肿瘤蛋白质组学研究进展

肿瘤蛋白质组学研究进展 BIOX.CN 2004-12-18 19:06:53 来源:首席医学网 【摘要】 随着人类基因组全序列草图的完成，从基因水平向蛋白质水平的深化，已成为 生命科学研究的迫切需要和新的任务。蛋白质组学的建立为研究蛋白质水平的生命活动 开辟了更为广阔的前景，提供了新型有效的研究手段。从蛋白质整体水平上研究肿瘤的 发生与转移，寻找与肿瘤发生及转移相关的新的蛋白质、肿瘤特异性的物及肿瘤药 物治疗的靶标，对肿瘤的诊治将起到重要作用。本文阐述的是关于蛋白质组学在肿瘤研 究中的最新进展。 关键词 蛋白质组学 蛋白质组 肿瘤 转移 【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)14-1279-03 1 概述 基因，尤其是基因组研究是20 世纪生命科学研究一道亮丽的风景线。但是，随着人类基 因组全序列草图的完成，基因组研究的战略重点不可避免的从结构基因组学(structural Genomics)转向功能基因组学(Functional Genomics)，而蛋白质组学(proteomics)正是 作为功能基因组研究的重要支柱在20 世纪90 年代中应运而生的 ,1，2, 。 蛋白质组的概念最早是由澳大利亚 Macquarie 大学的 Wilkins 等于 1994 年在意大利的一 次科学会议上提出的。在1997 年出版的有关蛋白质组研究的首部专著里，作者再 次重申 了他们对蛋白质组的定义:“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质”(“PROTEome indicates the Proteins expressed by a genOME”);即“PROTEOME”是由蛋白质的“PROTE” 和基因组的“OME”字母拼接而成 ,3, 。这一概念具有整体性、动态性和系统性的特 点。它指的是对应于一个基因组的全部蛋白质所构成的整体，而不局限于一个或几个蛋 白。 生物功能的主要体现者是蛋白质，复杂的基因间和蛋白质间的相互作用、细胞内的活动 和环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译后加工。研究表明，从 mRNA 表达水 平并不能够预测蛋白质表达水平。主要原因有 ,4, :?基因表达与相应的蛋白表达存在 时间上的差异。?基因表达的部位与相应蛋白执行功能的部位有所不同。?mRNA 及蛋 白质的稳定性有所不同。?mRNA 在转录后可以生成不同的蛋白质。?蛋白质的修饰如 磷酸化和糖基化对于蛋白质的活化及执行功能具有非常重要的影响。导致同一基因组在 不同的细胞，不同的组织中的表达情况各不相同;即使是同一细胞，在不同的发育阶段、 不同的生理条件甚至不同的环境影响下，其蛋白质的存在状态也不尽相同。蛋白质组作 为一个在空间和时间上动态变化着的整体，各个蛋白质之间并非杂乱无章或者相互孤立， 而是通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用，密切有序的联系在一起，形成多个子系统， 实现特定的生理功能。 蛋白质组学(proteomics) ,5, ，就是从整体的角度细胞内动态变化的蛋白质组 成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，从而揭示生物学行 为(如:疾病过程和药物效应)，以及基因表达调控机制的一个新的研究领域。 蛋白质组学的研究内容 ,6, ，它可分为:?表达蛋白质组学(expression proteomics): 是在整体水平上研究生物体蛋白质表达的变化，是对细胞或组织中蛋白质表达量化谱的 反映，即把细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白定量表达图谱，或扫描EST 图;该方法依赖 双相凝胶电泳和图像分析技术，在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药 物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物 靶点、毒理学研究等有重要作用。?细胞图谱蛋白质组学(cell map protemocis):即确定 蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等，来 研究蛋白质在细胞内的行为、运输及相互作用。通过它可建立起各种细胞类型和状态的 “物理图谱”，对确定蛋白质功能和新的疾病诊疗的靶位极有价值。目前蛋白质组学的前 沿研究大致分为三大方向 ,7, : 1.1 针对有基因组或转录数据库的生物体或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组(或 蛋白质表达谱)及其蛋白质连锁群，即compositional proteomics 研究;选择1,2 种具有重 要生物学意义或性状、且我国已经完成 cDNA 大规模测序的组织或细胞，制备其高分辨 率的蛋白质组图并建立其蛋白质数据库，进而联合应用其 cDNA 大规模测序的数据，规 模化的研究其蛋白质组成。 1.2 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要病理/生理体系或过程的比较蛋白 质组学的研究，即 comparative proteomics 研究;选取 1,2 类重大生命活动中几个相继的 重要阶段，分别进行蛋白质作图，进行系统的定性和定量比较，进而对差别蛋白进行鉴 定，然后从核酸、蛋白两层次对差别代表子进行研究，从而确定重大生命活动的蛋白质 基础。 1.3 蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究;生物信息学包括:蛋白质组成员的序 列、结果、功能及定位分类;基于生化途径、遗传网络等，构建蛋白质组功能系统即蛋白 连锁图;建立人或其他动物的蛋白质组数据库;高等生物基因组中蛋白质编码基因的识别 及算法研究;基因翻译产物的结构、功能预测;基于蛋白质数据库与知识库的知识与规律发 现。支撑技术平台包括:新型蛋白质结构、功能预测的方法及程序;大规模蛋白质相互作用 分析技术;蛋白质分析鉴定中新型质谱技术的发展及应用;高通量系统及蛋白质组分析自 动操作系统。 2 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 恶性肿瘤是一类由遗传因素与环境因素共同作用所导致的疾病，其发生和进展是多因素、 多环节、多途径过程，任何单个基因均不能够全面说明肿瘤转移的一系列复杂生物学行 为,8, 。肿瘤的基因研究已取得了令人瞩目的进展，目前已经发现了许多肿瘤相关基 因，并有一些基因表达的研究。蛋白质组学通过对肿瘤发生的不同阶段蛋白质的变化进 行分析，可以阐明肿瘤蛋白表达水平的变化与肿瘤发生发展的相互关系及其规律，还可 以检测、分析和确定肿瘤不同时期的标志蛋白，这种蛋白质可以作为抗癌药物筛选的作 用靶点。不仅对抗癌药物发现具有指导意义，还可形成未来肿瘤诊断学、治疗学的基础 理论 ,9, 。 2.1 探讨肿瘤发生的机制 Yu ,10, 等对人类肝癌细胞株 BEL-7404 和正常人类肝细胞 株 L-02 蛋白质组进行对比研究，发现谷胱甘肽-S-转移酶 P、5-磷酸肌苷脱氢酶 2、热休 克蛋白27、钙网蛋白、钙调蛋白及两种网钙结合素在肝癌中增加，然而管状蛋白β -1 链 及自然杀伤细胞增强因子B 在肝癌细胞中表达下调。一种丝氨酸蛋白酶抑制物，即maspin 前提在正常肝细胞中表达明显增高，而表皮脂肪酸结合蛋白、脂肪酸结合蛋白仅仅在正 常细胞中能够检测出。国内上海生化研究所对人 BEL-7404 肝癌细胞系和 L-02 正常肝细 胞系表达的蛋白质组进行分析发现了 7 个仅在肝癌细胞中表达的蛋白点 ,11, 。Seow ,12，13, 等人分析 HCC-M 肝癌细胞株和正常肝细胞株比较，鉴定出约400 个肝癌细 胞特异性的蛋白点，如:乙醇脱氢酶、α -烯醇化酶、天冬酰胺合成酶、异柠檬酸脱氢酶等。 瑞士日内瓦大学医院已经建立了SISS-2DPAGE 数据库含有人肝脏组织、HepG 2 肝癌细 胞及其分泌蛋白的双向电泳参考图 ,14, 。 2.2 探讨肿瘤转移的机制 肿瘤细胞的转移是肿瘤患者致死的主要原因。尽管有关肿瘤发 生及转移的机制已经在病理学和形态学等多方面有了大量的研究与探讨，但是肿瘤形成 及转移的分子基础和机制尚不清楚。目前研究肿瘤转移分子机制的思路主要是研究比较 高、低(或无)转移潜能细胞系、或者是比较原发灶与转移灶的差别，寻找与转移相关 的正性或者是负性的调控因素 ,15, 。运用蛋白质组的研究手段，比较正常状态下和 病理状态下的细胞或组织中，蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，可以 发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白质。针对肿瘤微转移的研究目前一直停 留在检测血液，骨髓及淋巴结等标本的肿瘤标记物水平上，PCR 的方法是检测微转移最 敏感的方法，仅依靠PCR 或者是巢式PCR ,16，17, ，阳性结果是多样性的，这可能 与引物的选择，反应的条件，或者是模板的数量有关。同时，即使在标本中检测出肿瘤 细胞的标志物还不能说明肿瘤最后就一定能够转移，因为其中部分肿瘤细胞在后来是被 消灭的。定量的PCR 和 RT-PCR 可能是更加有效的方法，认为量的分析比只是发现肿瘤 细胞的有无更有意义。因为肿瘤细胞表达 mRNA 的表达水平是不一样的，定量 RT-PCR 也受到很多的限制。利用比较蛋白质组学的研究是在功能层面-蛋白质水平的研究，可能 为提高目前微转移检测水平提供新的思路 ,18, 。 2.3 寻找肿瘤标志物 肿瘤标志物是指在肿瘤患者体液或者组织中存在的更高水平的一大 类物质。应用蛋白质组学研究的策略筛选和鉴定肿瘤标志物的优势在于 ,19，20, :? 能够对肿瘤进行分子分期，更利于肿瘤患者的个体化治疗。?联合多种肿瘤的标志物， 根据蛋白质谱和基因表达谱的改变进行多变量分析，能够更客观的分析和判断病情。? 寻找无创或微创的方法进行肿瘤的早期诊断和风险人群的筛查。Bergman 等人在对浸润 性乳腺癌、乳腺纤维腺瘤、前列腺癌、儿童白血病及进展阶段神经母细胞瘤 ,21, 等 多种肿瘤的蛋白质组表达谱的研究中发现，许多分子的表达在恶性肿瘤中是相似的，如 PCNA、HSP90、OP18(oncoprotein18)、核苷酸脱磷酸酶 A(nm23-H1)等与细胞增殖 活性、抗凋亡、促进细胞转移相关的分子，一般是高表达。原肌凝蛋白和角蛋白大部分 低表达，说明不同肿瘤的生物学特性是相似的，其发生发展有着类似的过程和共同的信 号通路，去寻找肿瘤共有的特征性诊断分子标志是可行的。将这些蛋白质组成恶性肿瘤 蛋白谱，联合多种分子标志进行分析，将有利于对疾病的正确诊断。Alaiya 等,22, 观 察到在卵巢癌中 PCˉNA、HSP90、OP18 等 8 种蛋白质表达增高，原肌凝蛋白 1、2 和 CK8 等 9 种蛋白质下调，在上述蛋白中恶性肿瘤有 5 种以上同时变化，良性肿瘤变化的 蛋白质数肿瘤得到正确分类 ,23, 。还可以建立一些同患者的生存率、治疗反应、原发与转移癌的鉴别相关的分析 模式，对肿瘤的生物学行为进行更全面的评价。目前对诊断预示标志物(predictive markers)的介绍较少。预示标志物是一类与不同的治疗方法相联系的标志物。例如乳腺 癌患者中的雌激素受体如果阳性，则选用抗雌激素的药物治疗，假如是阴性，则应选择 化疗 ,24, 。 2.4 肿瘤治疗方面的应用 现今大多数抗癌药都伴有严重的毒副作用，特别是对晚期癌症 病人进行单一化疗或联合放疗、过热疗法时，经常伴随着癌细胞对细胞抑制剂耐药性的 发生。如果能发现在耐药细胞系中表达异常的蛋白质或者与细胞毒性密切相关的蛋白质， 就可以此蛋白为靶点设计用于联合用药的 NCE。也可以此信息为参考设计避免产生耐药 性或毒副作用的药物,25, 。另外，国内一些实验室目前已经开始利用蛋白质组学技术， 通过对高、低转移潜能细胞株蛋白质的比较，来寻找与肿瘤转移相关的蛋白质。同时， 也可利用高转移株中特异表达的蛋白质为靶点，开发抑制肿瘤转移的新药 ,11, 。 3 面临的问题与展望 蛋白质组学的建立已经为研究蛋白质水平的生命活动开辟了更为广阔的前景，提供了新 型有效的研究手段，但是从目前的情况来看，蛋白质组分析并不能覆盖所有基因表达产 物，蛋白质样品的制备、鉴定等方面还存在不足，而且该技术在重复性、高通量、自动 化等方面的不足，使得蛋白质研究的技术平台目前还处于发展、完善的阶段，蛋白质组 技术目前的主要瓶颈在于高通量与自动化的实现，有望通过蛋白质芯片又称蛋白质微阵 列技术来实现。蛋白质芯片的发展使得在同一时相分析整个蛋白质组成为可能。同时， 功能蛋白质组概念，即研究特定时期或实验条件下基因组中活跃表达的蛋白质功能的提 出 ,26, ，为未来的蛋白质组研究提供了更为可行的着手点。 蛋白质组技术可以从整体上，全面的、动态的、定量的分析比较正常及肿瘤标本 中蛋白 质种类和数量的改变，有助于阐明肿瘤相关蛋白质间的调控网络，深化对肿瘤发生及转 移机制的认识，发现肿瘤诊断、治疗和预后的特异性标志物，加快肿瘤疫苗的研制和抗 癌新药的开发。一方面蛋白质组学为肿瘤的研究提供了崭新的思路和手段，另一方面蛋 白质组学的研究期待着新的技术方法的突破。相信蛋白质组学必将在 21 世纪肿瘤的研究 中取得突破性的进展。 参考文献 1 Field S.Proteomics in genomeland.Science，2001，291:1221-1224. 2 O-Donovan，Apweile R，Bairoch A. The human proteomics initiative(HIP). Trends Biotech， 2001，19:178-181. 3 Wilkins M，et al.Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics. Springer.1997， 2. 4 Anderson L，Seihamer J.A comparsion of selected mRNA and Protein abundances in human liver. Electrophoresis，1997，18:533. 5 Anderson NL，Anderson NG.Proteome and proteomics: new technologies，new concepts and newwords. Electrophoresis，1998，19(11):1853. 6 Pandey A，Mann M.Proteomics to study genes and genomes. Nature，2000，405:837-846. 7 贺福初.功能基因组与蛋白质组.蛋白质组学:理论与方法.北京:科学出版社， 2003，17-18. 8 Hanash SM，Bobek MP，Rickman DS，et al. Integrating cancer genomics and proteomics in the post genome era. Proteomics，2002，2(1):69-75. 9 李新华，张万岱，肖冰，等.蛋白质组学及其在人类疾病研究中的应用.中华内 科杂志， 2003，42(2):133-134. 10 Yu LR，Zeng R，Shao XX，et al. Identification of differentially expressed proteins between human hepatoma and normal liver cell lines by two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-ion trap mass spectrometry. Electrophoresis，2000，21(4):3058-3068. 11 余利荣，王楠，吴高德，等.人肝癌细胞系 BEL-7404 和正常肝细胞系 L-02 表 达的蛋 白质组双向电泳凝胶分析.科学通报，2000，45:170-178. 12 Seow Tk，Ong SE，Liang RC，et al. Two-dimensional electrophoresis map of the human hepatocellular carcinoma cell line，HCC-M，and identification of the separated proteins by mass spectrometry. Electrophoresis，2000，21:1787-1813. 13 Ou K，SeowTK，Chung MC，et al.Proteome analysis of a human hepatocellular carcinoma cell line，HCCM: An update. Electrophoresis，2001，22(13):2804-2811. 14 Sanchez JC，Appel RD，Golaz O，et al. Inside SWISS-2DAPGE database. Electrophoresis， 1995，16(11):1131-1151. 15 汤钊猷，主编.肝癌转移复发的基础与临床，上海:上海科技教育出版社，2003， 42. 16 Jung K，Henke W，Lein M，et al. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells. Cancer，1996，78(11):2445-2248. 17 Janni W，Gastroph S，Hepp F，et al. Prognostic significance of an increased number of micrometastatic tumor cells in the bone marrow of patients with first recurrence of breast carcinoma. Cancer，2000，88(10):2252-2259. 18 Larie LC，Fothergill JE，Murray GI.Spot the differnces: Protemoics in cancer research. Lancet Oncol，2001，2(5):270-277. 19 Li J，Zhang Z，Rosenzweig J，et al. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer. Clin-Chem，2002，48 (8):1296-1304. 20 卢忠心，曹亚.蛋白质组学研究在确定新的肿瘤标志物中的意义.国外医学?肿 瘤学分 册，2003，30(1):6-9. 21 Bergman AC，Benjamin T，Alaiya A. Identification of gel-separated tumor marker protein by mass spectrometry. Electrophoresis，2000，21(3):679. 22 Alaiya AA，Franzen B，Fujioka K，et al. Phenotypic analysis of ovarian carcinoma: polypeptide expression in benign，borderline and malignant tumors. Int J Cancer， 1997，73 (5):678-683. 23 Alaiya AA，Franzen B，Hagman A，et al. Classification of human ovarian tumors using multivariate data analysis of polypeptide expression patterns. Int J Cancer ，2000，86 (5):731-736. 24 Srinivas PR，Kramer BS，Srivastava S. Trends in biomarker research for cancer detection. Lancet Oncol，2001，2(11):698-704. 25 Ross DD，Gao Y，Yang W，et al.The 95-kilodalton membrane glycoprotein overexpressed in novel multi-drug-resistant breast cancer cells is NCA，the non-specific cross-reacting antigen of carcinoembryonic antigen. Cancer Res，1997，57(24):5460-5464. 26 李柏良.功能蛋白质组学.生命与化学，1998，18(6):1-46. 作者单位:400037 重庆第三军医大学新桥医院肝胆外科