人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化_图文

人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化_图文 中国组织工程研究 第21卷 第9期 2017–03–28出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 28, 2017 Vol.21, No.9 www. CRTER.org 人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化 ， 1 ?研究原著? 李 萍12，王久存1，陆 瑶2，许惠利2(1上海复旦大学生命科学学院现代人类学教育部重点实验室，上海市 200433;2上海市干细胞技术有限公司，上海市 200051) 引用本文:李萍，王久存，陆瑶，许惠利. 人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化[J].中国组织工程研究，2017，21(9):1420-1425. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.020 ORCID:0000-0001-9713-3915(李萍) 文章快速阅读: 文题释义: 人羊膜来源干细胞:包括人羊膜上皮细胞、人羊膜间充质干细胞，表达多种干细胞标记物，具有较全面的多分化潜能，并且因具有“无致瘤性、免疫原性低、安全性高”等诸多胚胎干细胞和成体干细胞所不具备的优势和特点。 2 人羊膜上皮细胞:具有表达多种胚胎干细胞标记物的特点和较全面的多向分化潜能，随后Miki等研究证实了其向3胚层分化的潜能，除表达胚胎干细胞表面抗原SSSEA-3和SSSEA-4，肿瘤抗性基因TRA 1-60和TRA 1-81之外，近来发现人羊膜上皮细胞还表达多潜能干细胞的转录因子，例如Oct-4、Sox-2、Nanog和REX-1等及其他抗原，不表达CD34、SSSEA-1、CD133，弱表达c-kit(CD117)和CC趋化因子受体(CRR4)。 摘要 背景:人羊膜上皮细胞来源稳定，正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。 目的:建立人羊膜上皮细胞体外分离培养、成脂、成软骨、成骨诱导分化的方法。 方法:通过胰蛋白酶消化法从人胎盘羊膜中分离羊膜上皮细胞，进行体外培养与鉴定，观察培养12 d内的细胞生长曲线。取P1代羊膜上皮细胞，分别进行成脂、成软骨、成骨诱导，以常规培养细胞为对照，诱导16 d后，分别进行油红O染色、Masson染色及碱性磷酸酶染色，同时采用荧光定量PCR检测诱导过程中成脂转录因子、?型胶原蛋白、骨桥蛋白、 3 碱性磷酸酶mRNA表达变化。 结果与结论:?从人羊膜中分离出的羊膜上皮细胞，免疫荧光检测表达上皮细胞标记物CK19;?P1代细胞具有较强的分裂增殖能力，P2细胞与P1相比增殖能力略有下降，P3细胞增殖能力最差;?羊膜上皮细胞经成脂、成软骨、成骨诱导后，油红O染色有红色脂滴，Masson染色有亮蓝色软骨基质，碱性磷酸酶染色有红褐色钙结节;随着诱导时间的延长，成脂转录因子、?型胶原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达量升高;?结果表明，采用酶消化法可从人羊膜中分离得到羊膜上皮细胞，羊膜上皮细胞可向脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞分化。 关键词: 干细胞;分化;羊膜上皮细胞;诱导分化;成脂细胞;成骨细胞;成软骨细胞 主题词: 羊膜;上皮细胞;成脂分化;组织工程 Human amniotic epithelial cells: isolation, identification and multi-directional differentiation 4 Li Ping1, 2, Wang Jiu-cun1, Lu Yao2, Xu Hui-li2 (1Ministry of Education Key Laboratory of Contemporary Anthropology, Life Science Institute, Fudan University, Shanghai 200433, China; 2Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd., Shanghai 200051, China) Abstract BACKGROUND: Human placenta is a stable source for human amniotic epithelial cells, which is becoming a cell source in the regenerative medicine that attracts widespread attentions. OBJECTIVE: To establish the method of isolation, culture, and adipogenic, chondric and osteogenic differentiation of human amniotic epithelial cells. 1420 5 P.O. Box 10002, Shenyang 李萍，女，1986年生，安徽省合 肥市人，汉族，2009年华东师范大学毕业，复旦大学在读硕 士，主要从事免疫学、干细胞方面的研究。 中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2017)09-01420-06 稿件接受: 2016-12-10 Li Ping, Studying for master’s degree, Ministry of Education Key Laboratory of Contemporary Anthropology, Life Science Institute, Fudan University, Shanghai 200433, China; Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd., Shanghai 200051, China www.CRTER.org 110180 李萍，等. 人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化 www. 6 CRTER.org METHODS: Trypsin-EDTA digestion was used to isolate human amniotic epithelial cells from human amnion tissue, which were then cultured and identified in vitro. The growth curve of the cells was observed in 12 days. Passage 1 human amniotic epithelial cells were induced to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts, and conventional cultured cells were used as controls. After 16 days induction, oil red O, Masson and alkaline phosphates staining methods were carried out, and adipogenic transcription factor, type II collagen, osteopontin, alkaline phosphatase mRNA expressions were detected using real-time fluorescene quantitative PCR. RESULTS AND CONCLUSION: Human amniotic epithelial cells were successfully obtained from human amnion tissue. Immunofluorescence data showed the expression of epithelial cell surface marker CK19. Passage 1 cells had a strong ability to divide and proliferate. Compared with passage 1 ones, passage 2 cells showed a slight decrease in 7 proliferation ability, and the proliferation ability of passage 3 cells was the worst. Red lipid droplets, brilliant blue cartilage matrix and reddish brown calcium nodes were detected by oil red O, Masson and alkaline phosphates staining after adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation, respectively. With the time prolonged, the expressions of adipogenic transcription factor, type II collagen, osteopontin and alkaline phosphatase mRNA were increased. These results demonstrated that human amniotic epithelial cells could be isolated from human amniotic membrane by enzyme digestion method, and these amniotic epithelial cells could be induced to differentiate into differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. Subject headings: Amnion; Epithelial Cells; Adipogenesis; Tissue Engineering Cite this article: Li P, Wang JC, Lu Y, Xu HL. Human amniotic epithelial cells: isolation, identification and multi-directional differentiation. Zhongguo Zuzhi 8 Gongcheng Yanjiu. 2017;21(9):1420-1425. 0 引言 Introduction 人羊膜来源干细胞表达多种干细胞标记物[1-5]，具有较全面的多分化潜能，并且因具有“无致瘤性、免疫原性低、安全性高”等诸多胚胎干细胞和成体干细胞所不具备的优势和特点[6-9]，能向3个胚层来源的不同组织细胞分化，如神经细胞[1,10-12]、心肌细胞[10]、肝细胞[13-14]、胰岛细胞[13-15]、皮肤和毛囊细胞等[16]。在眼科领域，He等[17]将人角膜缘上皮干细胞和人羊膜上皮细胞共培养后，成功移植到新西兰白兔角膜缘碱烧伤模型的角膜表面。Wei等[18]研究证实，人羊膜上皮细胞移植入糖尿病小鼠脾脏内，使其血糖水平在数月内恢复了正常。因此，人羊膜上皮细胞作为组织工程的种子细胞，在细胞治疗及干细胞增殖分化研究模式等有着广阔的应用前景。 在临床移植上，常使用自体成骨或同种异体骨进行移植，但骨移植有来源有限、免疫排斥反应等诸多缺陷。成骨中有骨桥蛋白，软骨中有?型胶原蛋白。骨桥蛋白在多种组织均可表达，如骨、肾、肺、肝、膀胱等。大量研究表明，骨桥蛋白能增强巨噬细胞和T细胞向炎症部位趋化、黏附及移行， 9 参与组织修复及炎症过程[19-20]。?型胶原蛋白能使机体产生免疫耐受，对类风湿关节炎有较好的防治效果，可有效抑制T细胞因子引起的关节组织内部对特异性隐蔽抗原的自身免疫反应[21-22]。从脂肪组织中分离高纯度且处于同一时期的脂肪细胞也有一定难度[23]。成脂转录因子处于脂肪细胞分化转录调控网络的中心位置[24]，在脂肪细胞分化早期起到不可或缺的作用，活化的成脂转录因子不仅能够促进脂肪细胞分化，增加脂肪细胞的数量，也可使参与脂肪生成、转运、储存、氧化等过程的基因表达量升高[25]。若能从人羊膜中获得羊膜上皮细胞，通过体外诱导，检测人羊膜上皮细胞在诱导过程中目的基因的表达变化及趋势，探讨不同诱导时期人羊膜上皮细胞在成脂、成骨、成软骨细胞和类胚胎干细胞性质方面所体现出来的异质性，可为骨细胞移植及研究脂肪代谢疾病的细胞治疗提 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 供新手段。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞学体外观察实验。 10 1.2 时间及地点 实验于2015年5月至2016年2月在上海市干细胞技术限公司实验室完成。 1.3 材料 人足月胎盘羊膜由上海市新华医院提供，供者对实验知情同意情况，符合伦理要求。产妇产前检查排除感染梅毒、艾滋病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒，标本采集后保存于4 ?冰箱内并在24 h内完成实验。 主要试剂及仪器:成骨诱导试剂盒、成软骨诱导试剂盒、成脂诱导试剂盒、低糖DMEM培养基、胰蛋白酶(含EDTA)、胎牛血清、PBS(Gibco);Masson染液试剂盒、碱性磷酸酶染液试剂盒、油红O染液试剂盒(南京建成科技有限公司);抗生素(青链霉素)(PAN Biotech);TaqMan? Gene Expression Cells-to-CTTM Kit、TaqMan? Gene Expression assays(Ambion);100 mm培养皿、6孔板、8连管(Corning公司);倒置显微镜(Nikon，日本);荧光倒置相差显微镜(Olympus，日本);二氧化碳培养箱、台式离心机(Thermo，美国);生物安全柜(苏州净化);移液器(Gilson);Roche Light Cycler? 96(罗氏公司);流式细胞仪(BD公司);PI试剂、RNA酶(Sigma公司)。 1.4 实验方法 11 羊膜上皮细胞的分离:紫外消毒生物安全柜，准备无菌手术镊、手术剪，取出无菌磁盘，置于生物安全柜的台面上;使用无菌手术镊、手术剪剥取胎盘表面的羊膜。从羊膜中分离羊膜上皮细胞的方法和步骤:?将羊膜置于直径100 mm培养皿，培养皿中装有1/2体积的含有抗生素的(1%青链霉素)PBS;?用手术镊夹持羊膜进行漂洗，重复漂洗二三遍，去除血细胞;?转移羊膜至50 mL离心管中;?向离心管中加入0.1%胰蛋白酶(组织体积:胰蛋白酶体积= 1421 李萍，等. 人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化 1?2)，置于摇床内37 ?、250 r/min振荡，10 min后加入低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)终止消化;?用手术镊取出羊膜，转移至50 mL离心管中，向离心管中加入0.1%胰蛋白酶(组织体积:胰蛋白酶体积=1?2)，置于摇床内37 ?、250 r/min振荡，15 min后加入低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)终止消化;?弃组织，收集消化液，加PBS至50 mL，2 500 r/min离心5 min;?弃上清，加入2 mL完全培养基，取10 μL细胞悬液用于细胞计数;?按照4×106/皿接种若干个Φ100 mm培养皿，37 ?体积分数5%CO2培养;?48 h换液，以后每2 d换液1次， 12 直至细胞可以进行传代。 羊膜上皮细胞的传代培养:当细胞生长至90%时，每个Φ100 mm培养皿加入2 mL 0.25%胰蛋白酶进行消化传代。消化2 min，加低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中， 2 000 r/min离心5 min，弃上清，计数，按照4×106/皿接种(Φ100 mm培养皿)，置于37 ?、体积分数5%CO2培养。 免疫荧光鉴定羊膜上皮细胞:?取出6孔板，将涂有多聚赖氨酸的载玻片置于孔内;?将P1代人羊膜上皮细胞以5×108 L-1 的细胞浓度接种于6孔板内;?细胞爬片后按以下步骤进行染色:PBS漂洗3次，细胞经40 g/L多聚甲醛溶液室温固定15 min;PBS 漂洗3次，正常体积分数10%羊血清封闭1 h;加入CK19(1?100)，4 ?孵育48 h;PBS漂洗3次，加入羊抗人IgG-FITC (1?100)，室温孵育2 h;漂洗、晾干、封固后荧光显微镜下观察。 细胞周期及生长曲线的测定:取P1代细胞，经含0.25%胰蛋白酶消化，以1×105的密度接种于6孔板，每板接种4孔， 13 每孔1 mL，共计6板，每2 d取1板计数，连续培养12 d，每3 d换一次低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清);以培养时间为横坐标，细胞总数为纵坐标绘制细胞生长曲线。将1 mL体积分数为75%的冰冻乙醇分别加入离心好的P0、P1、P2、P3代细胞内重悬均匀，放置于4 ?过夜，次日加入RNase，在37 ?下孵育30 min，再加入3 mg/L PI，在4 ?下放置30 min，送流式细胞仪测定细胞周期。 体外向脂肪细胞诱导分化:取P1代羊膜上皮细胞，按照6×104 /孔接种于6孔板，设1个阴性对照孔、2个实验孔。阴性对照组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，每4 d换液一次;实验用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，24 h后换成成脂诱导试剂;每4 d换一次成脂诱导试剂，成脂诱导16 d进行油红O染色。 成脂诱导荧光定量PCR检测:取成脂诱导0，4，8，12，16 d的细胞，使用TaqMan? Gene Expression Cells-to-CTTM Kit反转录cDNA链。根据实验要求，使用TaqMan? Gene Expression assays中的成脂转录因子为引物，荧光定量PCR检测成脂转录因子mRNA表达量。并以β-actin为内参，实 14 验重复3次。PCR结束后收集Ct值，实验使用2- ??Ct法对数据进行分析。 1422 www. CRTER.org 体外向成骨细胞诱导分化:取P1代羊膜上皮细胞，按照6×104/孔接种6孔板，1个阴性对照孔，2个实验孔。阴性对照组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，每4 d换液一次;实验组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，24 h后换成成脂诱导试剂，每4 d换一次成骨诱导试剂。诱导16 d进行碱性磷酸酶染色。 成骨诱导荧光定量PCR检测:取成骨诱导0，4，8，12，16 d的细胞，使用TaqMan? Gene Expression Cells-to- CTTM Kit反转录cDNA链。根据实验要求，使用TaqMan? Gene Expression assays中的骨桥蛋白、碱性磷酸酶为引物，荧光 15 定量PCR检测骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达量。并以β-actin为内参，实验重复3次。PCR结束后收集Ct值，实验使用2- ??Ct法对数据进行分析。 体外向成软骨细胞诱导分化:取P1代羊膜上皮细胞，按照6×104/孔接种6孔板，1个阴性对照孔，2个实验孔。阴 性对照组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，每4 d换液一次;实验组用低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养，24 h后换成成脂诱导试剂，每4 d换一次成软骨诱导试剂。诱导16 d进行Masson染色。 软骨诱导荧光定量PCR检测:取成软骨诱导0，4，8，12，16 d的细胞，使用TaqMan? Gene Expression Cells-to-CTTM Kit反转录cDNA链。根据实验要求，使用TaqMan? Gene Expression assays中的?型胶原蛋白为引物，荧光定量PCR检测?型胶原mRNA表达量。并以β-actin为内参，实验重复3次。PCR结束后收集Ct值，实验使用2- 16 ??Ct法对数据进行分析。 荧光定量 PCR引物: 基因 产品货号 扩增 基因 NCBI数据库中 非重复 长度 编号 染色体定位 序列 骨桥蛋白 Hs00959010 84 bp 6696 17 Chr.4: 88896802 - Hs.313 88904563 成脂转录因子 Hs00234592 77 bp 5468 Chr.3: 12329349 - Hs.162646 12475855 碱性磷酸酶 Hs01029144 79 bp 249 Chr.1: 21835858 - Hs.75431 21904905 ?型胶原蛋白 Hs00264051 124 bp 1280 Chr.12: 48366748 Hs.408182 - 48398285 18 β-actin Hs00969077 64 bp 56288 Chr.10: 34398488 Hs.131489 - 35104253 1.5 统计学分析 使用Rstudio统计软件进行单因素方差分 析，以P < 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 人羊膜上皮细胞免疫荧光鉴定 在荧光显微镜 633 nm激发光条件下，人羊膜上皮细胞经CK19染色后呈阳性， 结果显示细胞具有上皮细胞特性(图1)。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 李萍，等. 人胎盘羊膜上皮细胞的分离鉴定及多向诱导分化 19 www. CRTER .org A B 图注:图中A为P0代细胞培养12 d;B为人羊膜上皮细胞在倒置显微镜下的明场图;C为人羊膜上皮细胞经CK19染色后呈阳性。 20 图 1 人羊膜上皮细胞的培养与鉴定(×200) Figure 1 Culture and identification of human amniotic epithelial cells (×200) 阴性对照组 实验组 油红O染色 碱性磷酸酶染色 Masson染色 图3 人羊膜上皮细胞向成脂、成骨和成软骨细胞诱导分化 的鉴定(×200) Figure 3 Adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation of human amniotic epithelial cells (×200) 图注:实验组成脂诱导油红O 染色可见红色脂滴，成骨诱导碱性磷酸酶染色可见红褐色钙 结节;成软骨诱导Masson染色可见亮蓝色软骨基质;阴性 对照组油红O染色见少量脂滴，碱性磷酸酶染色未见钙结 21 节，Masson染色未见软骨基质。 M D A 1 2 3 4 5 M B 22 1 2 3 4 5 M C 1 2 3 4 23 5 1 2 3 4 5 M E ?型胶原蛋白 细胞数(×10) 5 24 0 4 8 12 16 诱导天数(d) 图4 不同诱导后人羊膜上皮细胞中成脂转录因子、?型胶 原蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达 Figure 4 Expressions of adipogenic transcription factor, type II collagen, osteopontin, alkaline phosphatase mRNA in human amniotic epithelial cells after adipogenic, chondrogenic, and osteogenic induction 图注:?图中A为成脂诱导后人羊膜上皮细胞中成脂转录因 子mRNA RT-PCR图像;B为成软骨诱导后人羊膜上皮细胞 中?型胶原蛋白mRNA RT-PCR图像;C为成骨诱导后人羊 膜上皮细胞中骨桥蛋白mRNA RT-PCR图像;D为成骨诱导 后人羊膜上皮细胞中碱性磷酸酶mRNA RT-PCR图像;M 为Marker;1为对照组;2-5为诱导4，8，12，16 d。?E 为诱导0，4，8，12，16 d期间，成脂转录因子、?型胶原 蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的mRNA表达，使用R语言 进行单因素方差统计，Pr < 0.05。 25 表 1 不同代次人羊膜上皮细胞周期 Table 1 Cell cycles of human amniotic epithelial cells at different passages 相对灰度值/β-actin 0 2 4 6 8 10 12 培养时间(d) 图2 不同代次人羊膜上皮细胞的生长曲线 Figure 2 Growth curves of human amniotic epithelial cells at different passages 图注:P1代细胞具有较强的分裂增殖能力，约在第2天进入 26 明显的 对数生长期，在第6天进入平台期;P2代细胞与P1代相比增殖能力 略有下降;P3代细胞增殖能力最差，且细胞无明显的对数生长期。 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 2.2 人羊膜上皮细胞的细胞周期及生长曲线 流式细胞仪对细胞周期分析结果，见表1，使用R语言进行单因素方差统计，差异有显著性意义(Pr < 0.05)。从中可以看出，随着传代次数的增加，细胞处于静止期(G0/G1期)的比例有所下降，细胞处于增殖期(G2/M+S期)的比例有所 1423 百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆! 27