抗SARS病毒融合蛋白单克隆抗体的制备与初步鉴定

药 　物 　生 　物 　技 　术 Pharmaceutical Biotechnology 　2006 ,13 (2) :091～094 抗 SARS病毒融合蛋白单克隆抗体的制备与初步鉴定 3 郑纪山1 ,李越希1 ,唐祖明2 ,高 　健1 ,周宗安1 ,邓小昭1 (1. 南京军区军事医学研究所 ,江苏 南京 210002 ;2. 东南大学分子与生物分子电子学实验室 ,江苏 南京 210096) 摘 　要 　用基因工程技术表达的 SARS2CoV S 蛋白片段和 N 蛋白片段的融合蛋白作抗原免疫 Balb/ c 小 鼠 ,将免疫鼠脾细胞与 Sp2/ 0 细胞融合 ,经 EL ISA 法筛选阳性克隆及测定效价 ,用免疫印迹法进行特异性鉴定。 最终获得 2 株 (1F11 和 3D2) 能稳定分泌抗 SARS2CoV 融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。其培养上清的 EL ISA 效价分别为 1∶1024 和 1∶512 ;腹水效价分别为 :1 ×1026 ,2 ×1025 。1F11 株识别融合蛋白上的 N 抗原表 位 ,3D2 识别其上的 S 抗原表位。该单抗可望成为快速诊断 SARS2CoV 感染的特异性抗体。 关键词 　SARS 病毒 ;融合蛋白 ;单克隆抗体 中图分类号 : R392. 11 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :100528915 (2006) 0220091204 　　严重急性呼吸综合症 ( Severe Acute Respira2 tory Syndrome , SARS) 是由 SA RS 冠状病毒 (SA RS2CoV)感染引起的传染性很强的急性呼吸 道传染病 ,临床表现为发热、咳嗽和呼吸困难等 ,严 重时可导致患者死亡[1 ,2 ] 。已有利用培养的病毒 建立免疫荧光检测法 ,也有采用 SA RS2CoV 的细 胞培养物或重组蛋白作抗原制备多克隆抗体或单 克隆抗体的报道 ( McAb) [3～5 ] 。本研究以重组的 SARS2CoV 的 N 蛋白片段和 S 蛋白片段的融合蛋 白[6 ]作抗原免疫小鼠 ,制备抗 SARS2CoV 的单克 隆抗体 ,并对其进行鉴定。 1 　材料与方法 1. 1 　材 　料 1. 1. 1 　实验动物 　6 周龄雌性 Balb/ c 小鼠由南 京军区实验动物中心提供。 1. 1. 2 　细胞系 　Sp2/ 0 骨髓瘤细胞引自南京医科 大学 ,由本室长期保存。 1. 1. 3 　主要试剂 　完全弗氏佐剂 ,不完全弗氏佐 剂 ,聚乙二醇 ( PEG ,分子量质 4 000) , HA T 及 H T 培养液 ( H :次黄嘌呤 ,A :氨基喋呤 , T :胸腺嘧啶核 苷) ,辣根过氧化物酶标记的 ( HRP2) 山羊抗小鼠 Ig G为华美生物工程公司产品 ,小鼠单抗 Ig 亚类 测定试剂盒 ( McAb Isotype) 为 Pierce 公司产品 , SARS2CoV Ig G抗体检测试剂盒 ( EL ISA) 为华大 吉比爱生物技术有限公司产品 ,低分子质量蛋白标 准为上海东风试剂厂产品。 1. 2 　方 　法 1. 2. 1 　抗原制备及抗原特异性 　重组 SA RS2 CoV S 片段和 N 片段的融合蛋白纯品制备见文 献[ 6 ] ,抗原纯度达 95 % ,相对分子质量约 60 000 , 蛋白浓度为 0. 5 mg/ ml。用纯化的 N 和 S 融合蛋 白包被聚苯乙烯板 ,检测 17 份抗 SARS2CoV 抗体 阳性血清 ,均呈阳性显色反应 ;检测 180 份正常人 血清均呈阴性反应 , 表明该抗原有较好的特 异性[6 ] 。 1. 2. 2 　动物免疫 　首次免疫以抗原加等量完全弗 氏佐剂乳化 ,腹腔注射小鼠 0. 2 ml/ 只 (抗原含量 约 30μg) ;间隔 1 个月以抗原加等量不完全弗氏佐 剂乳化 ,腹腔注射小鼠 0. 2 ml/ 只 ;于融合前 3 d 追 加免疫 ,尾静脉注射抗原 0. 1 ml。追加免疫与第 二次免疫的间隔至少 1 个月。 1. 2. 3 　细胞融合 　取免疫小鼠脾细胞 ,按 1∶4～5 的比例与 Sp2/ 0 骨髓瘤细胞融合 ,融合剂为 50 % PEG。融合后细胞转入含饲养细胞的微量培养板 中 ,加入 HA T 培养基进行选择培养。 1. 2. 4 　筛选 　用 EL ISA 筛选阳性孔 :将 SA RS2 CoV 融合蛋白抗原作 1∶400 稀释 ,宿主菌 BL21 大 肠杆菌超声粉碎 1∶500 稀释 ,分别包被聚苯乙烯板 (包被液用 p H 值 9. 6 的碳酸盐缓冲液) ;1 %牛血 19 3 收稿日期 :2005204225 　　修回日期 :2005207220 作者简介 :郑纪山 ,1951 年 5 月生 ,女 ,汉族 ,湖南汝城 ,研究员 ,硕士 ,从事病毒与免疫学研究 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 清白蛋白 (BSA) 封闭 ,经 Tween220/ PBS 洗涤后 , 分别依次加入杂交瘤细胞培养上清或诱生的小鼠 腹水 0. 1 ml/ 孔和 HRP2山羊抗小鼠 Ig G ,每次均 经 37 ℃孵育 30 min ,洗涤后 ,加底物 TMB 室温显 色 15 min ,2 mol/ L 的硫酸终止反应 ,Σ960 型酶标 仪测定 OD450值。结果判断 : SARS2CoV 融合蛋白 包被孔阳性 ,大肠杆菌包被孔阴性 ,是为 SARS2 CoV 单抗阳性 ;若两孔均为阳性 ,则为非特异性抗 体。对筛选出的阳性孔用有限稀释法进行克隆化。 1. 2. 5 　腹水制备 　建株的杂交瘤细胞扩大培养 后 ,注入经液体石蜡处理过的 Balb/ c 小鼠腹腔制 备单抗腹水。 1. 2. 6 　杂交瘤细胞染色体计数 　取生长良好的杂 交瘤细胞悬液 1 ml , 加秋水仙素至终浓度 0. 02μg/ ml ,室温作用 3 h 后 PBS 洗涤并离心除去 培养液 ,加 10 ml 0. 075 mol/ L KCl ,轻轻吹散沉淀 的细胞 ,室温放置 30 min 左右 ,离心弃上清 ,经固 定、滴片、Giemsa 染色 ,油镜下观察染色体并计数。 1. 2. 7 　McAb Ig 亚类测定 　按 McAb Isotyping 　试剂盒 ( I)说明书进行。系 EL ISA 法 ,所测小鼠 Ig 亚类包括 Ig G1 , Ig G2a , Ig G2b , Ig G3 , IgM , IgA , κ,λ。 1. 2. 8 　McAb 特异性测定 　①免疫印迹法 :将 SARS2CoV 融合蛋白纯品与大肠杆菌蛋白先作 SDS2PA GE ,再将蛋白转移至硝酸纤维素膜 (德国 , Schleicher &Schuell 产)上 ,2 % BSA 封闭膜后 ,将 膜按泳道剪开 ,分别加入不同株的 McAb 腹水 , 37 ℃反应 40 min ,加入 HRP2山羊抗小鼠 Ig G 抗 体 ,孵育并充分洗涤 , 加底物 DAB , 室温反应 30 min ,直至产生清晰的棕色条带 ,用蒸馏水冲洗 终止反应。②以 SARS2CoV Ig G 抗体 EL ISA 试 剂盒检测小鼠单抗 ,用 HRP2山羊抗小鼠 Ig G抗体 作二抗 ,观测其是否能与 SARS2CoV 抗原结合。 1. 2. 9 　抗原决定簇分析 　①与 S 蛋白的结合反 应 :用基因重组的 SA RS2CoV S 蛋白 (相对分子质 量 30 000 ,由本所基因工程研究室提供) 包被聚苯 乙烯板 ,依次加入阳性单抗样本和 HRP2山羊抗小 鼠 Ig G0. 1 ml/ 孔 ,每次均经 37 ℃孵育和洗涤 ,最终 加底物显色 ; ②EL ISA 阻断法。先将小鼠腹水用 Protein G 亲和层析法 ( Sigma 产品) 纯化获得抗 体 ,用改良的过碘酸钠法分别标记 HRP ,再以阻断 法测定 : SA RS2CoV 融合蛋白包被 ,BSA 封闭 ,分 别加入不同株的 McAb ,孵育、洗涤后 ,交叉加入不 同株的 HRP2McAb ,37 ℃孵育、洗涤后 ,加底物显 色 ,测 OD450值。 2 　结 　果 2. 1 　杂交瘤细胞株的建立 免疫脾细胞与 Sp2/ 0 融合后 , ,经 EL ISA 筛 选 ,获得 4 株阳性杂交瘤细胞株 ;经 2 次亚克隆 ,抗 体阳性率达 100 % ,最终获得 2 株产生抗 SA RS2 CoV 融合蛋白 McAb 的杂交瘤细胞株 ,分别命名 为 1F11 和 3D2。其培养上清的 EL ISA 效价分别 为 1∶1024 和 1∶512 ;腹水效价分别为 1 ×1026 ,2 × 1025 。2 株细胞经连续 2 个月的体外培养 ,6 个月 内冻存、复苏 2 次 , 均生长良好并稳定分泌抗 SARS CoV 融合蛋白的 McAb。 2. 2 　杂交瘤细胞的染色体计数及 McAb Ig 亚类 鉴定 2 株杂交瘤细胞株的染色体计数符合杂交瘤 细胞株的规律 (872110 ,平均 92/ 细胞和 97/ 细胞) , 2 株 McAb Ig G亚类均为 Ig G1 ,轻链均为κ链。 2. 3 　特异性试验 　　(1)用 SDS2PA GE 所作的参照试验 　(图 1) 表 明所用的纯品 SARS CoV 融合蛋白为单一蛋白带 , 其相对分子质量约为 60 000 ,与文献[6 ]报道一致 ; 1. Protein marker ; 　2. SARS2CoV fusion protein ; 　3. The lysis supernant of t he E; coli protein Fig 1 　Analysis of the SARS2CoV fusion protein by SDS2PA GE 29 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 2 期　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 而宿主菌大肠杆菌的可溶性蛋白为多条带 ,但在 SARS CoV 融合蛋白区处无明显条带。免疫印迹 法示 2 株 McAb 均与 SARS CoV 融合蛋白产生特 异性结合反应 ,在相应的位置上出现底物沉淀的棕 色条带 (图 2) ,而与大肠杆菌的可溶性蛋白不产生 反应。(2)用 SARS2CoV Ig G抗体 EL ISA 试剂盒 检测小鼠单抗 ,显示两株 McAb 均能与病毒抗原 结合。 Fig 2 　Western blot analysis of binding of 2 st rain McAbs with SARS 2CoV fusion protein. 2. 4 　抗原决定簇分析 2. 4. 1 　在 EL ISA 阻断法实验中 ,两株单抗均不能 阻断另一株的结合显色反应 ,表明 1F11 和 3D2 分 别识别 SARS2CoV 融合蛋白上不同的抗原表位。 2. 4. 2 　在与 S 蛋白的 EL ISA 结合反应实验中 , 3D2 株单抗显示阳性 ,而 1F11 株阴性 ,进一步证 明 3D2 能够识别其中的 S 蛋白 ,而 1F11 则可能识 别其中的 N 蛋白。 3 　讨 　论 由于 SA RS 传染性强和死亡率高 ,正确并迅 速地诊断以利于早期隔离和早期治疗病人显得至 关重要。尽管生物信息学分析 , SA RS2CoV 与其 它冠状病毒的同源性较低 ,不足 30 %[7 ] ,但可能正 是由于这种同源性 ,用细胞培养的全病毒作检测试 剂 ,有可能引起假阳性。 SARS2CoV 是一种新的冠状病毒 ,其基因组 包含 5 个主要的开放阅读框架 (ORFs) ,分别编码 复制酶蛋白、S 蛋白、E 蛋白、M 糖蛋白和 N 蛋白 , 这些蛋白的顺序和大小都和其他冠状病毒差不多 ; SARS2CoV 目前尚属较稳定的病毒 ,此点有利于 疫苗研制和检测试剂的建立 ,近来更有人尝试用异 种抗血清作 SARS 治疗的体外实验。N 蛋白是 SARS2CoV 主要结构蛋白之一 ,由于它的强免疫 原性 ,在刺激肌体免疫反应中有着重要的作用[ 7 ] ; N 蛋白还具有较高的保守性 ,不同病毒株间的变 异性较小 ,是试剂研制中理想的抗原蛋白。SA RS2 CoV 表面蛋白中的 S 蛋白 ,则是与宿主细胞受体 结合并介导病毒包膜与宿主细胞膜融合的成分[ 8 ] , 封闭该蛋白的结合位点可阻止病毒感染细胞 ;S 蛋 白同时也是重要的毒力因子。所以 S 蛋白既是重 要的抗原蛋白 ,又是疫苗研制的首选蛋白。 我们曾经通过计算机分析 ,初步确定含特异性 抗原表位的 SA RS2CoV 的 N 蛋白片段和 S 蛋白片 段 ,并通过基因合成、融合表达了该强势抗原 (共 560 个氨基酸 ) [ 6 ] 。本研究即采用这种重组的 SARS2CoV 的 S 蛋白片段和 N 蛋白片段的融合蛋 白作抗原 ,通过免疫 Balb/ c 小鼠的脾细胞与小鼠 骨髓瘤细胞融合获得了 2 株抗 SARS2CoV 的 McAb。鉴定结果表明这 2 株 McAb 不仅与重组 SARS2CoV 融合蛋白反应 ,亦可与 SARS2CoV 抗 原发生反应。抗原表位实验表明 1F11 株抗体能 够识别 SA RS2CoV 的 N 蛋白 ,另一株单抗 (3D2) 则能够与 S 抗原发生特异性结合反应 ,为检测试剂 的建立奠定了良好的基础。但遗憾的是 ,在体外阻 断 SARS2CoV 感染 Vero2E6 细胞的试验中 ,该抗 体未能阻断 SARS2CoV 感染细胞。提示该融合蛋 白中的 S 片段虽有良好的抗原性 ,却非保护性抗原 片段[6 ] 。 参考文献 [ 1 ] Ksiazek T G , Erdman D , Goldsmit h CS , et al . 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The specific McAbs were screened by EL ISA and identified by western blot . Two hybridoma cell lines (1F11 and 3D2) se2 creting specific McAbs to SA RS2CoV were selected and determined to recognize different epitop s on S and N protein f usion protein. The titers of t he two clones were as t he following : 1 :1024 , 1 :512 (super2 nant) ; 1 ×1026 ,2 ×1025 (A F) . McAbs 1F11 recognize the epitope on N protein , whereas 3D2 recognize t he epitope on S protein. This result suggested t hat specific McAbs could be used for developing diagno2 sis reagent . Key words 　SARS2CoV , Fusion protein , Monoclonal antibody ·信　　息· 2006205 　细胞色素 P450 酶系与除草剂代谢 　细胞色素 P450 是广泛存在于动物、植物和微生物体内的一类具有混合 功能的血红素氧化酶系。它不但能够催化苯丙烷类、萜类化合物和脂肪酸等内源性物质的生物合成 ,而且参与许多外源性 物质包括除草剂等的生物氧化。综述了代谢除草剂的细菌、哺乳动物和植物细胞色素 P450 酶系 ,概述了细胞色素 P450 酶 系参与除草剂代谢的作用方式 :脱烷基化作用、环甲基化羟基化作用和芳环的羟基化作用等。这些细胞色素 P450 酶系在 培育除草剂抗性作物、生物安全和生物修复方面表现出了巨大的潜能。 2006206 　转基因生物及其产品的发展现状与安全管理 2006207 　山西全面启动转基因生物及制品标识管理 2006208 　我国发放首批 5 个转基因生物进口安全证书 2006209 　转基因植物安全性及检测技术研究进展 2006210 　生物安全问题及其对策 2006211 　生物工程实验室与转基因植物的安全性 2006212 　转基因农作物种子的应用及检测研究现状 2006213 　稀土元素的生物安全性探讨 49 药 物 生 物 技 术 第 13 卷第 2 期　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net