试题一植物病原菌种类之判别

试题一植物病原菌种类之判别 【試題一】植物病原菌種類之判別 組別, 總分25分 實驗背景 病毒可以危害動物、植物造成嚴重病狀,而檢測造成危害之病毒的種類為重要研究之一,利用血清學之技術,酵素連結免疫法,普遍被使用方法之一。酵素連結免疫吸附法,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, 簡稱ELISA,利用抗原、抗體之間專一性鍵結之特性,對檢體進行檢測,由於結合於固體承載物(塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍具有免疫活性,因此經過鍵結後,配合酵素呈色反應,即可顯示特定抗原是否存在,可進行定性分析,或利用呈色之深淺,藉由酵素免疫微盤分析儀,ELISA reader,測定塑膠盤中的吸光值(OD值),可進行定量分析。 595 nm 操作步驟為: 1. 將待測檢體固著,coating,於塑膠孔盤上,經靜置後洗去多餘檢體。 2. 加入一次抗體,檢體中若含有待測之抗原,則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一 性鍵結。 3. 經靜置後洗去多餘未鍵結一次抗體後,加入帶有酵素之二次抗體,與一次抗體鍵 結。 4. 經靜置後洗去多餘未鍵結二次抗體,加入酵素受質使呈色反應,以肉眼觀察呈色 結果或以儀器讀取塑膠盤中的吸光值(OD值),實驗組OD值大於對照組OD595 nm 值兩倍以上,視為正反應。 今有蘭花農民發現培育的蝴蝶蘭葉片,產生嵌紋病毒感染病徵,送請檢驗機構以酵素連結免疫吸附法,ELISA,檢測。 1. 檢驗機構用三種抗體,抗體1,東亞蘭嵌紋病毒抗體,,抗體2,,胡瓜嵌紋病毒 抗體,,抗體3,齒舌蘭輪班病毒抗體,依上述步驟進行檢測,經加入酵素受質 使呈色反應,經過20、40、60分鐘以酵素免疫微盤分析儀,ELISA reader,判讀, 其結果如表一所示,請就表一結果作定性分析。 1 組別, 表一、蝴蝶蘭葉片產生嵌紋病毒病徵樣品,以不同抗體進行酵素連結免疫吸附法 ,ELISA,檢測結果 OD值 判讀時間 抗體1,1 µg/ml, 抗體2,1 µg/ml, 抗體3,1 µg/ml, (分鐘) 檢測樣品 對照組 檢測樣品 對照組 檢測樣品 對照組 20 0.05 0.04 1.20 0.02 0.30 0.02 40 0.04 0.03 2.01 0.08 0.50 0.05 60 0.03 0.02 2.82 0.14 0.65 0.06 2. 檢驗機構用抗體2,胡瓜嵌紋病毒抗體,,亦進行酵素連結免疫吸附法不同抗體濃 度試驗,分別用1 µg/ml、0.5 µg/ml、0.25 µg/ml、0.12 µg/ml抗體濃度進行檢測, 經加入酵素受質使呈色反應,經過20、40、60、80分鐘以酵素免疫微盤分析儀 ,ELISA reader,判讀,其結果如表二所示,請就表二結果作定量分析。 表二、蝴蝶蘭葉片產生嵌紋病毒感染病徵樣品,以不同抗體濃度進行酵素連結免疫 吸附法,ELISA,檢測結果 OD值 判讀 抗體濃度 抗體濃度 抗體濃度 抗體濃度 時間 ,1 µg/ml, ,0.5 µg/ml, ,0.25 µg/ml, ,0.12 µg/ml, (分鐘) 檢測 對照 檢測 對照 檢測 對照 檢測 對照 樣品 組 樣品 組 樣品 組 樣品 組 2 20 1.2 0.02 1.0 0.02 0.6 0.02 0.3 0.02 40 2.0 0.08 1.9 0.05 0.9 0.05 0.5 0.01 60 2.8 0.14 2.7 0.06 1.0 0.02 0.6 0.02 80 3.2 0.21 3.1 0.02 1.1 0.04 0.7 0.01 組別, 結果與討論 1. 定性分析, ,1, 蝴蝶蘭葉片產生嵌紋病毒感染病徵樣品,以不同抗體進行酵素連結免疫吸附 法,ELISA,檢測結果,為感染何種病毒,,5分, ,2, 說明原因。,7分, 3 組別, 2. 定量分析 ,1, 蝴蝶蘭葉片產生嵌紋病毒感染病徵樣品,以不同抗體濃度進行酵素連結免疫 吸附法,ELISA,檢測結果,以何種抗體濃度進行檢測,最為適當,,5分, 4 ,2, 說明原因。,8分, 【試題二】 酵母菌的呼吸 組別, 總分25分 實驗背景 酵母菌於發酵工業上應用廣泛,除釀酒、麵包製造等大宗傳統發酵產品外,特定酵母菌可製成單細胞蛋白,作為蛋白質營養劑或製成飼料供動物食用。部份酵母菌甚可生產一些高價產物如泛素Q10、超氧歧化酶(superoxide dismutase)及工業上各式有用的酵素、蛋白質及各式代謝產物等,除此之外,一種類似啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的食用酵母菌(Sacchaaromyces boulardii)已證實可以拮抗腸道中的病原菌和治療慢性腹瀉症。此外,酵母菌,Saccharomyces cerevisiae,和裂殖酵母菌,Schizosaccharomysces pombe,,亦常作為學術基因遺傳、細胞生理、細胞分化等學術研究之主要模式。甚至在基因領域中,選殖後的基因常殖入酵母菌中,以進行選殖基因產物的生產。酵母菌細胞較一般細菌稍大,但比絲狀真菌小, 5 會行出芽或分裂生殖,其出芽方式可分為單極,monopolar,、雙極,dipolar,和多極,multilateral,出芽。單極出芽的細胞僅在細胞一端出芽,雙極出芽則是在細胞兩側出芽,形成檸檬型細胞型態。多極出芽則是細胞週邊皆可能出芽。其中以多極出芽型式最為常見,而單極及雙極等特殊出芽型式則可作為菌種鑑定的主要參考依據。酵母菌會使用不同碳源來產生自身所需能量與對人類有用的代謝產物。 實驗器材與材料 1. 光學顯微鏡 (學生自備) 2. 載玻片及蓋玻片各1片 3. 麵包酵母菌液1管 4. 麵包酵母菌粉 (1g) 3管 5. 1ml塑膠滴管1支 6. 20%葡萄糖溶液10ml 1管 7. 20%蔗糖溶液10ml 1管 8. 20%澱粉溶液10ml 1管 9. 氣球6個 10. 橡皮筋3條 6 組別, 問題 1. 觀察酵母菌,請說明鏡檢之外觀型態並畫出你的觀察。,6分, 2. 評估麵包酵母菌使用上述三種碳源的發酵速度,請詳述你的假說、實驗步驟(設 計)與結果。,9分, 3. 分別寫出酵母菌發酵(有氧呼吸)與(無氧呼吸)之反應方程式? ,6分, 4. 選出下列對酵母菌的陳述是正確者,複選,Ans:【 】,4分, a. 可作為益生菌 (probiotic) b. 單細胞型態的真菌 7 c. 單細胞型態的細菌 d. 喜棲息於純淨之河水 e. 大小約2-10微米,μm, f. 一些酵母菌會寄生在動物體內造成病害 g. 酵母菌能行光合作用 h. 野生葡萄的表面無法發現酵母菌 i. 酵母菌可行有性生殖 【試題三】細菌的特異結構染色法—內胞子染色法 總分25分 組別, 實驗背景 有些細菌可形成代謝作用旺盛之生長型菌體及內胞子。當生長條件惡劣時,此類細菌會在菌體內形成一種圓形或卵圓形的特殊結構,這種結構稱為成內胞子。內胞子的外殼非常緻密且內部的含水量少,對高溫、冷凍、放射線、乾燥及化學藥品等理化因素具高度的抵抗力,可幫助細菌度過嚴苛環境,待生長條件適合後,再發育成新的菌體。本實藉由內胞子染色方法,讓學生觀察內胞子生產細菌與一般生長型菌體型態。 實驗器材與材料 1. 光學顯微鏡 ,1000X,可做油鏡操作,油鏡油自備, 2. 細菌A與B各1皿 3. 牙籤2支 4. 無菌水 1管 8 5. 孔雀,溶液1管 6. 沙黃溶液1管 7. 面紙5張 8. 拭鏡紙2張 9. 1ml塑膠滴管3支 10. 3ml塑膠滴管1支 11. 95%酒精 1管 12. 載玻片及蓋玻片各4片 13. 500ml燒杯 2個 14. 油性簽字筆 1支 15. 酒精燈及打火器各1個 16. 沸水加熱裝置(共用裝置) 17. 橡膠手套,S、M、L置於講台, 18. 電子錶(具計時功能,學生自備) (,菌體染色時請戴橡膠手套) 組別, 實驗步驟 一、菌體染色 1. 在玻片背面畫一圓圈,將樣品放在圓圈正面。用1ml小吸管在玻片正面滴1滴 9 無菌水,水滴越小滴越好,必要時可用面紙將多餘的水吸去。 2. 用牙籤沾取菌,,塗抹在水滴中,在空氣中自然風乾後,將玻片在酒,燈火燄 上加熱,秒。 3. 滴上孔雀,溶液將菌液塗抹處蓋滿後,置於100?熱水浴上,以水蒸氣蒸 5 分 鐘後取回。 4. 待玻片,卻至室溫後,用水輕輕沖洗,將多餘的孔雀,溶液沖至500ml燒杯中。 5. 在樣品上滴數滴沙黃溶液複染30秒。 6. 用水輕輕沖洗,將多餘的沙黃溶液沖至500ml燒杯中。 7. 用面紙輕輕將多餘的水拭乾,注意請勿擦去樣品。 8. 以油鏡觀察之(內胞子會被染成,色)。 二、油鏡操作 1. 於菌體染色完成的樣品上滴一滴油鏡油。 2. 將此載玻片直接放至載物台上,先以最低倍率物鏡觀察,並將染色細菌調整清 楚於視野中央。 3. 轉動旋轉盤,使100X物鏡鏡頭浸入油滴中。,注意,40X物鏡勿與接觸油滴, 4. 調整調節,觀察。 5. 觀察結束後,取出載玻片。 6. 用拭鏡紙以單一方向將100X物鏡上的油滴擦拭乾淨,再用乾淨的拭鏡紙沾取 95%酒精,將100X 物鏡以單一方向擦拭乾淨。 10 組別, 問題 1. 分別劃出 A 菌 與 B 菌染色結果? ,10 分, 2. 請設計一簡單實驗探討含內胞子之菌種的確可抵抗環境中不良因子 ,如紫外 線、高鹼或高溫,。,15分, 11 總分25分 【試題四】果汁中之維生素C含量之影響因子探討 組別, 實驗背景 維生素C(英文名稱,ascorbic acid),又稱抗壞血酸,是人體必需維生素,必須從食物中獲得,人體無法自行製造。維生素C的功能主要是協助膠原蛋白、神經傳導物質與荷爾蒙等之合成以及作為抗氧化劑來保護維生素A、E避免其氧化。由於其為水溶性維生素,相當不穩定,易受光、熱、氧、酸鹼與氧化酵素的破壞,而影響其攝取,因此本實驗將探討果汁中維生素C含量如何受到各種因子之影響。 實驗材料 1. 20ml試管10支 2. 試管架1個 3. 0.1 % dichlorophenol-indophenol (DCPIP) 40 ml 12 4. 0.05 %, 0.025%及0.0125% ascorbic acid溶液各10 ml 5. 新鮮檸檬汁20ml 6. 冰醋酸1 管 7. 10M NaOH 1 管 8. 3 ml注射針筒1支 9. 3 ml塑膠滴管7支 o10. 90C水浴槽 11. 100ml燒杯1個 實驗步驟 1. 請將7支20ml試管依實驗結果的表格內容進行編號。 2. 請以3ml注射針筒吸取2 ml 的0.1 % DCPIP到每一試管中。 3. 以3 ml塑膠滴管分別取上述試管No.1~3之ascorbic acid標準液滴定到步驟2之 2 ml 的0.1 % DCPIP溶液,滴定同時須搖晃試管令其充分混合,直到DCPIP溶 液由藍色變成無色即停止,記錄滴定的ascorbic acid之容量。 4. 取3支20ml試管加入2ml新鮮檸檬汁,各試管依試管No.5~7之條件製作滴定 液。 5. 以3 ml塑膠滴管分別取上述試管No.4~7不同條件之新鮮檸檬汁,滴定到步驟2 之2 ml 的0.1 % DCPIP溶液,滴定同時須搖晃試管令其充分混合,直到DCPIP 溶液由藍色變成無色即停止,記錄下所壓出的果汁之容量。 13 組別, 實驗結果 試管ascorbic acid標準液及不同處理條件之新鮮檸檬汁 使DCPIP變無色 編號 所使用之果汁量 1 0.05 % ascorbic acid (0.5 mg/ml) 2 0.025 % ascorbic acid (0.25 mg/ml) 3 0.0125 % ascorbic acid (0.125 mg/ml) 4 新鮮檸檬汁 5 o新鮮檸檬汁2ml (於90C水浴槽水浴反應10分鐘) 6 新鮮檸檬汁2ml (加酸4滴) 7 新鮮檸檬汁2ml (加鹼4滴) 結果與討論 1. 請將試管No.1~3之滴定結果,以該試管所代表之維生素C濃度為X 軸,所 使用之滴定液容積為Y軸,畫出維生素C濃度之檢量線。 14 組別, 2. 請依畫出來之檢量線預估試管No.4~7所含之維生素C之濃度。 3. 請比較新鮮檸檬汁在不同處理方式中,其維生素C之差異,並討論其結果。 15 16