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Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响

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Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响 Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬 功能的影响 256 [文章编号]1000-2200(2008)03-0256-04 JBengbuMedColl,May2008,Vo1.33,No.3 ? 基础医学? Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响 姜丽娜,姚春艳,金齐力,李柏青 [摘要]目的:用流式细胞术观察Thl型细胞因子IL-2和IFN.,以及1111细胞诱导因子IL.12对人外周血中性粒细胞吞噬功 能的影响.方法:用不同浓度异硫氰酸荧光素(FI...
Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响
Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响 Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬 功能的影响 256 [文章编号]1000-2200(2008)03-0256-04 JBengbuMedColl,May2008,Vo1.33,No.3 ? 基础医学? Th1型相关细胞因子对人中性粒细胞吞噬功能的影响 姜丽娜,姚春艳,金齐力,李柏青 [摘要]目的:用流式细胞术观察Thl型细胞因子IL-2和IFN.,以及1111细胞诱导因子IL.12对人外周血中性粒细胞吞噬功 能的影响.方法:用不同浓度异硫氰酸荧光素(FITC)在碳酸盐缓冲液(cB,pH9.5)和磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.2)中标记 大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌(金葡菌),流式细胞术细菌标记率.取新鲜健康成人外周血与标记细菌于37?孵育5 20min后,洗涤和溶血,用流式细胞术检测中性粒细胞吞噬百分率.或外周血预先分别与IL.2,IFN.及IL.12孵育2h,再加 标记细菌孵育5min,流式细胞术检测中性粒细胞吞噬率,并与对照组比较计算吞噬增加比率.结果:FITC标记大肠埃希菌在 碱性的cB中标记率较高,而金葡菌在中性的PBS标记率较高(P<0.01).健康人外周血中性粒细胞对大肠埃希菌和金葡菌 的吞噬率在5min时分别为45%和38%,15—20min达到平台期,分别为86%一88%和83%一89%.外周血预先用IL-2(20 u/m1),IFN一^y(50u/m1)或IL一12(30u/rn1)作用后,中性粒细胞对大肠埃希菌的吞噬率分别增加19%,19%和26%;对金葡菌 的吞噬率分别增加25%,23%和35%.结论:Th1型细胞因子IL-2,IFN.及Thl型诱导细胞因子IL.12均能增强人中性粒细 胞吞噬功能,11h1型细胞因子和IL-12均具有增强中性粒细胞功能的作用. [关键词]白细胞介素-2;干扰素-;白细胞介素一12;中性粒细胞;吞噬作用;流式细胞 术 [中国图资料分类法分类号]R392.12[文献标识码]A. InfluenceofThltyperelatedcytokinesonphagocytosisofhumanperipheralneutrophils JIANGLi—na,YAOChun—yan,JINQi—li,LIBai—qing (DepartmentofImmunology,BengbuMedicalCollege,AnhuiKeyLaboratoryofInfection andImmuniqatBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China) [Abstract]Objective:ToobservetheinfluenceofThlcytokinesIL一2,IFN 一,andThlinducedcytokineIL一12onthephagoeytosisof humanperipheralbloodneutrophilsusingflowe~ometry.Methods:Escherichiacoli(E.coli)andStaphylococcusaureus(S.aureus)were labeledwithdifferentconcentrationsoffluoresceinisothiocyanate(FITC)incarbonatebuffer(CB,pH9.5)orphosphatebuffersaline (PBS,pH7.2).TheFITClabelingratesofthetwobacteriaweremeasuredbyflowcytometry.Thewholefreshperipheralbloodofthe healthyadultswereincubatedwithFITClabeledbacteriafor5minto20minat37?,followed bywashingandlysingofredblood cells:Thepercentagesofphagoeytosisofbacteriabyneutrophilsweremeasuredbyfloweytometry.Thewholebloodwaspretreatedwith IL.2(20u/m1),IFN.-y(50u/m1)orIL.12(30u/m1)for2hoursbeforeincubationwithFITClabeledbacteriafor5minat37?.The incrementofphagoeytosisofbacteriabyneutrophilswasmeasuredandcalculatedincomparisonwithcontrolgroup.Results:The labelingrateofEcoliwashigherinalkalineCB.andthatofS.aureuswashigherinPBS.Thepercentagesofphagocyticneutrophilsfor EcoliandS.aureusat5minwere45%and38%,respectively,andreachedplateauat15minto20min,withthepercentagesof 86%一88%and83%一 89%forEcoliandSa/zFeus,respectively.PretreatedwithIL-2(20u/m1),IFN一(50u/m1)orIL一12(30u/ m1),thephagoeytosisratesforEcolibyneutrophilsincreasedby19%,19%,and26%,respecti vely;andthatforS.aureusincreased by25%,23%,and35%,respectively.Conclusions:ThltypecytokinesIL-2,IFN 一,andThlinducedcytokineIL一12canincrease humanneutrophilphagoeytosis,whichdemonstratesthatThltyperelatedcytokinesenhance theroleofneutrophilsininnateimmunity. [Keywords]interleukin-2;interferon一;interleukin一12;neutrophils;phagocytosis;flowcytometry 嗜中性粒细胞或多形核细胞(polymorphonuclear cells,PMN)是机体天然免疫的主要免疫细胞.机 体感染细菌时,PMN最先到达炎症部位进行吞噬, 将细菌消化分解,是机体抵御外来细菌人侵的第一 [收稿日期]2007—12—14 [基金项目]安徽省教育厅省高校重点实验室重点科研项目 (2004Sys008) [作者单位]蚌埠医学院免疫学教研室,安徽省感染与免疫重点实验 室,安徽蚌埠233030 [作者简介]姜丽娜(1979一),女,硕士研究生,讲师. [通讯作者]李柏青,研究生导师,教授. 道防线,PMN的吞噬作用构成了宿主抵抗细菌感染 的关键性机制'1,21.通常测定PMN对细菌的吞噬 百分率来反映PMN的免疫功能.以往研究资料表 明,除了抗体IgG和补体片段等调理素外,细胞因 子,特别是TH1型细胞因子如IFN一,也可显着增加 PMN对细菌的吞噬功能'3』.近年来也有研究报道 白细胞介素一15(interleukin一15,IL一15)对PMN的活 化和吞噬增强作用.白介素一12(interleukin一12, IL—l2)又名细胞毒淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocytematurationfactor,CLMF),或称自然杀伤 细胞刺激因子(naturalkillercellstimulationfactor, 埠医学院2008年5月第33卷第曼 NKSF),是促进Thl细胞分化的关键性细胞因 子].有关IL.12对中性粒细胞作用的研究不多, 本实验应用流式细胞术检测IL?2和IFN?,以及IL? l2对人外周血中性粒细胞吞噬大肠埃希菌和金黄 色葡萄球菌(金葡菌)的吞噬率变化,观察Thl型细 胞因子和Thl型诱导细胞因子对中性粒细胞吞噬功 能的影响. 1材料与方法 1.1试剂,细菌及器材异硫氰酸荧光素 (fluoresceinisothiocyanate,FITC)和二甲基亚枫 (dimethylsulfoxide,DMSO)购自Merk公司;金葡菌 由本院病原生物学教研室保存提供;大肠埃希菌 DH5o~由本教研室保存;重组人白细胞介素.2(rhIL? 2),长春长生基因药业股份有限公司产品;重组人 白细胞介素.12(rhIL.12)和干扰素一^y(IFN?^y), Perprotech公司产品;流式细胞仪,FACSCalibur,美 国BD公司产品. 1.2荧光素标记细菌的制备金葡菌和大肠埃希 菌用LB液体培养基培养,取对数生长期的金葡菌 或大肠埃希菌,3000r/min离心15rain,用磷酸盐 缓冲液PBS(pH7.2)洗涤2次.用PBS(pH7.2)或 碳酸盐缓冲液CB(pH9,9.5)配成浓度为5× 10/ml的悬液,加入DMSO配制的FITC溶液 (5mg/m1),FITC终浓度为2.5,l0g/ml,然后置 37?2h后,离心3000r/min,15min,弃上清,PBS 洗涤2次;加1%多聚甲醛(PFA)固定30min,PBS 洗涤2次,配成浓度为5×10/ml悬液,避光保存于 4?备用. 1.3流式细胞术检测细菌标记率用流式细胞仪 检测细菌的FITC标记率时,先设定FSC为E01和 Log,设定SSC为Log,然后在FSC/SSC二维点阵图 上检测细菌,选取细菌区域为Rl,然后在SSC(Log) 和FL1(FITC)二维点阵图上以细菌区域(R1)设门,检测FITC荧光强度,以确定细菌标记率. 1.4流式细胞术检测人PMN对FITC标记细菌的 吞噬率取健康成人新鲜抗凝全血加入流式管,每 管30l,置冰上10min,然后加入5×10/mlFITC 标记菌液每管30l,混匀,置37?水浴,5,20min 后迅速取出放入冰中10min,加冰冷的PBS洗涤 1次,弃上清,加入氯化铵溶血剂3ml,室温下放置 15min,离心,弃上清.冰冷的PBS洗涤1次,弃上 清,加入0.4%台盼蓝每管l0l10min,冰冷的PBS 洗涤2次,加1%PFA固定30min后用流式细胞仪 检测.同时设定单独全血对照组(空白对照),全血 257 加入未标记细菌组(阴性对照)和0oC15min对照 组.用流式细胞仪检测PMN吞噬率时,先在FSC 和SSC二维点阵图选取PMN区域,然后再以SSC 和FL1(FITC)二维点阵图检测FITC阳性的PMN 作吞噬细菌的PMN,每个样本测定10000个细胞 数,并照以下公式计算PMN吞噬率:PMN实际吞噬 率=37c【=吞噬率一0?吞噬率. 1.5细胞因子对人PMN吞噬功能的影响取健康 成人新鲜抗凝全血加入流式管,每管30l,分为对 照组和细胞因子处理组.对照组加入1640培养液, 细胞因子处理组均分别加入IL.2,IFN?^y和IL?l2,终 浓度依次为20u/ml,50u/ml和30u/ml,37oC水浴 2h,空白对照组加入未标记细菌每管30l,阴性对 照组和细胞因子对照组分别加入标记细菌每管 30l,37?孵育5min后,流式细胞术检测PMN吞 噬率,具体方法如1.4.同时计算细胞因子处理组 对吞噬率的增加百分率,计算方法:吞噬率的增加百 分率=(细胞因子处理组吞噬率一阴性对照组吞噬 率)/阴性对照组吞噬率×100%. 1.6统计学方法采用t检验,方差和q检 验 2结果 2.1标记条件对细菌标记率的影响用不同浓度 FITC标记大肠埃希菌和金葡菌时,发现除了FITC 浓度,不同缓冲液(pH值不同)对标记率也有不同 的影响.用FITC标记大肠埃希菌时,在CB缓冲液 (pH9.5)中,FITC浓度5g/ml即可使标记率达 80%以上;而用PBS缓冲液(pH7.2)标记率仅为 40%,FITC浓度增加到l0g/ml,标记率也仅为 54%;而金葡菌用PBS缓冲液作标记缓冲液时,标 记率可达81%,在CB缓冲液中标记率只在50%左 右,差异均有统计学意义(P<0.01)(见表1).细 菌FITC标记率的流式分析结果见图1. 表1不同细菌在不同缓冲液和不同浓度FITC标记细菌的 标记率(%)比较(n=5;4-s) 258 2.2人PMN吞噬荧光素标记细菌的时间动力学 人PMN与FITC标记大肠埃希菌和金葡菌在37? 水浴作用不同时间后,PMN的吞噬率随时间增加而 增加(P<0.01),15min吞噬率达到80%左右;15— 20min达到吞噬平台期(见表2).人PMN吞噬标 记细菌的时间动力学流式分析结果见图2. 2.3细胞因子对人PMN吞噬细菌吞噬率的影响 IL-2,IFN一和IL.12作用人PMN后,PMN吞噬大肠 埃希菌和金葡菌5min吞噬百分率和对照组差异均 有统计学意义(P<0.05一P<0.01),IL-2,IFN一和 IL一12对中性粒细胞吞噬功能均有增强作用(见表 3,4). 3讨论 中性粒细胞是机体最重要的炎性细胞,对炎症 的发生,发展及转归起关键作用.当外来病原菌 进入机体时,中性粒细胞就会向病原菌处集结,进行 吞噬活动,继而消化和降解病原体,发挥天然免疫清 JBengbuMedColl,May2008,Vo1.33,No.3 }'Ll-FITC A:CB缓冲液中未标记大肠埃希菌;B:CB缓冲液中 F1TC(10g/m1)标记大肠埃希菌2h后FITC阳性菌 比例:C:PBS缓冲液中未标记金黄色葡萄球菌;D: PBS缓冲液中FITC(10g,m1)标记金黄色葡萄球菌 2h后FITC阳性菌比例 图lFITC标记细菌流式分析图 表2人外周血PMN不同时间吞噬FITC标记的细菌吞噬率(%)比较(/"t=5;?s) q检验:与5rain比较P<0.Ol 0 0 大肠埃希菌0 0 大肠埃希菌0 0 0 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 表示37?吞噬率 表示0?15min吞噬率 图2人PMN吞噬荧光素标记细菌的时间动力学流式分析图 蚌埠医学院2008年5月箜鲞箜塑 表3细胞因子对人PMN吞噬大肠埃希菌吞噬率影响(n = 10) 表4细胞因子对人PMN吞噬金黄色葡萄球菌吞噬率的 影响(n=5) 除病原体的效应.中性粒细胞的吞噬功能又可被获 得(适应)性免疫的效应分子如抗体和细胞因子所 增强. 传统的检测中性粒细胞吞噬功能的方法是取外 周血与细菌混合作用后涂片染色,在显微镜下观察 和计算吞噬细菌的中性粒细胞的比例,一般要计数 200个以上细胞,操作烦琐,且易受主观因素影 响.本实验用荧光素FITC标记细菌,用流式细 胞术测定吞噬FITC标记细菌的中性粒细胞,测定细 胞数可在数千以上,快速,客观,重复性好.为排除 部分FITC细菌仅结合于细胞表面而被误测定为已 吞噬FITC标记细菌的中性粒细胞,可加入蓝作为淬 灭剂,以淬灭吞噬细胞表面的FITC标记细菌上的荧 光.本实验也发现,不加台盼蓝的细胞吞噬率明 显高于加台盼蓝的细胞吞噬率,故本实验采用台盼 蓝作为淬灭剂,以期把粘在细胞表面的荧光素标记 的细菌的荧光淬灭,而得到PMN吞噬率较为准确的 结果.实验结果表明,FITC对不同细菌在不同缓冲 液中标记的最适浓度在5g/ml左右,可使标记率 达到80%;人PMN对细菌的吞噬是一个非常迅速 的过程,5rain时吞噬率即达到40%左右,故本实验 将观察时间点置于吞噬百分率变化幅度较大时刻, 将5rain吞噬百分率作为IL-12影响中性粒细胞吞 噬功能的观察指标.在实验中,将IL.12与IL.2和 IFN-对PMN的吞噬细菌的吞噬率作比较,发现3 种细胞因子都可以增加PMN的吞噬功能,而三者之 259 间在本实验浓度时没有明显差异.实验中体会到, 由于中性粒细胞在体外容易发生凋亡或自溶,必须 严格控制实验温度,终止吞噬作用必须立即把样本 置入冰中,洗涤时用冰冷PBS,否则会影响到实验的 准确性. IL.12主要由树突状细胞,巨噬细胞,B淋巴细 胞及其它一些抗原提呈细胞产生,作用的靶细胞主 要是T细胞和NK细胞,具有促进NK细胞和T细 胞的增殖及杀伤作用,促使细胞因子分泌,诱导抗原 特异性辅助性T细胞(helperTcell,TH)向TH1分 化,对中性粒细胞产生细胞因子也有促进作 用],是连接天然免疫和获得性免疫的一个关键性 细胞因子.本实验结果证实,Thl型细胞因子IL-2 和IFN一及Thl型诱导细胞因子IL-12均能增强人 中性粒细胞吞噬功能,因此,Thl型相关细胞因子具 有增强中性粒细胞功能的作用,能提高机体非特异 性免疫功能,可以为临床抗感染辅助治疗提供依据. [参考文献] [1]SimmsHH,FrankMM,QuinnTC,ela1.Studiesonphagocytosisin patientswithacutebacterialinfections[J].',ClinInvest,1989,83 (1):252—260. [2]BurgND,PillingerMH.Theneutrophil:functionregulationin innateandhumoralimmunity[J].Chinlmmunol,2001,99(1): 7一l7. [3]ShalabyMR,AggarwalBB,RinderknechtE,eta1.Activationof humanpolymorphonuclearneutrophilfunctionsbyinterferon-and tumornecrosisfactors[J].',lmmunol,1985,135(3):2069— 2073. [4]Ratth~C,GirardD.Interleukin-15enhanceshumanneutrophil phagocytosisbyaSyk-dependentmechanism:importanceoftheIL- 15Rachain[J].',LeukocBiol,2004,76(1):162—168. 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