【doc】口腔鳞癌中染色体9p杂合性丢失的研究

【doc】口腔鳞癌中染色体9p杂合性丢失的研究 口腔鳞癌中染色体9p杂合性丢失的研究 华西口睦医学杂志田c幅?01年lO月第9卷第5船275 ? 基础研究? 口腔鳞癌中染色体9p杂合性丢失的研究 肖林10LNgZCLu0 摘要目的:探讨口腔鳞状细胞癌中9号染色体短臂等位基因的杂台性丢失和微卫星不稳定与口腔鳞状细胞癌发 生,发展之间的关幕.方法:采用PCR法检测24例口腔鳞状细胞癌中染色体9p上8个微卫星多态位点.结果:在 24例口腔鳞状细胞癌中,l0例(4167%)鳞癌组织至少有一个微卫星位点发生杂合性丢失.其主要发生在染色体 %)和D9s304(1000%),以及9p229p21的D9S171(21.05—23的ms16a(22.22%)和D9S162(15.38%).然而,这些基 因位点的杂台性丢失与肿瘤病理学类型,肿瘤的大小及转移性在统计学上无显着相关性(P>0.05).此外,微卫星 不稳定仅在2例患者中出现,没有1例患者符台微卫星不稳定的判定,即两个或两个以上的微卫星多态位点的 异常.结论:本研究中发现的口腔鳞状细胞癌在染色体91321—23区域发生高频率的杂台性丢失,提示在9p21-23区 域可能存在多个与部分口腔鳞状细胞癌相关的肿瘤抑制基因,而徽卫星不稳定与口腔鳞状细胞癌发生的关系不 大. 关键词口腔鳞癌杂合性丢失染色体9P Allele-specificChromosome9pDeletioninOralCancer XiaoLi" CancerCenter,theFirstAjfdiatedHospital,ChinaUniversofMed;calSciences 10LNg.ZCLuo QmMaryHospital,TheUniversityofIfongKong Abstraet Objecti~:Theaimofthisstudyw丑 stoinvestigatetherelations]tipbetweenlossofbeterozygosity(LOH)OYIchmm0s.me9p ar.dthepathogenesisoforalsquanloo$oeuc(OSCC).Methods:Atat~l0f24humanOSCCspecimensweYeanalyzedfor LOH0nChrolllO$Oll~9pu商8rosamtem日r玛bymeansofp.lyrneL皓 echainreaction.Results:In24cas瞄ofOSCC, LOH?chne9pwasidentitiedin10of24cases(4167%)withatleast咖 emarker.ThemainLOH9,~TefoundOn9p21 ackD9S171(2105%)andD9S304(10.00%)ThererealsoadeletionOil9#2-23atlocusD9S168(2222%)and D9S162t15.38%).Howe-,~r,therewasnostatisticallysignificantcormlatlonbetweenLOHattheselociwithsuchclinica1.pa- ramelersa8r,atholog~types,tumorsizeandlymph-nedenletasta~s.Micmsatelliteins*ability(MS1)israreforartyofthe8 markersin24OSCC.NoMS1couldobservedusingthecommoncfitefa{rdefimngMSI-itsdetectionintwoorinoyern稿. c【nd?:WefoundthatIli曲 frequencyofLOHoccurredat9021-23bandTheirresultsindicatethat/TIOYethano13etumor supp~genesdlmrrIos09p21-22mrelatedtoaHofOSCC,whileMSI~g]atnotbeacrucialevent KeyWOg~:0alSC~IIDOUScellcmcinccnalossofhet目yg.s畸 m4crosatelllteimmbifi~chmrrl0s0rEle9p 口腔鳞状细胞癌(OMSqlU~fflIOUScellcarcinoma, oscc)约占ISI腔颔面部恶性肿瘤的80%.随着年 龄的增长,其发病率有增高的趋势.对人类生命健 康危害极大.与其它恶性肿瘤一样,口腔癌的发生 也是一个多因素参与的,多阶段的复杂过程,细胞 作者单位:610041四川大学华西医院肿瘤中心(肖林).香 谐大学玛丽医院(10LNg,ZCLuo) 遗传学和分子遗传学已证明,染色体部分和节段性 缺失与IYl腔鳞癌的发生密切担关.而9号染色体 是最常发生缺失的染色体之一.因此,通过对肿瘤 基因组中特定染色体微卫星多态位点的检剖, 等位基因杂合性丢失(1ossofhetemzygosi~",LOH), 进而准确定位并发现这些区域可能隐含的肿瘤抑 制基因(tmnorsuppms~rgene,TSG).OSCC染色体 9p的研究目内尚未见报道,本研究对24例oscc 华西口腔压学杂志WC.IS2(I]1年l0月第19卷第5期 进行微卫星多态分析,检测9p上8个微卫星位点 的LOH和微卫星不稳定性(mierosatelliteinstabiliD, MSI1,以了解OSCC发生与LOH和MSI的关系. 1材料和方法 11标本收集和基因组DN3.提取 24侧口腔癌组织标本均经病理确诊为鳞状细胞癌,其 中l9例由香港大学玛丽医院提供.5恻由华西医科大学口 腔医院提供.取癌组织及距离癌组织1cm上的癌旁组 织,立即放于70?保存.记录其临床病理资料.组织均竖 冰冻切片染色,镜捡证实癌组织中癌细胞占70%以上,正常 组织无癌细胞.采用蛋白酶K消化.酚/氯仿提取法抽提组 织卟A,用|【E液稀释,紫外分光光度定量后备用 1.2PCR扩增 8个擞卫星引物均购自ReseerchGenatie公司(美国),每 对引物正链在lr4多聚棱苷酸合成酶(PNK)催化下标记 "[-33-ATP:在20VIPER反应体系中加^基因组DNA1}, 1251mlob'L&'qTP,2脚10×Buffer,10mn~VL或1.5mmul/L M,Taq酶0.2U,采用touch-downPcR法扩增30个循环. PCR产物与电泳载样液等量稀释,95水浴变性10nfin加 样于舍7n~l/L脲索的6%变性丙烯酰胺凝胶,电淳3,4h 后,真空干胶,于暗盒中对x线底片放射自显影 2结果 2.1LOH与MSI的判定 基因组DNA等位片段表现为杂合子者可用为 LOH的分析信息.与癌旁组织对比,癌组织DNA PCR扩增产物带消失或相对密度减少50%以上时 判为LOH,见图l. TN D9S【68D95304 1口蓝鳞堪中等位基的待苗性丢失 T:癌组绍标本,:正常组织.箭头示IJ(】H MSI表现为当肿瘤组织的条带与正常相比时, 出现等位基因条带的增多和大小的改变,在检测8 个微卫星位点中,如果有两个或两个以上位点出现 异常,则定义为MSI阳性'.在本研究中,仅2例 患者出现NSI,没有1例患者符合此标准. 2.2口腔鳞癌中染色体9p发生LOll的频率 24例OSCC中,1O例(41.67%)至少一个位点 发生LOH,其余14例均未发生LOH.9p发生LOH 频率较高的有D9SI6g,D9S162,D9S304和D9S171. 其结果见表1. 表124倒OSCC组织染色体9p发生LOH频率 2.3OSCC染色体9pLOH与OSCC临床病理改变 的关系 根据OSCCTNM分期,肿瘤大小,病理分级以 及颈淋巴结转移进行分组,经统计学处理,各基因 位点的LOH在各组间均无显着性差异(P>005). 3讨论 抑癌基因的失活多表现为一个拷贝等位基因 丢失和另一等位基因的突变,并常伴有其附近的 DNA多态标记丢失,染色体9p缺失是人类肿瘤细 胞最常见的缺失之一,在许多肿瘤中发生高频率 LOH,如鼻咽癌,食管癌,小细胞肺癌和膀戕癌等肿 瘤均发生高频率9p21带的LOH"',并提示在染色 体9p上至少存在两个TSGs 本研究对24例OSCC染色体9p的8个位点进 行微卫星多态分析,结果1O例(41.67%)患者至少 在一个位点发生LOH,其中LOH频率较高的位点 是D9s304(10.0O%),D9S171(21.()5%),D9S168 (22.22%)和D9SI62(15.38%).D9S171和D9S304 位于9p21,在染色体9p21带,发现并定位的侯选 3"SG有p16和p15基因,p16基因抑制编码cDK4酶 (wdin—dependentkinase4)的基因活性,而CDK4酶 能够促使细胞分裂,有人认为,在癌组织中D16基 因突变可能比t63基因突变更常见.本组 OSCc染色体9p21区域发生高频率L01l的位点是 D9S304和D9S171,提示p16基因丢失可能和OSCC 华西IZl腔医学杂志We,IS2001年1O月第l9卷第5期 发生有关.D9S162和D9S168位于染色体9p22-~, E1Nat~gar等在头颈部肿瘤中发现这两个位点也 出现高频的LOH,提示在该位点附近可能存在与 OSCC有关的TSG.本结果支持了在染色体9p上 可能存在多个与OSCC有关的TSG的推断. NSI的判定普遍接受Wq~ster和Wieland的标 准,即有两个或两个以上的微卫星多态位点的异常 则为MSI阳性.本研究中,没有一例患者符合此标 准,推测原因如下:?各家选择微卫星位点及位点 的数目不同,?人种之间的差异,-0NSI的判定标 准不一.因此,要确定MSI频率及其与OSCC发生 发展的关系,除了进行大量位点,大量病例的检测 外,还需要统一NSI的判定标准. 本研究中,笔者筛选出来的染色体9p21—23区 域的位点可能存在与部分OSCC有关的多个TSG, 可指导进一步进行这些位点附近的高密度图谱分 析,寻找这些位点附近的最小缺失片段,为寻找新 的TSG奠定基础.而本组微卫星位点的NSI与 OSCC发生的关系可能不大. 参考文献 1删R,CletotaJ明肫nAN,Co]linsH,etInstabilityof Oa,~ttandemrepeat(nficrc~ellilte)inhun~acancerNat Coenet,1994,6(2):152—156 2WidandI,,~JrJnennullerT,‰M,dalMierc~telliteinsta— bilityandl.曙日忧r址ehNLH1locus?ckLl刑一 9p21in~ubsetof-slcellhmgc? 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