半定量RT—PCR

． 34． 科研鳔述 uVESTOCKAND PoULTRY lNoUsTRY No 228 半定量RT—PCR 在基因表达方面的应用 高海渡 张拴林 陈燕红 (山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801) 中图分类号：$813．1 文献标识码：A 文章编号：1008—0414(2008)02—0034-04 摘 要 RT—PcR是一种常用的具有很高灵敏度和特异性的基因表达检测方 法。它有定量RT—PCR和半定量RT—PCR法。半定量RT—PcR法因其对试验条件的要 求不高。费用低、普通实验室容易做到而被经常使用。本文从半定量RT—PCR的原 理、技术、操作步骤及注意事进行了综述 关键词 半定tRT=PCR 基因表达 应用 Application of Sem i-quantitative RT-PCR in Gene Expression GAO Hai—bo，ZHANG Shuan—lin，CHEN Yan—hong (College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu Shanxi 030801，China) Abstract：Reverse Transcription—Polymerase Chin Reaction (RT—PCR、is a highly sensitive and specific method useful for the detection of rare transcripts or for the analysis of samples available in limiting amounts．Hence，despite the eater accuracy of recently developed techniques，semi—quantitative methods are still widely used and appropriate for many puposes．Here we describe the principle，standard procedure and the necessary controls to ensure a quantitative analysis． Key words：semi-quantitative；RT—PCR；gene expressio RT—PCR是一种 常用的具 有很高 灵敏度 和 特异性 的 基 因表达 检 测方 法。RT—PCR fReverse Transcription— Polymerase Chain Reaction1是 以RNA 为模板，在反转录酶的作用下，由人工 合成引 物介导生 成cDNA 第一 链。以 此再 作 为 聚合 酶 链 反应 的模 板 。在 TaqDNA 聚合酶作用下 。扩增 产生大 量DNA片断。该方法理论上有一个单 拷 贝cDNA模板 即可完成扩增 ，因此它 比较 适 合 作基 因表 达 的定 量 研 究 。 RT—PCR方 法有定 量 RT—PCR和半定 量RT—PCR法 ，定量PCR法对实验仪 器 和样本处理的要求较高 ．而半定量 PCR法对试验条件的要求不高 ，它的 主 要 特 点 是 选 择 一 个 比 较 标 准 (contro1)，以消除试验误差 。样 本间用 于比较的值不是绝对值．而是相对值 ， 收稿 日期 ：20o8—01—18 作者简介：高海波，在读硕士研究生。主攻 方向：动物繁殖调控 因此 称半定量RT—PCR法 。本文 就半定量 RT—PCR的原理 、技术 、操作步骤 和注意事 进行综述。 1 提 取 组 织 总 RNA 1．1 组织材料的获取 一 般我们获取 的组织材料首先要经过 液氮速冻，然后一70℃冰箱保存。需要强调 的是 ，从取材 开始就要注意进行无RNA酶 操作。在我们获取多个组织材料时 ．不能将 组织材料 装入 自封袋或塑料袋再 放入液氮 中冷冻．否则自封袋容易破裂．使得组织掉 入液氮。我们的做法是：取组织之前先准备 好 干净 、消过毒 的铝 箔片 。做好标 记 ．取完 组织 ，立即包裹 ，放 入液 氮冷冻 ，然后一70℃ 冰箱保存。 1_2 组织总RNA的提取 总RNA的提取是 RT—PCR反应 中关键 的第一步．因为RNA提取质量的好坏直接 关系到后面cDNA的合成和PCR的扩增。因 此所提的总RNA要求纯度高、完整性好并 达到一定的浓度。由于mRNA半衰期短 ．又 容易被RNA酶降解 ，加一ERNA酶极 为 稳定且广泛存在 ．因而在提取过程 中 要严格 防止RNA酶的污染 ，并设法抑 制其活性 ．这是实验成败的关键。所有 的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手 指 、试 剂 、容器等均 可能 造成污染 ，因 此在全部实验操作过程中我们建议： 设 立一个 专 用RNA提取 的 超净 工作 台，操作人员一律戴口罩和帽子，使用 一 次性手套．且要经常更换．原则上是 手离开超净 工作 台就应换一 次手套 。 实验 所用 的玻 璃器 皿均 在0．1％的焦 碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中过夜处理． 再用蒸馏水冲净．高压灭菌1 h，于干燥 烘箱中烘干备用。凡是不能用高温处理 的塑料容器等用0．1％的焦碳酸二乙酯 (DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。 实验 所需 配 置 的试 剂 也要 用0．1％的 DEPC水处理。注意DEPC是剧毒 ．有致 癌作用，因而使用时需小心。 从组 织提取 总RNA的方法 很 多。 许多 公 司有现 成 的总 RNA提 取试 剂 盒 ．一般按照试剂盒说明书操 作 ．可快 速有效地提取到高质 量的总RNA。整 个 提取RNA的过 程都必须在低温下或 冰上进行。 1．3 总RNA纯度分析 按说明书提取组织总RNA．提取 的组织总RNA用30 L的DEPC水溶解 即得总RNA提取液 。对所提的总RNA 必须用紫外分光光度计或者使用核酸 测定仪测 定总RNA的纯度和 浓度 ．以 便在反转录的过程 中进行定量。用1％ 甲醛变性凝胶 电泳 ，EB染色 。紫外光 下 观察 RNA。如果 能够 清 楚 的看 见 28S、18S和5S 3条 带，而且28S条带的 宽度是18S的2倍 时。表明RNA的完整 性较好 。在测定 时RNA溶液浓度 时 ． RNA溶 液必须充分混匀 。其吸光度值 OD260／OD280的值在1．8～2．0之间时． 说明纯度比较高，可以继续往下做。 2 合 成 反 转 录CDNA第 一 链 由总RNA反转录成cDNA第一链 时 。所取的总RNA的量必须要一样 多． 而且应 在1 g以上 ，这样才 能保 证各 组 样本总RNA中所需 检测mRNA量的 差 异。因此在进行反转录之前必须对 所提取的总RNA浓度进行调整．使所 要 进 行反 转 录的RNA稀 释 到 同一 浓 维普资讯 http://www.cqvip.com 度 ，然后再进行反转 录。 从组织细胞提取的 ~,RNA用反转 录试剂盒可以得到cDNA第一链。许多 生物公司都有现成的反转录试剂盒。 这里强调一点 ，一个反转录试 剂盒可 以作很多次反转录 ．所以可以几个人 合起来买 。以节省试验经费 。 3 优 化 PCR反 应 体 系 利 用RT—PCR对 mRNA进 行半 定 量分析。最关键 的是优化试验条件 ．构 建最佳的PCR反应体系。下面就从 以 下几个方 面寻求构建PCR扩增 的最佳 反应体系 。 3．1 引物的设计和选择 PCR反应 的特异性是 由一对上下 游引物所决定的。引物 的好坏往往是 PCR反应成败的关键 。根 据 目的基因 的mRNA序列正确设计引物 ．除满足 引物设计的基本要求外 ，还应考虑 目 的基 因和 内标 引物 的预期退 火温度 ． 二者应尽量相符．引物序列进行比对． 二者应无同源性．而且目的基因与内 标基因的扩增 的条带应相隔～定的距 离(最少200 bp以上)，以便 于观测结 果及密度扫描。同时我们也可以借鉴 别人设计的引物 ，或者使用通用引物。 3-2 内标的选择 半 定 量RT—PCR检测 基 因mRNA 相对表达水平必须要用在各种条件下 表达水平稳定、表达量适中的看家基 因作 内对照。看家基 因(housekeeping gene)是维持细胞最低限度功能所不 可少的基因。这类基因在所有类型的 细胞中都进行表达 ．这些基因 的产物 对于维持细胞的基本结构和代谢功能 是必不可少的．而且在动物体内表达 稳定 ．外界环境变化 一般不会改变它 的表达水平 ，所 以叫看家基因 ，也有 的 叫持家基因或管家基因。 为了客观地 比较不 同样本 中目的 基 因表达量的多少．消除 由于反转录 时总RNA浓度差异造成的误差 ．要选 择合适的内标基因。其中最常用的 GAPDH，B—actin，18SrRNA。我们可以 根据实 际情况的不同 ．选择不 同的内 标基因作参照。 3．3 同管扩增或异管扩增的选择 同管扩增是 内标基因和目的基因 在同一个管内进行扩增。异管扩增是 将二者分开来扩 。 PCR扩增反应是酶促反应 ，遵循酶促 反应定律 。PCR扩增反应最初是 以线性递 增 ，即扩增产物呈指数累积 ，产物与模板呈 线性关系。半定量RT—PCR技术 正是 利用 产物与模板 的这一线性关系 ，通 过扩增产 物来对 比总RNA中目的基因的表达 。但是 随着酶活性下 降和溶液 中反应 物 的消耗 。 扩增反应会达到一个平台．进入平台期。在 平台期继续扩增 。低水平表 达的 目的RNA 可能会增加 ，并与高水平表 达的 目的RNA 浓度相近。因此选择合适的循环数不仅能 使扩增产物在琼脂糖凝 胶上清晰可 见和定 量 ，也可使扩增反应在 到达平 台期前 的线 性范 围内进行。 半定量RT—PCR的关键是要保证所有 样品的可比性 ．这就需要内标基因和目的 基因进行同管扩增 ．但是 ，由于 内标基因表 达水平太高，常常是目的基因还在线性期 。 内标基因已经达到平台期，这样在进行同 管扩增时 ，目的基 因就会 由于内标基因的 竞争而受到抑制．从而降低扩增效率。因此 有时采用异管扩增 。但是 ，在将 内标和 目的 基 因分别 扩增 时 ，由于样 品RNA及模 板 cDNA的量难以控制 。使半定量RT—PCR测 定值可信度降低。这样如何解决上面的问 就成了关键 。 首先对循环数按照一定梯度设计好 ． 然后对 目的基因和内标进分别进行同管和 异管扩增 。然后电泳扩增产物 ，电泳结果经 凝胶成像系统扫描分析各电泳条带的光密 度值 。以 目的基因和内标基因的光 密度值 之比作为 目的基因的相对表达量 ．对相对 表达量值取对数 ．以对数值作为纵坐标 ．循 环数作为横坐标 ．作出 曲线图。然后找 出二 者 的线性 区和平台区 ．最后确定最佳 的扩 增循环数 。 对相对表达量值取对 数值是为 了降低 光密度扫描系统本身的系统差异 。对所取 的对数值进行统计分析 ，算 出分管扩增 时 重复PCR扩增带来的批内差异 ，最终确定 误差范围 (2倍最大差 异)。当两样 品之间 的 差异小于2倍最大差异时 ，我们认为该差异 是由系统造成的。两样品之间差异不显著 ， 可以进行分管扩增。同时与同管扩增时的 差异进行 比较 ．若同管扩增 的差异超过误 差范 围 ，即大 于2倍 最大差异 ，就采 用异管 扩增 。 4 凝 胶 电 泳 及 凝 胶 成 像 和 定 量 分 析 根据 目的基因片段的大小配制适 宜浓度的凝胶，将PCR扩增产物与微量 溴酚蓝混合 ，在含有溴化乙啶的琼脂 糖凝 胶上进行 电泳 (溴化乙啶是一种 诱变剂，操作时必须带专用的手套)。 一 般跑电泳都用琼脂糖凝胶。边杉等 报道通过控制起始模板量．减少PCR 循环数使 目的基因的扩增处于PCR扩 增指数期 ，利用聚丙烯酰胺凝胶 电泳 和DNA银 染技术 ，通过 比较PCR扩增 产物量 的变化以分析 目的基 因表达水 平 的差异[41。鉴定PCR扩增产 物是否 与预期 的结 果 一致 ．一 般采 用标 准 Marker比 较 法 ，限 制 酶切 图 谱 法 ， Southern杂交和核苷酸测序法等 ，其 中最简单也最常用的是Marker比 较法 。选用Markerlt~．尽量选用含有与 扩增产物相对应 的条带的Marker。 电泳结束后，在凝胶电泳成像系 统下拍照 ．并 用其 自带 的分析软件对 电泳结果进行定量分析 。一般测定电 泳 条 带 的 IOD值 (intergrated optical density)．目的基因相对表达量为其电 泳条带 的IOD值 与内标基因 的电泳条 带的IOD值 的比值 ．然后对数据进行 统计分析 ，作出结论 。 5 问题 和 展 望 目前 已有许多改进 的检测方法和 技术 用于 定量分 析mRNA表达 量 ，但 在研究不同实验条件下特异基因表达 水平的差异时，半定量RT—PCR因其费 用低 、普通实验室容易做到而被经常 使 用。然而 ，在将 内标基 因和特异基分 别 扩增 时 ，由于样品RNA及 模板cDNA 的量 难以控制 ．使半定量RT—PCR测 定值可信度降低。尽管对试验研究而 言．结果必须有好 的重复性和精确性 ， 但多数研究的焦点并不是检测转录水 平微 小 的变化 或确切 的分 子数 目，而 是检测其表达水平变化 是否显著 。所 以半 定量RT—PCR法分 析mRNA水平 相对变化能够满足许多研究的要求。 如果将 内标和特异基因在 同一个管 中 扩增．只要反应参数选择得当，消除可 能 产 生 的引物 对 间的竞 争 ，半定 量 R —PCR完全可 以准确地反映基 因表 达 水平 的变化 。 在 基 因表达 的分 析 中 ，mRNA转 录 的稳态水平是检测组织的基因表达 维普资讯 http://www.cqvip.com ． 36． 繁殖技术 LlvEsTocK AND PoULFRYINDUSTRYNO．2：强 活性 的最方便的参数之一 。用于基 因 表达量测定的方法也越来越 多，应用 范围也越来越广泛。但 现有 的用 于比 较个体之间的mRNA表 达量的方法均 具有不可避免的缺点 ，因而限制 了其 进一步 的推广使用 ，而且并没有 哪一 种技术方法适 合于所有研 究的问题 。 最佳的策略是根据所要研究 问题 的特 点 ．选择不 同的方式或创造性 的将几 种方法结合使用 。总之，从取组织样 品 开始到最后结果的分析，每一步都要 严格操作 。从而确保RT—PCR半定量 检测基 因表达 水平 结果 的 准确 和可 靠 参考文献 [1]孟和，往桂花，王启贵，等．鸡PPAR基因 单核苷 酸 多态性 与腹 脂性状 相关 的研 究． 遗传学报 ，2002(2)：l19～123 f2】龙火生．瘦肉型与脂肪型猪0b基因表达 差异的研究．杨凌：西北农林科技大学．2003 [3]汪以真，林文学，许梓荣．半定量RT—PeR 法评定不 同生长阶段猪 抗茵肽Dr_39基 因 表达差异．农业生物技术学报，2004(1)：52～ 55 [4]边杉，王颖，于涛，等．聚丙烯酰胺凝胶银 染技术在半 定量RT—PCR 中的应 用．中国 药科大学学报，2004(2)：178～l82 f5】胥保 华，许梓 荣．肉雏鸡肝 细胞谷胱甘肽 过氧化 物酶mRNA表达 产物 的RT—PCR检 测．中国兽医科技．2003(2)：24～26 [6]汪以真，韩菲菲，黄海青．小白鼠乳铁蛋 白基 因片段 克隆及不同泌乳阶段 乳铁蛋 白 基因表达的差异．浙江大学学报．2004(1)： 83～88 [7]陈昕，王保莉，曲东，等．小麦硫转运蛋白 基 因半定量RT—PCR检测方法的建立．西 北 植物学报．2006(2)：309～3l3 【81李风娥，熊远著，雷明刚等．猪ESR mRNA 在 不 同组织表达的 定量研 究．华中农业 大 学学报．2004(5)：492～494 [9]单体中，汪以真，李 民．猪脂蛋白脂酶基 因片段的克隆及不同体重的表达差异．农 业生物技术学报，2006(2)：15l～155 [1O]顾志良，赵建国，李辉，等．鸡瘦蛋白受 体 (OBR)基因外显子9单核苷酸多态性 分 析．遗传．2002(3)：259～262 [1】]王颖，李辉，顾志良，等．鸡瘦蛋白受体 (OBR)基因内舍子8单核苷酸多态性与体 脂性状的相关研究．遗传学报 ．2004(3)： 265～269 [12]萨姆布鲁克J．拉赛尔 DW．著，黄培 雌性羊驼繁殖生理研究进展 刘一飞‘ 谢建山 董常 生 (山西农业大学动物科技 学院 ，山西 太谷 030801) 中图分类号：$815．4 文献标识码：A 文章编号：1008—0414(2008)02—0036—02 摘 要 与其屯事畜相比，雌性羊驼呈现的繁殖特性对于研究者来说相对较 陌生。本文旨在综述雌性羊驼生殖生理学上的研究进展，介绍其生殖系统的解剖学 特征．未交配和已交配雌性羊驼的繁殖特点等。 关键词 羊驼 雌性 繁殖 Progress on Reproductive physiology in fem ale alpacas LIU Yi—fei．XIE Jian-shan．DONG Chang-sheng (College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu shanxi 030801，China) Abstract：Female alpacas present striking reproductive peculiarities compared to other domestic livestock．these pe culiarities are relatively strange for researcher．The aim of this paper is to review the current state of knowledge in reproductive physiology in alpacas and describe the reproductive anatomical features and the reprod uctive characteristics in non—mated and mated females． Key words：Alpaca；Female；Reproductive physiology 关于美洲驼的繁殖研究主要集 中在两 个 驯化种 ，即羊 驼和驼羊 。了解 它们 的生殖 解剖特征和生殖生理特点对于提高饲养管 理 水平 和人工养殖技术是必不可少 的。为 此 ．本文对雌性羊驼 的基本繁殖模式进行 论述 。 1 雌 性 羊 驼 生 殖 器 官 解 剖 学 特 征 雌 性生殖 系统包括 卵巢 、输 卵管 、子 宫 、阴道 、阴道前庭和阴门。卵巢左右各一 ， 位 于骨盆腔 内子宫角尖端外侧稍后 ，由卵 巢 系膜悬 吊于腹腔第七腰椎下方⋯，距阴 门 15～20 cm。卵巢 由卵巢 固有韧 带缚 于子宫 阔韧带 上 ．外 形呈 卵 圆形 ．形 态 因 内部 卵 收稿 日期 ：20o8一Ol—l5 作者简介：刘一飞(1982一)，男。在读硕士，从事 羊驼生物学特性研 究 泡 发育 而有 变化 ．静 止期 羊 驼 卵巢 大小 约 1．6 cm×1．1 cmxO．5 cm，重 约 2．5 。当卵泡 发育后形成 突出于 卵 巢表 面的 隆起 ，使 卵巢 形态 发 生变 化。羊驼卵巢中有原始卵泡平均为 20 337个 ，直径2～16 mm，大小不等。 羊驼 子宫位于 骨盆腔 ，子 宫角抵 达骨 盆前缘 ，由子宫 阔韧带 附着于骨 盆 前部 的侧 壁上 。子宫 角 为双 角 子 宫 ．在两侧 子宫 角 的会 合处 有 一 隔 膜 ，最后 合并为子 宫体 。在 子宫角 的 尖端 由一乳头突。未经产 未怀孕羊驼 子宫 颈长2～3 cm，直径为0．5～l_5 cm。 子宫 颈沿矢状轴排 列有2～4个 环形纵 向皱褶 ，发情 时开 口较 大 ，妊娠 时紧 闭⋯。输 卵管较 长 ，达 15～20 cm，精子 在 羊驼 的输 卵管 可存 活 长达96 h．所 以羊驼的妊娠率很高【]1。 堂等译，分子克隆实验指南(第3版)．北京：科学 出版 社 ．20o3 [13]吴江雏，孙超，杨公社．SQ RT—PcR检测不同 品种猪脂肪组 ~SOCS一3基 因表达．畜牧兽 医学 报，2006(3)：222~226 [14]Ferre F．Quantitative or semi—quantitative PCRPreality versus myth ．PeR Methods App1．， 1992(1)：l～9 [15] Mathiasc， Martine，Annevc． A semi— quantitative RT —PCR method to readily compare expression levels with in Botrytis cinerea muhigenic families in vitro and in planta．Curr．Genet．2003(1)：303~309 [16]Roll and V G．Semi-quantitative analysis of gene expression in cultured chondrocytes by RT—PCR ．Method s Mo1． Med．2004(1)：69~78 [17]Kuddu S R H，Lee Y H，Valdivial A．A 维普资讯 http://www.cqvip.com 阴道是分娩产道和交配器官。阴唇 不明显，交配时不会遮住阴门。腹侧 阴 唇上有阴蒂．有时见白色糊状分泌物。 2 雌 性 羊 驼 的 繁 殖 模 式 羊驼是诱发排卵动物 。因此 ，达 到 性成熟后 ，呈现 出3种状态 ：(1)未交配 未怀孕 ；(2)交配但未怀孕 ；(3)妊娠 。 2．1 未交配未怀孕羊驼 的繁殖模式 2．1．1卵泡波 型特点 ：性成 熟的羊驼 卵泡发育开始以卵泡波模式进行。超 声 波 检 查 显 示 羊 驼 卵 泡 生 长 率 是 0．43 mm／d．卵泡生长分为4个阶段 ：小 卵泡期 (4～5 mm)，生长期 (6～7 mm)； 成熟期(7～12 mm)；退化期 (10～7 mm)。 当卵泡发育到6 mm以上变为主导卵 泡。抑制其它卵泡的发育。当卵泡发育 到7 mm以上时，交配可诱导排卵，7 mm是 羊驼排卵的最低极 限同。在羊驼卵泡波 特性超声研究中．同过观察不交配 ．未 怀孕 ．非哺乳母 驼的连续 卵泡 波得 出， 卵泡波波间间隔为l2～16 d．每个卵泡 波最大卵泡直径是(8．8zO．3)mm。波间 间 隔的长短与最大卵 泡的直径 有关 。 活跃的优势 卵泡可以调节两侧卵巢上 卵泡的数量和直径。卵泡大小与血浆 l78一雌二醇浓度 呈正相关 ，在 卵泡开 始 生长8 d后达到最大【5J。 2．1．2 性行为 ：雌 性羊驼接受交 配与 否 与卵泡发育程度无关 ，不接受交配 也并不意味缺少成熟卵泡。而且 接受 交配与雌二醇浓度无关只与低浓度水 平的孕酮相关 。羊驼不是季节性发情 动物 ，有较长 的性接受期 ，在澳大利 亚．羊驼全年都可交配但在夏季有更 高的妊娠率 。 2．2 交配但 未怀孕羊驼的繁殖模式 2．2．1交 配行为 ：羊驼的交配行 为分 为求爱和交配2个阶段。求爱开始于雄 性羊驼追逐雌性．这一过程持续数秒 到 10 min．其长短取决于雄性羊驼 的 性欲和体力 。在交配阶段 ，雄性羊驼的 semi——quantitative PCR technique for detect·- ing chimerism in hamster—to—rat bone mar— rowxeno transplantation．J．Immuno1．Methods． 2004(1)：245~251 【18】Sarict，Shain S A．Semi-quantitative砌r_ PCR enhan cement of assay accuracy an d rep roducibility．Biotechniques．1997 (1)：630～ 634．636 阴茎穿人子宫颈在两个子宫角射精．交配 时间持续2o一25 min。据报道。l d中第一次 交配的时间(22．7~1．1 min)明显长于第二次 交配(14．8：1：1．6 min)[~q。此外 ．在秋季交配时 间要长于春季 。 2．2．2排 卵：羊驼属交配诱导排卵 。交配过 程中．阴茎可以通过子宫颈达子宫体，交 配刺激引起雌性羊驼脑垂体释放激素，通 过血液运输到卵巢 ，并引起卵巢卵泡的发 育和排卵。一般一个卵巢表面仅有一个卵 泡达到成熟，卵泡从发育到成熟约需12 d。 如果这个时候发生交配 ，可诱导排 卵 ；如 果没有交配 ，这个 卵泡就会退化。然 而，同 时另一个卵泡通常会成 熟(同侧或对侧 卵 巢)．这样形 成了卵泡发育 和退化 的重 叠 波 ．出现较长的性接受期。随着卵泡波的 开始，可能有持续l～2 d间隔的性不接受 期 。交配后约30-40 h出现排卵。排卵后形 成一个黄体，分泌孕酮。只要黄体起作用， 孕酮就会抑制性接受 能力 。如果羊驼没有 受 孕 ．黄 体l0～13 d后衰退 ．下一个 卵泡开 始发育成熟。如果羊驼受孕并开始妊娠， 黄体不会退化，而在整个妊娠期持续产生 孕激素。羊驼是单胎动物．通常是单个排 卵 ．即仅有一个卵泡破裂。 自然交配中出现多数排卵的几率仅有 10％．双胞胎是极其少见的。羊驼偶尔会发 生 自发排卵 。自发性排卵是指在没有性刺激 的情况下．卵泡 自发性的破裂排出卵母细胞 并生成黄体。经腹腔镜检查，未交配的羊驼大 于6 mm的卵泡中有3．5％发生 自发 排卵网。 2．2．3黄体期的性行为：成熟卵泡排卵后 形成黄体，在短时间内．由卵泡期分泌雌激 素 的颗粒细胞 ，转变 为分 泌孕酮 的黄体细 胞。黄体分妊娠黄体和周期黄体，雌性动 物如果没有妊娠．所形成的黄体在黄体期 退化 ，开始下一 次的卵泡发育与 排卵 ，这 种黄体 称 为周期 黄体 ：如 果妊娠 ，则 转 化 为妊娠黄体．此时黄体的体积稍大嘲。黄体 与雌性 羊驼在 黄体 期 的性行 为有密 切关 系。当雄性羊驼向雌性求爱时，雌性羊驼 会远离 ，踢踏雄性并 向其喷 唾液 。最初 的 喷唾液(拒绝雄性接近)是一个 由与排卵 作用相关的孕酮水平的增加启动的反应 ， 而不是怀孕的确认。然而，拒绝雄性爬跨 可能是受孕或妊娠的信号。 3 妊 娠 羊驼受精后 ，受精卵开始分裂并向子 宫方向移动。在交配后6~8 d胚胎进人子宫， 此时胚泡正在孵化或已完成孵化 。胎儿 向母体付出妊娠信号的具体时间还不 清楚 ，但必须在交配后10 d内发出 ，使 黄体转变 为妊娠黄体。98％胚 泡在左 侧子宫角附植而妊娠。附植始于左侧 子宫角，向右侧子宫角延伸。在第九天 到第十天胚泡开始延伸。第十二天胚 泡与子宫内膜建立紧密接触。羊驼附 植开始于排卵后 14 d。胚胎和母体之 间通过激素为媒介和其他生理因素而 被固定下来 ，从而使妊娠正式开始 。妊 娠建立后 能抑制前 列腺素 的释放 ．前 列腺素起溶解黄体的作用，通过抑制 前列腺素释放可以将黄体保存下来 ． 由周期 黄体转变 为人妊娠 黄体 ．维持 妊娠 。羊 驼胎 盘是 上 皮绒 毛 膜型 胎 盘 ，即弥散 型胎 盘 ，这 类 胎盘 的绒 毛 膜整个表 面或多或少 地覆盖 着绒毛 ． 绒毛伸人 到子 宫 内膜腺 窝 内．构成 一 个胎盘单位．母体与胎儿在此发生物 质交换 。 4 小 结 羊 驼属单胎 动物 ，妊娠期 长 。羊 驼受精率很高 ．但胚胎死亡率也很 高 ，仅 在妊娠30 d以 内就有约40％胚 胎死亡。目前普遍认为，低繁殖率与 母畜繁殖特性及体况不 良．缺少饲 草，恶劣气候等因素有关。50％胚胎死 亡发生于妊娠早期或胚泡附植前。流 产发生于胚胎持续期。 主 要 参考 文 献 [1]Hoffman E．Female Reproduction：The complete Alpaca book．2nd Edition—Revised． San ta Cruz，California：Bonny Doon Press， 2006 【2]贺俊平，董常生，范瑞文．雌性羊驼生殖 器官解剖构造与繁殖生理特征．动物医学 进展．2002(1)：23~25 f3]3 Bravo PW~Skidmore JAZhao XX Repro— 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