乙肝抗体论文（快速测定方法的建立）

乙型肝炎病毒表面抗体（乙肝疫苗保护性抗体）快速测定方法的 建立和应用评价 【摘要】目的 开发一种快速、敏感的乙型肝炎病毒表面抗体（乙肝疫苗保护性抗体）测定方法。方法 以纳米胶体金颗粒作为示踪粒子标记重组乙型肝炎病毒表面抗原，经离心纯化、紫外扫描以确定标记条件，在硝酸纤维素膜上包被重组乙型肝炎病毒表面抗原，制成双抗原夹心快速测定试纸，用乙型肝炎病毒表面抗体国家参考品确定最终反应体系。结果 该方法组装成的快速测定试纸可通过乙型肝炎病毒表面抗国家参考品的测定灵敏度10mIU/ml，20人份阴性参考品均为阴性。结论 成功建立了测定乙型肝炎病毒表面抗体（乙肝疫苗保护性抗体）的快速测定试纸条。本试纸条10分钟内即可完成检测，对乙型肝炎表面抗体的测定灵敏度达到10mIU/ml，具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点，对测定人血液中乙型肝炎病毒表面抗体或乙肝疫苗接种后乙肝疫苗保护性抗体的有效性评价具有应用价值。 【关键词】乙型肝炎病毒表面抗体 快速测定试纸 灵敏度10mIU/ml Determination and Evaluation of Rapid Determination Method for Hepatitis B Virus Surface Antibody (hepatitis B vaccine protective antibodies) Abstract [Objective] To develop a rapid and sensitive method to determination and evaluation for hepatitis B surface antibody (hepatitis B vaccine protective antibodies) [Methods] To nano-colloidal gold particles as tracer particles labeled recombinant hepatitis B surface antigen, purified by centrifugation, UV scan to determine the labeling conditions, the nitrocellulose membrane coated with recombinant hepatitis B surface antigen, made of double antigen sandwich Determination of test paper, hepatitis B surface antibody with a national reference system to determine the final response. Compared with the Enzyme linked immunosorbent assay kit with 1042 serum samples, 62 plasma samples, 92 clinical whole blood samples, respectively. [Results] The method of rapid determination of test strips assembled by hepatitis B virus surface anti-national reference for the determination of the sensitivity 10mIU/ml, 20 negative reference materials were negative. On 1042 cases of clinical serum samples, 62 plasma samples and 92 clinical whole blood samples Compared with the enzyme linked immunosorbent assay reagent line were 96.2%, 96.8% and 95.7,respectively. [Conclusion] Successfully established for the determination of hepatitis B virus surface antibody (hepatitis B vaccine protective antibodies) rapid determination of test strip, the method can determine the person's whole blood, serum, plasma samples of hepatitis B virus surface antibody (hepatitis B vaccine protective antibodies ). The strip test can be completed within 10 minutes, the determination of hepatitis B surface antibody sensitivity to 10mIU/ml, a simple, rapid, no special equipment, etc, on the determination of human blood in hepatitis B surface antibody or hepatitis B vaccine after inoculation of hepatitis B vaccine effectiveness evaluation of protective antibodies have application value. [keywords] Hepatitis B virus surface antibody; Rapid determination of test paper; Sensitivity 10mIU/ml 1.乐山市疾病预防控制中心 2.四川大学华西基础医学与法医学院 3. 四川迈克生物科技股份有限公司 范黎，副主任医师，免疫规划 王保宁：通讯作者，副研究员，博士 本课题为四川省卫生厅和乐山市科技局立项课题，并获的乐山市科技进步一等奖 乙型病毒性肝炎（以下简称乙肝）在我国广泛流行，严重危害广大人民群众的身体健康。乙肝疫苗接种是预防乙型病毒性肝炎最有效的手段，我国将乙肝疫苗纳入免疫管理，全国每年有近5000万人份的乙肝疫苗接种，但到目前没有灵敏度高特异性好的快速检测试剂供各级疾病预防控制中心日常监测疫苗抗体水平变化，这使各级疾病预防控制中心评价疫苗效果、确定重点接种人群和制定免疫计划十分困难，急需要乙型肝炎病毒表面抗体（乙肝疫苗保护性抗体）的快速检测试剂。本研究通过免疫纳米胶体金技术成功的解决了这一难题。 1 与方法 1.1 材料 1.1.1 乙肝表面抗原、抗体及品 乙肝表面抗原（rHbs Ag1），采用基因重组技术、分子克隆构建质粒、酵母表达、纯化制备，缓冲液为0.01M PBS pH=7.2，防腐剂为0.1%叠氮钠，浓度为5mg/ml。短期保存2-8℃，长期保存-20℃。 羊抗乙肝表面抗原多克隆抗体，购自杭州隆基生物技术有限公司，山羊免疫，免疫原为乙肝表面抗原，硫酸铵辛酸法纯化，缓冲液为0.01M PBS pH=7.2，防腐剂为0.1%叠氮钠，浓度为4.5mg/ml，乙型肝炎病毒表面抗体国家参考品，购自中国药品生物制品检定所，批号0408，数量24支，其中3支灵敏度参考品，浓度分别为2mIU/ml、5mIU/ml和10mIU/ml，20支阴性参考品和1支精密性参考品。短期保存2-8℃，长期保存-20℃。HAuCl4·4H2O，分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；Na3C6H5O7·2H2O，分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白，生物纯，上海西宝生物技术有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜），化学纯，上海金标生物技术有限公司；玻璃纤维膜，化学纯，上海金标生物技术有限公司。紫外分光光度计、低温冷冻离心机，购自美国贝克曼公司；ZQ2000切条机、HM3020两维划膜仪购自上海金标生物技术有限公司。 1.2 试验方法 1.2.1 胶体金的制备及其鉴定： 按照Frens法【1】制备胶体金溶液，取500ml纯化水于圆底烧瓶中，加入1%氯金酸溶液5ml，于加热套中加热至沸腾，快速加入1％柠檬酸三钠溶液5mL，继续煮沸10 min，冷却至室温，紫外分光光度计测定最大吸收波长。【2】 1.2.2 乙肝表面抗原最佳标记pH的确定： 分别取1ml胶体金溶液于9只洁净的离心管中，用0.1 M 碳酸钾缓冲液分别调节pH至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，混匀后各加入重组乙肝表面抗原40ug，混匀后静置30分钟，各加入10%氯化钠溶液100ul，再继续搅拌后静置30min，观察胶体金加入乙肝表面抗原前后的颜色变化。选择加入乙肝表面抗原后胶体金颜色依然保持红色的pH最为最佳标记pH。【4】【5】【6】 1.2.3 乙肝表面抗原最佳标记蛋白量的确定： 取1ml胶体金溶液于10只洁净的离心管中，用0.1 M 碳酸钾缓冲液分别调节pH至8.0，混匀后分别加入重组乙肝表面抗原5 ug 、10 ug、15 ug 、20 ug 、25 ug、30 ug 、35 ug 、40 ug、45 ug和50ug，混匀后静置30分钟，各加入10%氯化钠溶液100ul，再继续搅拌后静置30min，观察胶体金加入乙肝表面抗原前后的颜色变化。选择加入乙肝表面抗原后胶体金颜色依然保持红色的最低加入蛋白量最为最佳标记蛋白量。 1.2.4 乙肝表面抗原金标复合物最佳离心条件的确定： 按照1.2.2和1.2.3的标记条件制备乙肝表面抗原金标复合物，通过设置离心力为6000×g、8000×g、10000×g、12000×g和14000×g离心30分钟，观察离心管底部红色的乙肝表面抗原金标复合物和上清液的颜色，选择完全将乙肝表面抗原金标复合物沉降到离心管底部并保持松散结构的离心力最为乙肝表面抗原金标复合物最佳离心条件。 1.2.5 乙肝表面抗原金标复合物包被及干燥： 按照1.2.2、1.2.3和1.2.4的条件制备乙肝表面抗原金标复合物，最终用1/10体积的复溶液溶解，分别用复溶液将上述浓缩液稀释，最终浓度为OD540nm=2、3、4、5和6，分别均匀涂布在玻璃纤维膜上，真空干燥2小时后取出于干燥条件下保存备用。【3】【7】【8】 1.2.6 硝酸纤维素膜的包被及干燥： 将重组乙肝表面抗原用包被液稀释成1mg／ml，羊抗乙肝表面抗原多克隆抗体用包被液稀释成1mg／ml，用划膜仪包被在硝酸纤维素膜上，37℃过夜干燥后取出于干燥条件下保存备用。。 1.2.7 样品垫预处理： 将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡处理，37℃鼓风干燥箱过夜干燥后，用裁纸刀切割成18mm宽的玻璃纤维样品垫。 1.2.8 试纸条的组装： 试纸条由吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫、金垫和底板组成，将各部分依次粘贴到底板上，用切条机切成4mm宽的条，加干燥剂密封于铝泊袋中。 1.2.9 分析性能研究： 将5种不同条件的半成品试纸条用中国生物制品鉴定所乙型肝炎病毒表面抗体国家参考品检测。检测试纸条放于水平桌面上，取2滴（约80ul）待测样品滴于加样处，加样10 min时读取结果，10 min后的结果无效。结果判断标准：检测试纸条纤维素膜上分别出现一条红色的质控线(靠近吸水纸端)和一条红色的检测线（靠近样品垫端）为阳性；仅出现一条红色质控线则为阴性。如果无红色质控线出现则视为试剂无效。 1.2.10稳定性研究： 将试纸放置于42℃，分别于第1，3，5，7天，检测其分析性能；将试纸放置于37℃，分别于第7，14，21天，检测其分析性能；将试纸放置常温，分别于第1、3，6、9、12、15、18和19个月，检测其分析性能。 1.2.11 干扰试验： 添加不同浓度的EDTA、肝素钠、乳糜微粒、胆红素以及血红蛋白，研究抗凝剂、溶血、脂血等样本对检测结果的影响。 2 结果与结论 2.1 胶体金制备及其鉴定 （λ） 图1 胶体金颗粒紫外分光光度计连续波长扫描结果 经紫外分光光度计扫描，制备的胶体金在526nm出现最大吸收峰，而其余波段无吸收峰，说明胶体金颗粒大小均一 (检测结果见图1)。 2.2 乙肝表面抗原最佳标记pH的确定： 观察标记前后的胶体金溶液的颜色变化，标记pH为6.0、6.5、7.0和7.5时，胶体金在加入氯化钠后发生凝集，颜色发生显著性变化。标记pH在8.0以上时，胶体金标记前后无显著性颜色变化，因此确定pH＝8.0为乙肝表面抗原最佳标记pH。具体实验结果见表1。 表1 最佳标记pH确定试验结果 pH 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 标记前 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 标记后 黑色 黑色 蓝色 紫红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 2.3 乙肝表面抗原最佳标记蛋白量的确定： 观察标记前后的胶体金溶液的颜色变化，标记蛋白量为5ug、10ug、15ug、20ug和25ug时，胶体金在加入氯化钠后发生凝集，颜色发生显著性变化。标记蛋白量在30ug以上时，胶体金标记前后无显著性颜色变化，因此确定pH蛋白量为30ug为乙肝表面抗原最佳标记pH。具体实验结果见表2。 表2 最佳标记蛋白量确定试验结果 蛋白量 5ug 10ug 15ug 20ug 25ug 30ug 35ug 40ug 45ug 50ug 标记前 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 标记后 黑色 黑色 蓝色 蓝色 紫红 酒红 酒红 酒红 酒红 酒红 2.4 乙肝表面抗原金标复合物最佳离心条件的确定： 表3 最佳离心条件确定试验结果 离心力 6000×g 8000×g 10000×g 12000×g 14000×g 沉淀 松散 松散 松散 松散 紧密 上清 红色 红色 无色 无色 无色 离心力过低造成胶体金蛋白复合物不能全部分离沉淀到离心管底部，离心力过高造成胶体金蛋白复合物由于外力过高导致凝集，通过调整离心力大小选择适合的离心力。通过表5可得出，离心力在10000×g－12000×g时，胶体金蛋白复合物既能全部沉降到离心管底部，又不会造成凝集死金。 2.5 分析性能研究： 表4 分析性能试验结果 OD540nm 2 3 4 5 6 灵敏度P10 阴性 阴性 阳性 阳性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 19/20 18/20 通过配比胶体金蛋白复合物工作浓度和检测线乙肝表面抗原包被浓度，用乙型肝炎病毒表面抗体国家参考品评价和确定最佳的反应体系，从实验结果表6可知，金标蛋白复合物在 OD540nm＝4，检测线包被浓度为1mg/ml时，能够达到10mIU/ml的检测灵敏度，同时20人份阴性参考品均为阴性。 2.6 稳定性研究： 表5 42℃加速试验结果 1天 3天 5天 7天 灵敏度P10 阳性 阳性 阳性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 20/20 本产品置于42℃条件下7天，产品的灵敏度和特异性均符合国家参考品的要求，因此，本产品在42℃条件下保存7天产品性能可保持稳定。 表6 37℃加速试验结果 7天 14天 21天 灵敏度P10 阳性 阳性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 本产品置于37℃条件下20天，产品的灵敏度和特异性均符合国家参考品的要求，因此，本产品在37℃条件下保存20天产品性能可保持稳定。 表7 常温稳定性试验结果 1月 3月 6月 9月 12月 15月 18月 19月 灵敏度P10 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 本产品置于常温条件下19个月，产品的灵敏度和特异性均符合国家参考品的要求，因此，本产品在常温条件下保存1年产品性能可保持稳定，符合产品对于有效期18个月的要求。 2.7 干扰试验研究 表8 EDTA干扰试验结果 8% 4% 2% 1% 0% 10mIU/ml 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 表9 肝素钠干扰试验结果 2000U/L 1500U/L 1000U/L 500U/L 250U/L 0 U/L 10mIU/ml 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 从表8和表9可知，待测样品中含有0％－8％的EDTA或1U/L-2000U/L肝素钠，对本产品的分析性能无干扰。 表10 血红蛋白干扰试验结果 50g/L 40g/L 30g/L 20g/L 10g/L 0g/L 10mIU/ml 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 表11 胆红素干扰试验结果 5000uM/L 4000uM/L 3000uM/L 2000uM/L 1000uM/L 0 uM/L 10mIU/ml 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 从表10和表11可知，待测样品中含有10g/L－50g/L的血红蛋白或1000uM/L-5000uM/L的胆红素，由于血红蛋白和胆红素两种物质本身为红色，造成硝酸纤维素膜背景变红，而胶体金的颜色也为红色，对检测线的观察存在影响，进而易影响误判为阴性结果，因此血红蛋白和胆红素两种物质对本产品的分析性能存在干扰。 表12 乳糜微粒干扰试验结果 50000 40000 30000 20000 10000 0 10mIU/ml 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 特异性 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 从表12可知，待测样品中含有0－5000个单位的乳糜微粒，对本产品的分析性能无干扰。 3 讨论 免疫纳米胶体金技术是80 年代继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，现在已经发展到凝集试验、光镜染色、免疫印迹、免疫斑点渗滤法以及免疫层析技术等。因为具有强稳定性，金标记在80年代后期被引入到快速诊断试剂中。在合适的生产条件下，任何精确大小的金颗粒都可以生产。不同的大小有不同的应用。生产的高稳定性、高灵敏度、高精度和高可重复性使得金适合用于在快速诊断试剂中。如制造正确，金是惰性的球型颗粒。当连接正确时，蛋白质能牢固地结合在金颗粒表面，无论是液态或固态都能保持长久的稳定性。稳定生产能使金标的非特异性结合为零。 目前已广泛应用于临床诊断，尤其是在医学临床检验中的应用，如早孕、乙肝、寄生虫、性病和病毒细菌病的检测。该方法最大特点是单份测定、简单快速、特异敏感，像层析试纸条技术，不需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验结果。该技术现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。 本产品采用双抗原夹心法，试纸条上含有事先固定在硝酸纤维素膜上的乙肝表面抗原作为检测线和控制区相应的抗体。采用40nm的胶体金颗粒作为指示粒子，通过特殊处理将红色的胶体金颗粒与高特异性的乙肝表面抗原偶连后均匀铺在金标垫上干燥，如果检测样本中含有乙肝表面抗体，则会在检测线和质控线各显示一条红色的条带。如果样本中不含有乙肝表面抗体，则只在质控线显示一条红色的条带。由于国内现有用于检测乙肝表面抗体的试剂用的抗原为血源性乙肝表面抗原，来源有限、成分复杂只能检测30mIU/ml的灵敏度，达不到做为筛查乙肝疫苗保护性抗体10mIU/ml的灵敏度要求，并且从人的血液中提取乙肝表面抗原存在潜在的危险性等缺点。我公司采用高质量高活性高亲和力的基因重组乙肝表面抗原，既消除了血源性抗原的潜在传染性，又可达到用来筛查乙肝疫苗保护性抗体10mIU/ml的灵敏度要求，在检测乙肝疫苗保护性抗体领域国内还是首次应用。 参考文献 [1] Frens G. Preparation gold dispersions of varying particle size:controlled nucleation for the regulation of the particle size inmonodisperse gold solutions. Nature Physical Science, 1973, 241:20-22. [2] 孙秀兰, 赵晓联, 汤 坚. 单分散性胶体金的制备工艺优化. 免疫学杂志, 2004, 20(2): 151-154.Sun X L, Zhao X L, Tang J. Optimization of preparation technique of monodispersion colloidal gold. Immunological Journal, 2004, 20(2):151-154. (in Chinese) [3] 孙东坡, 胡一桥. 蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机制.药学进展, 2003, 27 (4): 201-205.Sun D P, Hu Y Q. Stabilizing excipients in the freeze-dried protein formulations and their protective mechanisms. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2003, 27 (4): 201-205. (in Chinese) [4] 李永勤.以膜为固相载体的免疫胶体金快速试验[J].微生物学免疫学进展,2003,31(1):74-78. [5] Jones K D. Troubleshooting protein binding in nitrocellulose membranes,Part 2: Common problems[J]. IVD Technology,1999,5:26-35. [6] Jones K.D. Troubleshooting protein binding in nitrocellulose membranes,Part1: Principles[J]. IVD Technology, 1999,5:32-41. [7] Roth J.The colloidal gold marker system for light and electron microscopy cytochemistry [A]. Techniques in immunocytochemistry [C]. New York: Academic,1983,2:217-220. [8] Geoghegan W. D. The effect of three variables on absorption of rabbit IgG to colloidal gold [J]. Journal of Histochemistry and Cytochemistry,1988,36(4):401-407. PAGE 1 _1330844283.bin