MTT法检测国产PGA支架对人成纤维细胞增殖的影响_cropped

MTT法检测国产PGA支架对人成纤维细胞增殖的影响_cropped 法检测国产支架 M T T P GA 对人成纤维细胞增殖的影响 邓丹 武晓莉 许锋 高振 刘伟 崔磊 曹谊林 支架对瘢痕皮肤和肌腱成纤维细胞增殖的影响方法 体外培养人瘢痕皮肤和肌腱目的检测国产 摘要PGA 、。、 【】 成纤维细胞取第二代细胞接种到 孔板以不同浓度的国产 支架浸提液培养用 法检测成纤维细胞在国产, 96 , PGA , MTT 上的增殖情况结果 不同浸提液培养的瘢痕皮肤和肌腱成纤维细胞的生长曲线均无明显差异结论 国产 PGA 。、。PGA 支架对瘢痕皮肤和肌腱成纤维细胞的增殖无明显影响该材料可以用于以成纤维细胞为种子的组织构建、, 。 关键词瘢痕成纤维细胞 皮肤成纤维细胞 肌腱成纤维细胞 聚羟乙酸【】 MTT Assay For The Influence Of PGA Soakage On Human Fibr oblast Pr olifer ation DENG Dan, WU Xiaoli, XU 'Feng, GAO zhen, LIU Wei, CUI Lei, CAO Yilin. Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth Peoples Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200011, China. 【】 ， Abstr actObjective To examine whether domestic - made PGA scaffold affects human tennocytekeloid and skin ， fibroblast proliferation. Methods Human tennocyteskeloid and skin fibroblasts were cultured in vitro to passage two andseeded on 96 - well plate, cultured with different PGA scaffold soakages, and their effects on fibroblast proliferation were examined by MTT assay. Results There was no difference among cell growth curves of fibroblasts cultured by different ，soakages. Conclusion Domestic- made PGA scaffold does not affect human tennocytekeloid and skin fibroblast proliferation and can be used for tissue engineering with fibroblasts as seed cell. Poly glycolic acid(PGA) 【】 Key wor dsKeloid fibroblast; Dermal fibroblast; Tennocyte; 因其支架是一种可降解的生物支架材料分钟去除瘢痕疙瘩和皮肤组织的表皮黄色脂肪组PGA, 。、3 织和肌腱组织的腱鞘膜剪碎成 小块并置于, 2mm, 生物相容性好降解快广泛应用于组织构建但由 , , , 离心管内分别加入浓度为 和 50ml , 0.3%、0.1%0.15% 于该材料降解后形成酸性代谢产物 造成对细胞生,的混合型胶原酶 恒温摇床内 置于 , ?,?30ml37?长不利的酸性环境常具有一定的毒性甚至导致长 , , 期构建的组织在后期出现中空现象此外常用的 。, 离心小时小时后收集过滤后的消化悬液消化 2 ,3 , 多为进口因价格昂贵而致应用范围受到一定 PGA , 5洗涤并计数以 皿浓度接种于含有 的, 2×10/10%FBS 的限制本实验旨在探讨一种新型国产 支架对 。PGA 的培养皿过滤后的组织块则继续消化将收 DMEM , , 人瘢痕皮肤和肌腱成纤维细胞增殖的影响为以成 、, 集的细胞置于 培养箱进行培养每 天 37?、5%CO, 3 2 纤维细胞为种子细胞以该 为支架材料的组织 、PGA 换液待细胞增殖镜下达到 融合后传代取 , , 80,90%, 构建研究奠定基础。 第二代细胞进行实验研究。 分别称取 的国产 支架撕成细单 2mg、4mg PGA 根纤维并压制成小片状以丙酮浸泡清洗待其过夜 , , 材料与方法1 挥发干净后以 冲洗数遍酒精浸泡 分钟 PBS 、75%30 消毒后加入 培养液于 150μl DMEM+10%FBS , 37? 检测细胞及材料的制备1.1 下静置 小时制备浸提液各取瘢痕皮肤和肌腱 取手术中废弃的瘢痕疙瘩和皮肤肌腱分别来48 。、、, 3成纤维细胞 代制成密度为 的 第 P2( 2 ) 3×10/150μl 源于 岁女性岁男性和 岁女性患者以生理27 、22 19 , 细胞悬液分别接种入不同 孔板各孔加入 , 96 , 150μl 盐水冲洗再以 氯霉素溶液浸泡 分钟 , 0.25%20 ,30的细胞悬液每组各 孔培养 小时使细胞贴, 30 , 24 , 作者单位上海市 上海交通大学医学院附属第九人: 200011 民医院整复外科上海组织工程研究与开发中心 ; 壁然后弃原培养液每组的 孔细胞交换为 。, 10 4mg 浸提液另 孔交换为 浸提液作为实验组最 , 10 2mg ; 后 孔则用常规 培养液培养为对照组隔 10 DMEM , 天换液实验重复 次结果行配对 检验。2 , t 。 检测方法1.2 培养 天后各孔加入 液体2、4、6、8 , 5mg/mL MTT 小时然后取出培养板吸去孔内培 继续培养 15μl, 4 。, 养液加入 酶联免疫检测仪自动振摇 , 150μl DMSO, 培养板 分钟以 为参考波长测定吸光度值图 第 代肌腱成纤维细胞呈多角形胞浆丰富胞核稍小1 , 490nm 。 3 2 , , 相对较慢生长 天时细胞间大部分融合细胞亦向多个方向, 3 , 2.0 结果2 1.6 通过酶联免疫检测仪测定的 值进行绘图分OD , 析其生长曲线可见 瘢痕和肌腱成纤维细胞的实验, 1.2 值组和对照组均在 天内增殖不明显天后接近对数2 , 2 OD0.8 生长瘢痕成纤维细胞至第 天左右图 肌腱 , 5 ( 1、2) 、 成纤维细胞至第 天左右达高峰图 之后出现 6 ( 3、4) , 0.4 接触抑制皮肤成纤维细胞的实验组和对照组则在; 0 小时后即呈现对数生长图 天左右达 至第 24 ( 5、6) , 3 小时 天天天 天242 8 46 时间到高峰用 统计软件包对实验结果进行 检。Excel t 单纯2mg 4mg 三种细胞的实验组各组和对照组之间细胞增殖验 , 图 肌腱成纤维细胞的实验组和对照组均在 天内增殖不4 2 均无明显差异图 , p>0.05(1) 。 天后接近对数生长至第 天左右达到高峰 , 6 图 第 代瘢痕成纤维细胞呈长梭形胞核狭长增殖旺盛生长1 2 , , , , 第 代皮肤成纤维细胞呈梭形胞浆丰富增殖旺盛图 5 2 , , , , 天时细胞间融合细胞向多个方向排列密集 3 , 天时细胞间基本融合细胞排列相对有序 , 2.0 2.0 1.6 1.6 1.2 1.2 值值ODOD0.8 0.8 0.4 0.4 0 0小时 天天天天242 6 8 4 天小时 天天 天8 46 242 时间 时间 单纯2mg 4mg 单纯2mg 4mg 图 皮肤成纤维细胞的实验组和对照组均在 小时后即6 24 瘢痕成纤维细胞的实验组和对照组均在 天内增殖不明显图 2 2 , 2 数生长至第 天左右达到高峰 , 3 天后接近对数生长至第 天左右达到高峰之后出现接触抑制 , 5 , 浸提液用于培养细胞时的影响本实验应用 方, MTT 有一定的力学性能等目前可用于以成纤维细胞为种。[6]法在体外检测了国产 支架的浸提液对三种成 PGA 子细胞的组织构建的材料很多如聚乳酸聚羟 , (PLA)、纤维细胞增殖的影响结果证实基本无影响此外, 。, [1, 2]乙酸支架 明胶涤纶胶原和碳纤维等(PGA)、、、。PGA 评价材料是否适于组织构建除了测定其是否具有, [3]因其众多优越性在近年应用日趋广泛曹谊林等将 , 牛肌腱细胞种植于 网支架上体外培养 周后 PGA , 1 毒性以外 更为重要的是看该材料与种子细胞的生,再植入裸鼠皮下周后出现随支架走向呈线状排 , 6 物相容性是否良好 在后续的组织构建实验当中我[4],列的肌腱组织曹德君等应用鸡的肌腱细胞与 ; PGA [5]上的黏附伸展们发现三种成纤维细胞在该 PGA 、 , 在体外成功构建成肌腱样组织陈兵等用猪成纤维 ; 细胞与 形成复合物植入手术肌腱缺损部位构 PGA , 和生长均良好且基质分泌旺盛因此我们研制的 , 。, 建出与正常肌腱在大体形态组织学胶原排列及其 、、该新型 支架可以用于以成纤维细胞为种子细PGA 生物力学性能等方向均相似的组织工程化肌腱将 。 胞的组织构建。与 复合成 后改善了前者不易塑型PGA PLA PGLA 、 降解快的缺点可根据 的高降解速度及 的 , PGA PLA 参考文献高强度等以不同的组成比合成具有不同降解速度或 力学性能的 动物实验提示以碳纤维增强加 PLGA; , Liu Wei; Cui Lei; Cao Yilin. Recent advances in tissue 1 天然高分子胶原表面涂层的 作为支架与肌腱 PGA , engineering of cartilage, bone, and tendon. Cuur Opin in Orthopaedic,2004;15:364368.- 细胞联合体外培养可以成为一种永久性的有生命 , 曹德君曹谊林刘伟肌腱构建与组织工程技术研究新进展生 2 ,,.,活性的组织工程肌腱因此与这几种种子细胞 。, PGA 物医学工程与临床,2002;3:166- 169. 的复合都非常好是一种理想的生物支架材料然 , , Cao YL , Vacanti JP, Ma X, et al. Generation of tendon using 3 而目前市场上多采用进口 价格昂贵研究成 , PGA, , synthetic polymer seeded with tenocytes. Transplantation 本高限制了其在很多方面的应用我们与东华大学 , 。Proceeding,1994;26:33903392.- 合作开发的新型 在理化性能上与进口 几 曹德君翟华玲刘伟等体外构建组织工程化肌腱的初步研究PGA PGA ,,,.. 4 中华外科杂志 ,2004;2:110- 113.乎一致成本且大大降低购买方便若该国产 , , , PGA 陈兵丁小邦刘方军等皮肤成纤维细胞构建组织工程化肌腱 5 ,,,.能够代替进口 将有助于满足未来产业化需求PGA, 。 的初步研究中华医学杂志.,2002;16:1105- 1107. 王昕施嬿萍朱雪涛等法评价医用高分子材料的细胞毒 6 ,,,.MTT 性山东生物医学工程.,2003;1:46- 47. (收稿日期:2005 年 12 月 27 日) !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 页上接第 ( 17 ) 值为 左右时凝聚反应不完全并且在 pH 10 , HA , , [5][4]的溶解度最小热力学上最稳定我们通过优化 , 。应工艺制得可溶性钙盐和磷酸盐反应工艺一般 。 的滴加速度可以获得纯度较高的 Ca(NO), β- TCP 32 以 和为原料搅拌条件下将硝Ca(NO)(NH)HPO。 32 424 粉末。 酸钙溶液按一定的速度滴加到磷酸氢铵溶液中加, 入氨水调节溶液的 值经陈化过滤洗涤干燥pH 。、、、 煅烧成 粉末在实验中发现 的滴加 。β- TCP Ca(NO)参考文献32 速度直接影响粉末的最终纯度所以我们通过对不 。李世普生物医用材料导论武汉武汉工业大学出版社1 ..:,2000. 同 的滴加速度制备的粉体的比较得到合 Ca(NO), 32 李世普陈晓明生物陶瓷武汉工业大学出版社 2 , .., 27.适的 滴加速度通过实验得出当 Ca(NO)。, Ca(NO)32 32 3 Jarcho M, BolenC H. Hydroxylapatite synthesis and charaeterization 的滴加速度分别为 和 制备出的粉 150ml/h 200ml/h, in Dense Polycrystalline Form, JMater.Sci,1976;11:2027.- 末经 检测均为 粉体当 的滴 XRD β- TCP ; Ca(NO)32 韩颖超王欣宇李世普多孔 生物陶瓷人工骨制备工, , . β- TCP 4 加速度增加到 时制备的粉末经 检测 300ml/h , XRD 艺进展现代技术陶瓷 ., 2001;4: 16- 19. 刘昌盛沈卫顾燕劳胡黎明非陶瓷羟基磷灰石人工骨的研 为 的混合物这种现象的产生可能是由 , , , . 5 HA/β- TCP 。2+究化工进展., 1996;1: 10- 14. 于滴加速度太快使其局部的 浓度较高生成物, Ca, 收稿日期年 月 日(: 2006 1 9 )