铵（APS）、SDS、配胶的Tris缓冲液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 3、转膜 电转的膜有硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜 电转方法有湿转和半干转之分。需根据蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低来选择电转的条件。 ①湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。②半干法：用缓冲液湿润滤纸3张、膜、凝胶、缓冲液湿润滤纸3张顺序放置，电转10－30min。但高分子量的蛋白转移效率较低。 电转后需要用丽春红S染色,观察电转的效果。丽春红S染色： 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次，脱色；印度墨汁染色：只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 4、封闭 目的：防止抗体与膜的非特异性结合。 常用封闭液有：脱脂奶粉（5％）、BSA、Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 5、一抗杂交：把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。 洗膜：回收一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。 6、二抗杂交 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。洗去未结合的二抗：倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。一般来说，一抗多用兔抗和鼠抗，而二抗多用羊抗。 7、底物显色 常用的底物显色方法有：辣根过氧化物酶法（HRP）、碱性磷酸酶法（AP）、化学发光显色法(HRP) 原理：DAB、 ECL法都能达到纳克的要求。ECL是一种增强显色法，灵敏度要高，但显色麻烦，发表文章常用。 DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。 Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。 8、杂交结果的分析： 看目的条带的有无和染色程度阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定目的蛋白分子量 八、阐述血浆/血清蛋白组学研究中需要着重注意的问题（10分）。 1) 样品的选择 血浆和血清都可以用于常规的生化实验室检查，虽然大多数情况下用血清的比较多，但是多数情况下用血浆替换血清，结果差异不大。在蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异却很大，目前没有足够的资料表明选用血浆还是血清更为有利。 2) 样品的收集与贮存 ①收集管：商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定或数据；还可能含有一些促凝或抗凝物质；可能还会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆/血清中低丰度蛋白的鉴定。②抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度。③贮存：研究表明存放在室温下4小时或6小时，其变化很小，但8小时后、特别是24小时后质谱分析结果有明显变化。对于在4℃下的结果与室温下结果差不多,但随着时间推移到48小时或96小时，就有非常显著的变化；长期存放在-20℃，-80℃，或液氮中没有太大的变化，但反复冻融次数增加却有很大影响。 3) 去除高丰度蛋白 血浆中的高丰度蛋白在很大程度上干扰了低丰度蛋白的检测。因此，从血清/血浆中获得标志性蛋白质的首要的一步就是如何去除其中的高丰度蛋白。目前，对血清/血浆样品的处理一般的看法是，研究人员可以选择几种不同的分离和纯化技术，进行优化组合。目前市场上也针对种多元化（multi-pronged）策略推出了各种商品化的技术和方法，使得研究人员更方便地针对一些蛋白样品或者上游和下游技术设计实验。目前，利用亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离是主要的方法，常用的有基于抗体的亲和法和基于染料的亲和法。抗体亲和法利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白。染料亲和法通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除血浆中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。已有数种方法实现了商品化，分别可以去除2种、6种、12种或20种高丰度蛋白。 4) 分级技术 在使用蛋白质组学技术之前对血浆蛋白进行预分离，可以降低血浆样品的复杂度，改善2-DE分离血浆蛋白的效果，有利于分离鉴定血浆中的低丰度蛋白。常用的血浆蛋白预分离的方法包括二维液相色谱(2D LC)，尺寸排阻色谱/反相高效液向色谱(SEC／RP-HPLC)，阳离子交换色谱/反相高效液向色谱，二维毛细管电泳(2D CE)，Zoom IEF组分分离、Gradflow及自由流电泳（FFE）等。 5) 多维策略的运用 九、简述质谱仪的组成要件和以MALDI TOF MS获得PMF的分析流程（10分）。 质谱分析法是将化合物形成离子和碎片离子，按质荷比（m/z）的不同进行分离，来进行成分和结构分析的方法。质谱仪的构成：样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、计算机控制与数据处理。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。 PMF是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱，由于其具有特征性,所以称为指纹谱。PMF可用于蛋白质的鉴定，即用实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽指纹谱的蛋白质。如果在数据库中找不到，有可能是发现了新蛋白质，要进行序列分析，合成DNA探针来表达﹑分离和鉴定这一蛋白质。 MALDI的原理是利用一定波长的激光脉冲，在极短的时间间隔，对含被测样品靶物的一个微小区域提供高能量，从固相直接获得离子的电离方法。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。使用该仪器的步骤：①样品与基质混合并置于样品板上干燥 ②将样品板放入质谱仪的样品室 ③样品点被激光脉冲照射，解吸，离子化 ④离子被电场加速，进入真空漂移管 ⑤离子的m/z不同，飞行时间不同，先后到达检测器。 计算机工作站再对质谱仪的工作条件进行设定，对分析过程进行控制，对分析数据进行分析、贮存和再现。这样MALDI-TOF就获得了准确相对分子质量的质谱图。 十、简述蛋白质组学在心血管疾病中的应用（8分） 心脏和血管疾病（心血管疾病）是多种疾病的总称。包括动脉粥样硬化，冠状动脉粥样硬化症，冠状动脉硬化性心脏病，血栓阻塞部分心脏内的血液流动引起的心脏病发作，高血压病，风湿病，心力衰竭，心律失常，心脏瓣膜疾病，向大脑供血的血管发生阻塞引起的缺血性中风，大脑内的血管破裂引起的出血性中风等。 十一、英译汉（10分） 为了全面的研究原发性肝癌病人的自身抗体，我们应用了血清学以及蛋白质组学的方法学为基础。从原发性肝癌患者及正常对照组血清中孵育的HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中提取总蛋白，用2DE技术进行分离后转移至PVDF膜。最终我们鉴定了13个与原发性肝癌相关的抗原，其中8个蛋白的抗原性通过WB及蛋白芯片的重组蛋白进一步验证。在慢性肝炎对照组的抗原芯片的结果显示角蛋白8（keratin 8）及lamin A/C（层粘连蛋白A/C）的强信号；因此关于keratin 8及lamin A/C的自身抗体可能不属于原发性肝癌特异性抗体。在随后的分析中将这两种抗原去除。原发性肝癌中与死亡盒子多肽3、真核细胞翻译延长因子2、凋亡诱导因子、不均一核糖核蛋白A2、前列腺结合蛋白、磷酸丙糖异构酶的主动反应比慢性肝炎对照组及正常组明显升高。同时在原发性肝癌中与死亡盒子多肽3、真核细胞翻译延长因子2、凋亡诱导因子、前列腺结合蛋白的反应频率远远高于其他癌症。HCC第一阶段的单个抗原敏感性由50%上升至 85%。当六个抗原同时检测，其敏感性可以达到90%。由此我们得出结论：对以上6个蛋白的抗体进行检测对HCC的早期诊断具有价值。