6_分子生物学研究方法(下)2

null6 分子生物学研究方法（下） ——基因功能研究技术6 分子生物学研究方法（下） ——基因功能研究技术6. 1 基因表达研究技术6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1 基因表达系列技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE） 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例 可分析所对应基因的表达频率。null图6-1常规SAGE方法（short SAGE）基本流程nullLongSAGE技术 标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。6.1.2 RNA的选择性剪接技术6.1.2 RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。可分为：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。null图6-2选择性剪接的不同类型平衡剪接3’选择性剪接外显子遗漏相互排斥性剪接5’选择性剪接null图6-3 RT-PCR5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切null图6-4果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体6.1.3原位杂交技术6.1.3原位杂交技术原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为 RNA原位杂交 染色体原位杂交。nullRNA原位杂交：用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。nullmRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。负对照，mRNA的 同义链,无杂交信号。正对照，UBQ10 杂交信号遍布于 整个胚珠。图6-5 用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达null荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH).首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。6.1.4基因定点突变(site-directed mutagenesis).6.1.4基因定点突变(site-directed mutagenesis).通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。null图6-6寡核苷酸介导的DNA突变技术null目前，主要采用两种PCR方法， 重叠延伸技术 大引物诱变法， 在基因序列中进行定点突变。null图6-7重叠延伸介 导的定点诱变null图6-8大引物诱变法示意图PCR介导的定点突变方法的优势PCR介导的定点突变方法的优势1.突变体回收率高 2.能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变 3.可在同一试管中完成所有反应 4.快速简便6.2基因敲除技术6.2基因敲除技术6.2.1基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。null基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。null基因敲除分为 完全基因敲除：是指通过同源重组法完全 消除细胞或者动物个体中的靶基因活性 条件型基因敲除：（又称不完全基因敲 除），是指通过定位重组系统实现特 定时间和空间的基因敲除。null噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。null图6-9用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验1. 完全基因敲除null图6-10正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞nullnull由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5，即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞中筛选出真正发生了同源重组的胚胎干细胞，得用多种分子筛选技术验证所获得的确实是目的基因被敲除的细胞系。null①构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点。 ②需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交，Cre可把两个LoxP位点间的DNA片段切除，导致靶基因失活。也可用Cre表达质粒转染中靶ES细胞，通过重组将两个LoxP位点间序列删除（包括neo基因）。2. 条件型基因敲除nullnull6.2.2高等动物基因敲除技术6.2.2高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。null图6-12模式动物小鼠中 完全基因敲除的主要技术策略与应用。null图6-13 基因捕获法原理示意图null显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。6.2.3植物基因敲除技术 6.2.3植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。null图6-14植物基因敲除 及突变体筛选a.引物设计。LP和 RP分别代表插入基 因两端的引物，LB 是指载体上的一段 引物，目的基因片 段(设为900bp)。旁 邻序列是经测序后 获得的DNA序列。 b，PCR产物电泳结 果。分别代表野生 型、杂合子和纯合 子PCR条带。6.3蛋白质及RNA相互作用技术6.3蛋白质及RNA相互作用技术6.3.1酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。null将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription-activating domain,AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。null图6-15酵母单杂交的基本原理示意图null图6-16从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的 转录因子示意图。6.3.2酵母双杂交系统 （Yeast two-hybrid system）6.3.2酵母双杂交系统 （Yeast two-hybrid system）真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。nullBD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。null图6-17酵母双杂交技术原理示意图6.3.3体外蛋白质相互作用技术6.3.3体外蛋白质相互作用技术1、Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。null图6-18 Far Western印 迹试验2、GST融合蛋白沉降技术2、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。null图6-19 GST融合蛋白沉降技术流程。3、蛋白质芯片技术3、蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。null4、等离子表面共振技术4、等离子表面共振技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。null图6-21等离子表面共振技术示意图5、免疫共沉淀技术5、免疫共沉淀技术将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。null靶蛋白抗体固体基质待筛选蛋白低离心力沉淀或微膜过滤亲和反应反应体系靶蛋白抗体待筛选蛋白相互作用沉淀得到待筛选蛋白图 6-22 免疫共沉淀 示意图6.3.4细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET）6.3.4细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET）FRET荧光能量转移有三个基本条件： （1）给体与受体在合适的距离（1～10nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。nullFRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。常用的探针有： 荧光蛋白 传统有机染料 镧系染料null荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。 传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。 镧系染料，金属染料。一般与有机染料联用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。null图6-23荧光共振能量转移法6.3.5 RNAi（RNA interference,RNA干涉）技术及其应用6.3.5 RNAi（RNA interference,RNA干涉）技术及其应用RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的论文。null研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA,single-stranded RNA）的降解。经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标mRNA。nullsiRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。null图 6-24 RNAi作用机制示意图。6.4基因芯片及数据分析6.4基因芯片及数据分析基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。6.4.1 基因芯片技术原理6.4.1 基因芯片技术原理把大量已知或未知序列的DNA片段点在尼龙膜或玻璃片上，再经过物理吸附作用达到固定化。也可以直接在玻璃板或金属表面进行化学合成，得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到成千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式。null6-25基因芯片技术流程图1.简易基因芯片1.简易基因芯片使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达调控情况。null简易芯片一般基因数量少（一般不超过2000），主要用于研究小部分特定基因的表达状态。可用手工制作或者机械手点样。null图6-26包 含280个棉花cDNA的 简易芯片的杂交图谱。2.大规模基因芯片2.大规模基因芯片通常涉及基因组规模与数量（一般大于10000个基因），分别采用接触式点样，非接触式点样或者半导体技术制备样品。null基因芯片的工作流程： （1）经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段。 （2）用机械手将PCR产物点在玻璃板上，变性，固定。 （3）分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成cDNA。 （4）用不同的荧光染料标记不同器官或组织的cDNA。 （5）将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 （6）激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 （7）分析芯片杂交数据。null大规模基因芯片的应用3.微珠芯片技术3.微珠芯片技术在包含50000根光纤的直径为3.5mm光纤束中，每根光纤顶部蚀刻出的小洞可镶嵌3μm的微磁珠，每个微磁珠上可据要求连接不同的配体。配体可与荧光标记的配体发生相互作用，发生的信号被激发后通过光纤传递到检测器。nullnull微珠芯片的优势： （1）密度高 （2）测试重复性好 （3）定制方便微珠芯片的用途： （1） SNP及基因型分析 （2）基因表达谱分析 （3）蛋白组学研究6.4.3 基因芯片数据分析6.4.3 基因芯片数据分析数据可靠性分析 生物学意义分析null1.数据可靠性分析 通过两次平行杂交反应，将每个基因在两个反应中的表达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结果都在45º斜线附近，就说明实验结果是可靠的。 多个持家基因作为内对照，持家基因的反应信号在两种组织中不变，可确定其他基因表达信号的相对值。nullnull2.生物学意义分析 主要指通过分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义。 将差异表达定位于不同的生物化学代谢途径，研究基因芯片数据中可能具有生物学意义的代谢途径。6.5 利用酵母鉴定靶基因功能6.5 利用酵母鉴定靶基因功能6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介 酵母菌是单细胞真核生物，具有与动植物细胞相似的结构特征。 酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞，是最早完成基因组DNA全序列测定的真核生物。 导入酵母细胞中的DNA即能以自主复制的分子形式存在，也可被整合到基因组的方式存在。 酵母中转化DNA的整合重组主要通过同源重组方式进行，整合效率较高。null酵母单倍体和二倍体的重大差异： 二倍体细胞直径大约是单倍体的1.3倍。 二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体细胞通常接近圆形。 二倍体细胞按极性方向出芽，单倍体细胞按轴线方向出芽，即出芽方式不同。 nullnull酵母细胞有三种交配型： MATa MATα MATa/α 二倍体 不能与前两种中的任何一种细胞交配单倍体null二倍体酵母细胞在营养缺乏的条件下能通过减数分裂形成单倍体的孢子。 从单个孢子来源的所有细胞都带有一套相同的染色体DNA。null6.5.2 酵母基因转化与性状互补6.5.2 酵母基因转化与性状互补利用Yip可以对酵母基因组中的任意基因进行精确的敲除（置换），带有致死位点和可能的外源功能互补基因的酵母二倍体细胞在饥饿条件下形成四分体孢子，通过四分体分析技术进行观测和研究。如果引入的外源基因具有互补突变点的功能，含有突变基因的单倍体可以存活，否则就不能存活。nullnull基因置换法： 一步置换法 两步置换法null图6一32 “一步置换法”制备醉母缺失突变体的流程图null6.5.3 外源基因在酵母中的功能鉴定6.5.3 外源基因在酵母中的功能鉴定将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化野生型或突变酵母菌株，通过观察酵母的表型变化或分析细胞中化学成分的变化即可推测该基因的生物学功能null6.5其它分子生物学技术 1凝胶滞缓实验 凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobilit shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。null在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。null方法：同位素标记待测的DNA片段细胞提取物DNA-蛋白质复合物探针DNA温育PAGE电泳放射自显影进行DNA凝胶分析 null拟南芥转录 因子与不同 DNA元件 有不同的结 合能力。2噬菌体展示技术2噬菌体展示技术噬菌体是细菌病毒的总称，英文为Bacteriophage，来源于希腊文“phagos”，有“吞噬”之意。噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。null溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有这种溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。null噬菌体展示技术的基本原理是将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。null图6-36噬 菌体展示 技术研究 蛋白质相 互作用。null蛋白质磷酸化分析技术由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。null蛋白激酶底物蛋白发生磷酸化蛋白质磷酸酯酶底物蛋白发生去磷酸化ATP或GTPγ磷酸基团转移到底物蛋白磷酸化与去磷酸化null蛋白质磷酸化研究方法（电泳法）底物蛋白待检测的蛋白激酶上样电泳聚合到SDS-聚丙烯酰胺凝胶凝胶洗去SDS使蛋白质复性加γ-32P-ATP反应液孵育12h后三氯乙酸终止反应放射自显影检测 32P标记的γ集团结合的底物蛋白null图6-38蛋白激酶体外磷酸化活性分析