血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响_11

血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响_11 作者:陆敏 周娟 陆海英 王飞 刘煜敏 张悦 【摘要】 目的探讨血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)所致大鼠肾间质纤维化的作用及机理。方法雄性SD大鼠34只随机分为4组:正常组(6只)、假手术组(6只)、模型组(11只)、血府逐瘀胶囊 治疗 组(11只)，采用UUO法建立大鼠肾间质纤维化模型，造模次日予以血府逐瘀胶囊灌胃治疗，3周后血清肌酐和尿素氮含量，观察肾功能变化;取肾组织进行HE和六胺银染色(periodic acid-silver metheramine, PASM)，观察肾组织病理变化;采用Western blotting分别检测肾组织中磷酸化Smad2(phospho-Smad2，p-Smad2)，Smad2，Smad4，Smad7蛋白达水平，观察Smad信号通路分子表达水平的变化。结果与正常组和假手术组比较，模型组大鼠血肌酐和尿素氮含量显著上升;肾小管基底膜明显增厚，部分肾小管上皮细胞变性，肾小管扩张与萎缩并存，肾间质明显增宽，纤维组织增生，大量炎细胞浸润;p-Smad2和Smad2蛋白表达显著上调，Smad7蛋白表达显著下调(P<0.01)，而Smad4蛋白表达水平无明显差异。各项指标正常组与假手术组均无差异。血府逐瘀胶囊治疗后，大鼠血肌酐和尿素氮含量显著降低(P<0.05)，梗阻侧肾组织病理改变明显轻于模型组，p-Smad2和Smad2蛋白表达明显减少(P<0.05)，而Smad7表达没有明显改变。结论血府逐淤胶囊可通过抑制梗阻侧肾组织中Smad2蛋白的表达以及活化，减少Smad通路信号传导，从而改善梗阻性肾病模型大鼠的肾功能和肾间质纤维化程度。 【关键词】 血府逐瘀胶囊 肾间质纤维化 Smad通路信号分子 肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏疾病 发展 至后期的共同表现，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一。积极防治肾间质纤维化，对慢性肾脏疾病的转归具有重要意义。近年来的临床资料显示，血府逐瘀汤具有改善肾功能、防治肾纤维化发生、延缓肾功能衰竭的作用,1,，但其作用尚不明确。本实验应用血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻(UUO)所致肾间质纤维化大鼠进行干预，观察其疗效及作用机制，为血府逐瘀胶囊防治肾间质纤维化的临床应用提供理论依据。 1 材料与仪器 1.1 动物 雄性SD大鼠34只，SPF级，体重160,180 g，由 中国 科学 院上海实验动物中心提供，合格证号:SCXK(沪)2002-0002。 1.2 药物 血府逐瘀胶囊，购自天津宏仁堂药业有限公司，主要成分为桃仁、红花、当归、川芎、地黄、赤芍、牛膝、柴胡、枳壳、桔梗、甘草，用时将胶囊内药粉用蒸馏水配制成0.24 g/ml的混悬液。 1.3 试剂 血清肌酐检测试剂盒、血清尿素氮检测试剂盒(南京建 成生物工程研究所)， BCA蛋白浓度测定试剂盒(美国Pierce公司)，兔抗大鼠磷酸化Smad2多克隆抗体(美国Chemicon公司)，小鼠抗大鼠Smad2单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，小鼠抗大鼠Smad4单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠Smad7单克隆抗体(美国R&D公司)，辣根过氧化物酶耦联的小鼠抗兔GAPDH单克隆抗体(上海康成化学生物技术公司)，辣根过氧化物酶耦联的第2抗体(晶美生物工程有限公司)，ECL化学发光试剂盒(美国Pierce Pierce公司)。 1.4 仪器纯水系统(美国Labconco)，低温离心机(德国Eppendorf公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪及电转移仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像和图像仪(上海复日公司)。Centrifuge 5417R低温高速离心机(德国Eppendorf公司)。LeicaRM213切片机以及LeicaEG119自动包埋机(德国莱卡公司)。 2 方法 2.1 单侧输尿管梗阻动物模型的建立 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉，呈左侧卧位固定于手术板上，常规消毒，打开腹腔、腹膜，暴露并分离左侧输尿管，4,0缝合线在左输尿管上1/3处两次结扎，止血，抗感染，3,0缝合线连续缝合关闭腹腔，间断缝合皮肤。假手术组不结扎输尿管，其余操作过程均相同。正常组不做任何处理。 2.2 分组与给药 大鼠被随机分为正常组(n=6)、假手术组(n=6)、模型组(n=11)以及血府逐瘀胶囊治疗组(n=11)。治疗组于术后第2天以2.4 g/(kg?d)血府逐瘀药液灌胃，假手术组及模型组均以等量生理盐水灌胃，正常组正常饲养。实验期间动物自由进食饮水。治疗21 d后杀检，取材备用。 2.3 血清肾功能测定 分别采用苦味酸法和二乙酰-肟法测定大鼠血清肌酐以及尿素氮含量，严格按试剂盒说明书进行操作。 2.4 肾组织病理染色 取左侧肾脏1/4大小组织块，以10%中性福尔马林缓冲液固定，经常规脱水、包埋、切片后分别进行HE和PASM染色。 2.5 肾组织中Smad通路信号分子蛋白表达分析 采用Western blot法。取100 mg左右肾组织置于1 ml RIPA匀浆缓冲液中匀浆，离心(12 000 r/min，10 min，4?),留取上清，BCA蛋白检测试剂盒测定裂解液蛋白浓度。按比例加入适量6×SDS上样缓冲液，100?变性5 min，取30 μg的组织蛋白经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上(Pierce Chemical Company, USA，简称标本膜)。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭标本膜1 h，然后分别加入兔抗p-Smad2抗体(1?500)、小鼠抗Smad2抗体(1?1 000)、小鼠抗Smad4 抗体(1?200)、小鼠抗Smad7抗体(1?500)，4?孵育过夜，洗膜，再与相应的辣根过氧化物酶耦联的第2抗体室温作用1 h，充分洗涤后，用ECL试剂检测标本膜上的信号，X-片记录实验结果。以 计算 机成像和图像分析仪，测定X-片上杂交条带的光密度值，代表蛋白的表达量。同一张标本膜曝光后以0.5%十二烷基硫酸钠洗脱抗体，再与GAPDH抗体(1?5 000)孵育杂交，作为内参照。每个实验重复3批以上不同样本。 2.6 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件包进行ANOVA单因素方差分析。 3 结 果 3.1 大鼠体重增长、肾脏重量变化比较见表1。造模后大鼠体重增加明显低于正常组与假手术组(P<0.01)，治疗组体重增加高于模型组，但差异无统计学意义。留取左侧肾脏时发现，模型组与治疗组大鼠左侧肾脏较右侧明显增大，颜色变浅，有尿液潴留，肾皮质变薄，肾盂扩张。模型组与治疗组左肾肾体比及左右肾重比均显著高于正常组与假手术组(P<0.01)，模型组与治疗组无明显差异。正常组与假手术组体重增长、左肾肾体比以及左右肾重比均无明显差异。