几种显微镜在医学领域的应用

显微镜在医学领域的应用 孙文（作者系湖北文理学院医学院临床医学系 ） 【摘要】：显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，用于放大微小物体使人肉眼能看到，是人类进入原子时代的标志。其大致可以分为光学显微镜和电子显微镜,视频显微镜。光学显微镜通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。光学部分是最为关键的，它由目镜和物镜组成。光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜（普通光学显微镜）、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光共聚扫描显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜。本文主要详细阐述了这些光学显微镜的结构、原理及在医学领域的应用和影响。 【关键词】：显微镜  医学研究  细微结构 光学显微镜基本结构包括光学系统和机械系统两大部分。光学系统是显微镜的主体部分，包括物镜、目镜、聚光镜及反光镜等组成的照明装置。机械系统是为了保证光学系统的成像而配置的，包括调焦系统、载物台和物镜转换器等运动夹持部件以及底座、镜臂、镜筒等支持部件。照明设置的主要部件有光源、滤光器、聚光镜和玻片等。 显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统，是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，供人们提取物质微细结构信息的光学仪器。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜，而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜[1]。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大， 得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。 一、医学检验中常用的荧光显微镜的原理、结构及用途 荧光显微镜是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到的各种颜色荧光的一种光学显微镜。 荧光显微镜是由光源、滤色系统和光学系统等主要部件组成。荧光显微镜与普通光学显微镜主要区别在于光源和滤光片不同。通常用高压汞灯作为光源，可发出紫外线和短波长的可见光；滤光片有二组，第一组称激发滤片，位于光源和标本之间，仅允许能激发标本产生荧光的光通过(如紫外线)；第二组是阻断滤片，位于标本与目镜之间，可把剩余的紫外线吸收掉，只让激发出的荧光通过，这样既有利于增强反差，又可保护眼睛免受紫外线的损伤[2]。光学系统主要有反光镜、聚光镜、目镜、物镜、照明系统等组成。 荧光显微镜可用于观察检测细胞中能与荧光染料特异结合的特殊蛋白、核酸等，其标本染色简便、荧光图像色彩鲜亮，而且敏感度较高。 *荧光显微镜的使用注意事项： 使用荧光显微镜时应注意以下事项：①观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本；②载玻片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质；③选用最好的滤片组；④荧光标本一般不能长久保存，若持续长霎时间照射(尤其是紫外线)易很快褪色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本；⑤启动高压汞灯后，不得在15分钟内将其关闭，一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降低汞灯的寿命；⑥若暂不观察标本时，可拉过阻光光帘阻挡光线。这样，即可避免对标本不必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数；⑦较长时间观察荧光标本时，最好戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛的保护[3]。 二、激光扫描共聚焦显微镜的结构特点及其在医学领域的主要用途 激光共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。另外在其载物台上加一个微量步进马达，可使载物台沿着Z轴上下移动，将样品各个层面移到照明针孔和检测针孔的共焦面上，样品的不同层面的图像都能清楚地显示，成为连续的光切图像[4]。 激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)具有高灵敏度、高分辨率、高放大率等特点。在医学领域主要用于细胞三维重建、细胞定量荧光测定、细胞内钙离子、pH值和其它离子的动态、细胞间通讯和膜的流动性等过程的研究[5]。 三、相衬显微镜的工作原理、结构特点及其主要用途 相衬显微镜的基本原理是把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见[6]。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。 相衬显微镜的结构特点：①环形光阑（annular  diaphragm）　位于光源与聚光镜之间，作用是使透过聚光镜的光线形成空心光锥，聚焦到标本上；②相位板（annular phaseplate）　在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ，并能吸收直射光(背景光)的光强，使直射光与衍射光的光强趋于一致，能更好地突出干涉的效果。 相衬显微镜主要用于观察活细胞和未染色的标本[7]。 四、偏光显微镜的结构特点、工作原理及其主要用途 偏光显微镜是利用光的偏掁特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光)的晶态、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器[8]。 偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光线转变成偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜，即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。移相装置是偏光显微镜在使用过程中不可缺少的附件[9]。全波片、半波片及1/4波片可以使通过波片的偏振光分别延迟2π、π和π/2的相位。而补偿器则可连续调节使通过的偏振光相位发生连续改变。移相装置对观察光的偏振性质是十分必要的。 五、微分干涉差显微镜原理及其在医学领域的主要用途。 微分干涉差显微镜(DIC)： 又称干扰或干涉显微镜。能看到和测定微小的位相变化，与位相显微镜相似，使无色透明的标本具有明暗和颜色的变化，从而增强反差。从起偏镜片出来的直线偏振光通过光束分解棱镜后，分成互相垂直振动的两条直线偏振光。两条光线经聚光器折射后射向样品。因样品内各个质点的折射射率不同，部分光波的位相改变及因干涉而发生横向偏移。两条光线通过物镜后经第二组光束分解棱镜相合并，由检偏镜发生干涉。终末像的每一个点是由物体上同一点的两个互相重叠的不同图像构成的一种混合像，从而使肉眼得以辨识[10]。 微分干涉差显微镜可以观察细胞、细菌等活体,而且影像呈立体感，较位相显微镜的影像更细致、更逼真。可用它对活细胞的各个部位作更精细的研究。 【参考文献】 [1] 谷祝平，光学显微镜[M]，兰州 : 甘肃人民出版社, 1985  [2] 郭舜玲，荧光显微镜技术[M]，北京 : 石油工业出版社, 1994.2. [3] 施心路，光学显微镜及生物摄影基础教程[M]，北京 : 科学出版社, 2002 [4] 朱祖福，激光扫描共聚焦显微镜[M]，北京 : 机械工业出版社, 1984 [5] 杨勇骥，实用生物医学电子显微镜技术[M]，上海 : 第二军医大学出版社, 2003 [6] 闫杰.陈新山.郭晖.刘念.张益鹄，共聚焦显微镜检测扩张型心肌患者心肌连接蛋白43达的研究 [J] ,《中国心血管病研究》, 2009(12):30-35 [7] 程时，生物医学电子显微镜技术[M]，北京 : 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1997 [8] 黄兰，显微镜与电子光学[M]，北京 : 科学出版社, 1991.12  [9] 杜学礼, 潘子昂，偏光显微镜分析技术[M]，北京 : 化学工业出版社, 1986 [10] 姚琲，微分干涉差显微镜分析原理[M]，天津 : 天津大学出版社, 2009