复方五仁醇胶囊主要成分的定性定量分析

冶 法 方 药。 复方五仁醇胶囊主要成分的定性定量 窦志华 ·2 丁安伟 2 王陆军 1 张 兵 居文政 (1、南通大学附属南通第三医院，江苏南通 226006；2、南京中医药大学，江苏南京 210029； 3．南京中医药大学附属 医院，江苏南京 210029) 摘 要 目的 ：对复 方五仁 醇胶囊所含主要 成分进行定性定量 分析 ，为该制剂 药效 物质研 究奠 定基 础 方 法：使 用高效液相 色谱 一二极 管阵列检测 器(HPLC—DAD)和超 高效液相 色谱一串联质谱 (UPLC—MS／MS)检测相 结合进行成 分定性 分析 ，分别采用 紫外检 测器和蒸发光散射检测 器测 定主要 木脂 素类和皂苷类成分的含量 结果 ：液相 色谱 图显示峰 面积大于总峰面积 0．1％的成分 27个，通过 对照品比对鉴定出三七皂苷 R 、人参皂苷 R 、人参皂苷 RbI、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、 五味子 甲素和五味 子 乙素 8个成分 ，结合文献资料初步推测 出米辛 J、戈米辛 N和五味子 丙素 3个成 分 ：UPLC—MS／MS分别鉴定出木脂素类成分 8个，其 中包括 戈米辛 J、戈米辛 N和五味子丙素。分别建 立了同时测定 5种木脂 素类成分和 3种 皂苷类成分含 量的方法 结论 ：复方五仁醇胶囊主要成分 包 括木脂素和皂苷两大类 ．以木脂 素类成分 为主 ，这 两类成分可能是该制剂的主要药效物质。 关键词 复方五仁醇胶 囊 木 脂素 皂苷 超 高效液 相 色谱一 串联 质谱 二极管 阵列检 测器 蒸发光散射检测器 中图分类号 R289．5 文献标识码 A 文章编号 1672—397X(2008)02-0065-03 中药复方是 中药用药的主要形式 ．药效物质基 础是中药复方研究的核心．也是中药现代化的关 键．其研究的相对滞后已经成为中药现代化的瓶颈 问⋯。复方五仁醇胶囊 由五味子 、三七、柴胡 、叶下 珠 4味药组成 ，其中五味子为君药[21。我们拟以该制 剂为对象 ．对采用血清药理学与血清药化学相结合 研究中药复方药效物质基础进行方法学探讨 鉴于 药物组成成分的研究会给体 内有效成分的测定提 供参考 ，是研究复方的效应物质基础 的基石 『31。 因 此．本研究对复方五仁醇胶囊的主要成分进行了定 性定量分析 1 实验材料 1．1 仪器 Waters Alliance高效液相色谱系统 (美 国Waters公司)，配 2695分离单元、2996二极管阵 列检测器 ：Alhech 500型蒸发光散射检测器 (美 国 Alhech公 司)：Waters液相 色谱 一质谱 联用 仪 (Ultra performance LC，Quattra Premier质 谱 仪 ， 美 国 Waters公 司)：LIBROR AEL一40SM 电 子分 析 天 平 (日本 SHlMADZU公司 ，精度为 0．01mg)。 1．2 试剂 甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)， 乙腈(色谱纯，德国MERK公司)，纯净水(杭州娃哈 哈集团有限公司) 1．3 试药 五味子醇甲、五味子 乙素 、三七皂苷 R 、 人参皂苷 Rg 、人参皂苷 Rb 等对照品购自江西南昌 中药固体制剂制造技术国家工程研究 中心 ．五味子 醇乙购 自天津一方科技有限公司 ，五味子酯甲、五味 子甲素购 自中国药品生物制品检定所 ．复方五仁醇 胶囊由南通大学附属南通第三医院提供。 2 方法与结果 2．1 溶液 的制备 2．1．1 供试品溶液的制备 取复方五仁醇胶囊 内容 物 0．5g，精密称定，置 25mL量瓶中，加甲醇适量，超 声处理 30min，加 甲醇至刻度 ，即得 。 2．1．2 对照品溶液的制备 精密称取全部 8个对照 品 ，加 甲醇溶解 ，制成浓度 为 0．08～0．2mg／mL的混合 溶液 ，供 HPLC—DAD检测用 ：精密称取 5个木脂 素 类对照品 ．加 甲醇制成浓度为 0．02675～0．135mg／mL 的混合溶液 ，供木脂素类成分含量测定用 ，再加甲醇 制成浓度为 3-51*g／mL的混合溶液 ．供 UPLC～MS／MS 检测用；精密称取三七皂苷 R 、人参皂苷 R 、人参 皂苷 Rb ，加 甲醇制成浓度为 0．108～0．410mg／mL的 混合溶液 ，供皂苷类成分含量测定用。 2．2 主 要成 分 的 HPLC—DAD检 测 2．2．1 色谱条件 Liehrosphere Cl8(4．6mmx250mm， 5 m)色谱柱，水(A)一乙腈(B)梯度洗脱(0～20min， 15％～55％B：20～40min，55％ ～60％ B；40～50min，60％ ～ 基金项 目：江 苏省 中医药局 中医药科 学技术研 究专项课题 (H05173)，江 苏省 高校研究生科技创新项 目(140) 中压药 兰璺竺 竺 塑国 维普资讯 http://www.cqvip.com 治 法 方 药 70％ B；50-60min，70％-90％ B；60-70min，90％ -100％ B)，流速 1．0mIlmin，柱温 30％，190--400nm扫描检测。 2．2．2 检测方法与结果 以上分析条件下分别吸取 供试品溶液及对照品溶液各 101~L．注入液相色谱 仪 ，DAD检测 ，运行 70min，比较不 同波长色谱 图的 出峰情况 ．提取主要 吸收峰的光 谱 图．通过与对照品的保 留时间 (t )和光谱 图比较 ，同时根据相 关文献．对色谱峰进行成分鉴定 或推测 经 比较 ．波长 203nm时复方 五仁醇胶囊色谱图出峰较多．其 中峰面积大于总峰面积 o．1％的色 谱峰 27个．与对照品保留时间和 光谱图比较结果显示 3、4、5、7、 1O、17、22、25号峰对应的成分分 别为三七皂苷 R。、人参皂苷 Rg。、 人参皂苷 Rb．、五味子醇甲、五味 子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素 和五味子乙素。色谱图见图1。 前期研究结果明 ．上述 27 个峰中 3、4、5号峰均来 自三七 ， 五味子 、叶下珠对 1号峰均有贡 献．其余均来自五味子闱 本研究 采用的制剂原料五味子为北五味 子 Schisandra chinensis(Turcz．) Bail1．的果实 ．经比较 ，图 1中 6～ 27号峰的流出顺序与多篇文献 报道的北五味子图谱非常吻合． 其中 8号峰、24号峰可能分别为 戈米辛 J和戈米辛 N 嘲，27号峰 可能为五味子丙素[ 戈米辛 N 1 和五味子乙素是同分异构体[81． 24、25号峰的紫外光谱图显示完 全一样 (见 图 2)．也从一个方面 说明 24号峰可能是戈米辛 N 以上推断得到 UPLC—MS／MS检 测结果的验证 2-3 木 脂 素 类成 分 的 UPLC— MS／MS检 测 2．3．1 检 测条件 超 高效液相 色 谱 条 件 ：Acquity UPLC BEHC。 色 谱 柱 (2．1 x50mm， 1．71~m)；A (乙腈 )一B(H20，0．1％ 甲酸 )梯 度洗脱 (0～15min．5％～ 95％A)；流速 0．5mL／min；分流后 进入质谱 ：柱温 4O℃。质谱条件 ： 囝兰 中医；{5 lES ；毛细管电压 3．O kV；锥孔 电压 40V；离子源温度 120％；氮 气流量 400L／h；质量 扫描 范 围 m／z300～ 1200。 2．3．2 检测方法与结果 以上条件下分别 吸取对照 品溶液、供试品溶液各 2 L，注入 UPLC—MS／MS联用 m ’n a．三七皂苷 Rl；b．人参皂苷Rgl；c．人参皂苷 Rb1；d．五味子醇甲； e．~5-味子醇乙； 五味子酯 甲娼．五味子 甲素；h．五味子 乙素 图 1复方五仁 醇胶 囊(A)及对照品(B)HPLC—UV 色谱 图(X=203nm) 2∞ ∞ 瑚 ∞ “ 0∞ ∞ 瑚 加 蜘 l呷 瑚 00 枷 oo 帕 持0埘 2∞ 神 z ∞ 郴 ∞ 瑚 ∞ 2soD0 300舯 3∞ ∞ 0∞ 瑚 ∞ 弼0 o0 n iqlrt 图 2 图 1中 24号峰 、25号峰 紫外光谱 图 A 1 2 J 4 18 1 30 I 魄 一 、一 }I 5f 6 99 7 4 一 )L^ 从 0 00 2 50 5 00 7 50 图 3 复方五仁 醇胶 囊(A)及对 照品(B)总离子流 色谱 图 ’ ’ 图4 复方五仁醇胶 囊提取 离子流 色谱 图 维普资讯 http://www.cqvip.com 仪进行分析，运行 15min，记录总离子流色谱图，通过 提取离子流色谱图及相应保留时间离子峰的质谱图 比对分析，进行成分鉴定。总离子流色谱图见图3，提 取离子流色谱图见图4，分析结果见表 1。 表 1 UPLC—MS／MS检 测分析 结果 2．4 HPLC—UV测定木脂素类成分含量 2．4．1 色谱 条 件 水 (A)一乙腈 (B)梯 度洗 脱 (0～ 10rain，20％-60％B；10-30min，60％B；30~40min，60％ ～ 75％B：40～50min，75％～80％B)，检测波长 217nIY1． 供试品进样 101xL。其余色谱条件同2．2．1。 2．4．2 测定方法与结果 在上述色谱条件下吸取不 同体积对照品溶液进样测定，以峰面积(v)为纵坐标， 进样量(x)为横坐标建立 回归方程 5种成分的回归 方程分别为 ：五味子醇甲 v：6563395x一33046、五味子 醇 乙 y=6666177x一89522、五味子酯 甲 v=12585003x一 33451、五味子甲素 v=12540392x一26181、五味子 乙素 y=5961112x一39537：相关系数 r均为 0．9999：线性范 围分别为 0．1280～2．5601xg、0．1350～2．700~g、0．02675～ 0．5350~g、0．03075-0．6 1 50~g、0．0995-1．9930~g；平均 加样 回收 率 分 别 为 97．56％(RSD=1．35％)、96．75％ (尺SD=1．17％)、94．61％(RSD=2．65％)、95．72％(RSD= 1．51％)、96．38％(RSD=3．31)。 对 10批制剂进行了测定．外标法计算五味子醇 甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素及五味子乙 素的含量分别为 ：(6．60~3．31)mg／g、(3．22~1．53)IYl 、 (0．17~0．07)mg／g、(0．50~0．28)m 、(3．99~2．06)mg／g。 2．5 HPLC—ELSD 测定 皂苷类 成分含 量【91 2．5．1 色谱 条 件 水 (A)一乙腈 (B)梯 度 洗脱 (0～ 20rain，15％～55％B)。漂移管温度 120℃，载气流速 2．9L／min，供试品进样 101xL。其余色谱条件同2．2．1 2．5．2 测定方法 在上述色谱条件下吸取不同体积 皂苷对照品溶液进样测定，以峰面积 自然对数值(v) 为纵坐标 ，进样量 自然对数值 (x)为横坐标建立回归 方程 。3种皂苷成分的 回归方程分别为 ：三七皂苷 R1：v=1．5008x+13．0081，r=0．9994；人 参 皂 苷 Rg1：v= 1．5470x+13．2174，r=0．9985： 人 参 皂 苷 Rb1：Y= 1．5019x+13．3468，r=0．9999 3种成分 进样量 分别在 治 法 方 药 0．216-1．080~g、0．820-4．1OOp~g、0．816-4．080p~g范 围 内．其对数值与峰面积对数值呈 良好线性关系 ．平均 加 样 回收率 分 别 为 96．98％ (RSD：2．04％)、96．00％ (RSD=2．33％)、97．69％(RSD=2．23％) 对 8批制剂进行了测定．外标两点法计算三七 皂苷 R 、人参皂苷 及 Rb 的含量分别为：(2．67~ 0．49)m g、(6．62~1．38)mg／g、(5．33~0．73)m g。 3 讨论 定性检测表明 ．制剂中的成分大部 分来 自君药 五味子的木脂素类成分 ．主要原 因可能是五味子 以 提取后的浸膏入药．而且在处方中的比例也最大 HPLC与 UV或 DAD检测器相联接．对于单个 色谱峰仅能提供保留时间及紫外吸收等信号．而对 未知成分所能提供的结构信息相当有限 ．色谱峰的 指认必须有对照品．而大多数中药化学成分的对照 品很难获得 HPLC／MS技术则可以提供未知色谱峰 丰富的结构信息．据此推导其可能的化学结构．从而 可以很好地解决这一 问题。本研究采用 HPLC—UV 检测。用仅有的对照品只鉴定了其中5个成分．另外 3个成分只是根据文献进行了推测．而采用 UPLC— MS／MS．在上述推测的基础上．根据化合物的分子 量 ．采用提取离子流 图的方法 ．证实了制剂指纹图谱 中 8号峰、24号峰 、27号峰分别为戈米辛 J、戈米辛 N和五味子丙素的推测 4 参考文献 【1J 王 智民．中药 药效物质基础 的系统研究是 中药现代化 的 关键．中国中药杂志 ，2003，28(12)：1111 【2】 窦志华 ，施忠 ，李伟 红，等．X~．s_4a醇胶 囊的研制．时珍 国 医国药 ，2005，16(10)：953 【3】 马春涛 ，雷燕．中药复方效应物质基础 的研 究进展及展望． 中国实验方剂学杂志，2003，9(3)：46 窦志华 ，丁安伟 ，王 陆军，等、复方五仁醇胶 囊 HPLC指纹 图谱研究．山东中医药大学学报 ，2006．30(5)：384 f51 宋华湘．中药五味 子中木脂 紊类成分 的 HPLC～MS研究及 以 中草药生物活性 成分为基础的主成分聚类分析．湖南 师范大学硕 士学位论文．长 沙：湖南师范大学 ．2004 【6】 冯雪松 ，刘雅茹 ，孟繁浩 ，等．五味子 药材 HPLC指纹 图谱 的研 究．化学与生物 工程 ，2006，23(5)：60 f71 王彦 涵，高建平 ，陈道峰 ．高效液相 色谱法测定五味子属药 用植物木脂素的含量．中国 中药杂志 ，2003，28(12)：1155 『81 官艳 丽，曹沛，郁开北 ，等．北五味子化学成分的研 究．中草 药，2006，37(2)：185 『91 丁安伟 ，窭志华 ，罗琳 ，等．HPLC—ELSD测定 复方五仁 醇 胶 囊中三七皂 苷 Rl、人 参皂苷 Rgl及 Rbl的含量．南京 中 医药大学学报 ，2007，23(1)：40 第一作者：窦志华(1966一)，男，副主任中药师， 博士，主要从事中药复方药效物质基础研究．Y-作。 通讯作者 ：丁安伟。电子邮箱：awding105@163．com 收稿 日期 ：2007—07—10 编辑 ：乔 婧 吴 宁 ．fr医药 !!竺 兰坠 囫 维普资讯 http://www.cqvip.com