狂犬病病毒抗原定量检测方法的建立

中国生物制品学杂志 2008年 11月第 21卷第 11期 Chin J Biologicals November 2008，Vol. 21 No. 11 中国图分类号 R373. 9 R392-33 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（2008）11-1009-04 【实验技术】 狂犬病病毒抗原定量检测方法的建立 张国强 王远征 王晋 施彤 冯素英 【 摘要 】 目的 建立狂犬病病毒抗原的定量检测方法，用于疫苗生产过程中病毒含量的监测。方法 用狂犬病病毒 aG 株免疫豚鼠，制备抗狂犬病病毒多克隆抗体，纯化后以辣根过氧化物酶进行标记。采用双抗体夹心 ELISA法建立检测系统。以狂 犬病疫苗国家参考品为定量，建立剂量反应曲线，确定该方法的灵敏度，并对该方法的精密性、特异性和适用性进行验证。 结果 制备的多克隆抗体高峰效价为 1 ∶ 105，纯化后的抗血清蛋白含量为 6. 45 mg ／ ml。建立的 ELISA方法对狂犬病病毒抗原 的最低检出量为 5. 3 mIU ／ ml，最佳定量区间为 10 ～ 110 mIU ／ ml，相关系数为 0. 998 3，精密性和特异性较好。用该方法对狂犬 病疫苗进行抗原定量，与 NIH法测定的疫苗效力具有一定的相关性；检测市售的不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗，其结果 在 2. 4 ～ 9. 9 IU ／ ml之间。结论 已建立了狂犬病病毒抗原的定量检测方法，可对来自不同毒株和不同细胞系的狂犬病疫苗进 行快速定量检测，为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。 【关键词】 狂犬病病毒；抗原；定量检测；ELISA；NIH法 Development of A Quantitative Assay for Rabies Virus Antigen ZHANG Guo-qiang, WANG Yuan-zheng, WANG Jin, et al （Beijing Tiantan Biological Products Co. Ltd, Beijing 100024, China） 【Abstract】 Objective To develop a quantitative assay for rabies virus antigen, which can be used for monitoring of virus con－ tent during vaccine production. Methods Polyclonal antibody was prepared by immunizing guinea pigs with rabies virus strain aG, then purified and labeled with horseradish peroxidase（HRP） to develop a double antibody sandwich ELISA. A dose-response curve was plotted by using national reference for rabies vaccine as a quantitative standard. The sensitivity, precision, specificity and feasi－ bility of the developed ELISA were evaluated. Results The prepared polyclonal antibody reached a maximum titer of 1 ∶ 105, and an antiserum protein content of 6. 45 mg ／ ml after purification. The developed ELISA showed good precision and specificity, and its minimum detection limit, optimal quantitative range and correlation coefficient were 5. 3 mIU ／ ml, 10 ～ 110 mIU ／ ml and 0. 998 3 respectively. The virus antigen content in rabies vaccine determined by the developed ELISA showed a certain correlation to the vac－ cine potency determined by NIH method. The determination results of rabies vaccine prepared with various strains and cell lines by the developed ELISA were 2. 4 ～ 9. 9 IU ／ ml. Conclusion A quantitative assay for rabies virus antigen is developed, which may be used for the rapid quantitative determination of rabies vaccine prepared with various strains and cell lines and provides a simple mon－ itoring method for quality control during vaccine production. 【Key words】 Rabies virus; Antigen; Quantitative assay; ELISA; NIH method 狂犬病病毒（Rabies virus，RV）抗原含量是狂犬 病疫苗的主要质量指标之一，与疫苗的实际效力密 切相关。目前，用于狂犬病疫苗效力的经典方法 是美国国立卫生研究院的方法，简称 NIH法［1］。该 方法检测周期长，操作复杂，不适用于疫苗制备过程 中对病毒抗原的即时监测。近年来，国内外已开展了 一系列的体外实验研究，寻求简便可靠的替代方法。 2003年，WHO关于人用狂犬病疫苗效力要求中指 出，体外试验有望代替 NIH试验［2］。本研究以抗狂 犬病病毒多克隆抗体建立 ELISA方法，用于狂犬病 疫苗中抗原的定量检测。 1. 材料与方法 1. 1 实验动物 清洁级豚鼠（雌性，体重 180 ～ 220 g）和 SPF级 NIH小鼠（雌性，体重 11 ～ 12 g），均由北京天坛生物 制品股份有限公司实验动物中心提供。 1. 2 毒种 狂犬病病毒 aG株毒种由北京天坛生物制品股 份有限公司疫苗四室提供。 1. 3 试剂 狂犬病疫苗国家参考品（6. 7 IU ／ ml），由中国药 品生物制品检定所提供；RV抗体检测试剂盒，由兰 州生物制品研究所提供；辣根过氧化物酶，RZ≥ 3. 0， 购自美国 Sigma公司。 1. 4 狂犬病病毒 aG株的传代增殖 将毒种从低温冻存状态下（-70℃）取出，迅速融 作者单位：北京天坛生物制品股份有限公司（北京 100024）. 通讯作者：张国强，E-mail: zhanggq53052@163.com； 王远征，E-mail: aohan0328@yahoo.com.cn 1009· · 中国生物制品学杂志 2008年 11月第 21卷第 11期 Chin J Biologicals November 2008，Vol. 21 No. 11 化，接种于豚鼠脑内，每只注射 0. 1 ml。当豚鼠出现 典型发病症状后，在无菌环境下处死，取出脑组织， 研磨成 10%的脑组织悬液。经 4℃，8 000 × g 离心 30 min，取上清置低温保存。采取相同方法，将 aG株 毒种在豚鼠脑内连续传代 3次，收获最终上清液为 病毒抗原，用于动物免疫。 1. 5 抗狂犬病病毒多克隆抗体的制备 将经豚鼠脑组织传代增殖的狂犬病抗原（蛋白 含量 3. 8 mg ／ ml）与弗氏不完全佐剂混合制成佐剂 抗原。采用背部皮下多点注射法，免疫豚鼠，每只注 射 0. 2 ml。3周后按同剂量同途径进行加强免疫，此 后每两周免疫 1次。末次免疫后两周采血，分离血 清，用间接 ELISA及免疫双扩散法检测抗体效价。 用辛酸-硫酸铵盐析法纯化抗血清，Lowry法检测蛋 白含量。 1. 6 酶标抗体的制备 采用改良过碘酸钠法，将纯化抗体用辣根过氧 化物酶进行标记，加等量甘油后置-20℃保存。 1. 7 双抗体夹心 ELISA法的建立 将纯化的 RV抗体系列稀释，包被酶标板，对抗 体浓度、包被时间、温度、封闭条件等进行优化，筛选 最佳包被条件；采用方阵滴定法选择最佳酶标抗体 的工作浓度。再与其他辅助试剂配合，建立双抗体夹 心 ELISA法检测系统。 1. 8 抗原定量标准曲线的建立及灵敏度的确定 将狂犬病疫苗国家参考品作 1 ∶ 20 ～ 1 ∶ 2 560 倍系列稀释，与各稀释度相对应的标示含量为 335 ～ 5. 3 mIU ／ ml。建立剂量反应曲线，用直线回归法选 择最佳线性范围，作为 ELISA 定量检测的标准曲 线，并确定最低检出限，即为灵敏度。 1. 9 方法的精密性检测 将狂犬病疫苗国家参考品进行系列稀释，各稀 释度相应的抗原含量分别为 111. 7、83. 4、41. 8和 20. 9 mIU ／ ml。根据 ELISA确立的实验条件，在不同 时间重复测定 20次，对结果进行统计学分析，同时 对同一份狂犬病疫苗样品进行连续 6次检测，验证 方法的精密性。 1. 10 方法的特异性检测 用所建立的双抗体夹心 ELISA方法，以狂犬病 疫苗国家参考品作为阳性参比，对实验研究中用的 狂犬病病毒感染的豚鼠脑组织悬液、纯化的狂犬病 病毒抗原及市售精制 Vero细胞狂犬病疫苗等，作系 列稀释进行检测。同时对本公司生产的乙脑疫苗、麻 风腮三联疫苗、天花疫苗、流感疫苗、Vero细胞培养 液、人血清白蛋白、牛血清白蛋白及正常豚鼠脑组织 等非狂犬病病毒抗原样品，作原倍检测，考核该方法 的特异性。 1. 11 方法的适用性检测 1. 11. 1 与 NIH效力试验的比较：将实验研究中 5 批 Vero细胞培养的狂犬病病毒收获液，经灭活、浓 缩、纯化后，用 NIH法进行效力测定。同时用建立的 ELISA法测定抗原含量，以狂犬病疫苗国家参考品 建立的剂量反应曲线为定量标准，观察两种方法测 定结果的相关性。 1. 11. 2 对不同狂犬病疫苗的检测：自市场上购得 7 个厂家生产的狂犬病疫苗，其中包括用 Vero细胞生 产的 PV 株和 CTN 株疫苗、地鼠肾细胞生产的 aG 株疫苗、人二倍体细胞生产的 aG株疫苗。攻毒用标 准 CVS株病毒由本公司质量保证部提供。将狂犬病 疫苗国家参考品和待检疫苗作相同的系列稀释，用 所建立的 ELISA 法同时对各稀释浓度的参考品和 待检样品进行检测，考察该方法检测不同毒株及不 同细胞系来源的狂犬病疫苗的通用性。 2. 结果 2. 1 豚鼠抗狂犬病病毒多克隆抗体的获得 经豚鼠脑内增殖的狂犬病病毒提取液免疫豚 鼠，在免疫过程中随时淘汰发病动物，最终存活的豚 鼠共计免疫 6次。经间接 ELISA检测发现，初次免 疫后 8周（5针后），豚鼠血清中 RV抗体水平已达高 峰，再次加强免疫，抗体仍维持原有水平。测得高峰 效价为 1 ∶ 105；免疫双扩散效价为 1 ∶ 16。纯化后的 抗血清蛋白含量为 6. 45 mg ／ ml。 2. 2 双抗体夹心 ELISA法的最佳条件及试验步骤 的确定 通过条件优化确定抗体包被浓度为 16 μg ／ ml， 酶标抗体的工作浓度为 1 ∶ 500。试验采用二步法： 待检样品加样后于 37℃孵育 60 min；洗涤后加入酶 标抗体，37℃孵育 20 min；洗涤后加底物液，37℃避 光显色 10 min；加终止液后，于 450 nm波长测定各 孔 A值。根据定量标准曲线，用线性回归方程计算 样品中狂犬病病毒抗原的含量。 2. 3 标准曲线和灵敏度 抗原定量标准曲线见图 1。最佳线性范围为 10～ 110 mIU ／ml。以阴性对照 A450的 2. 1倍为 Cutoff值， 计算出该方法的最低检出限为 5. 3 mIU ／ ml。 2. 4 方法的精密性 对 20次剂量反应曲线测定结果进行统计学分 析，结果显示，相关系数 r = 0. 991 3 ± 0. 005（95%可 信区间，n = 20，S = 0. 135，Sx = 0. 030）。对同一份疫 1010· · 中国生物制品学杂志 2008年 11月第 21卷第 11期 Chin J Biologicals November 2008，Vol. 21 No. 11 苗连续检测 6次，其抗原含量为 7. 00 ± 0. 92 IU ／ ml， 变异系数 CV = 10. 5%，明该方法精密性良好。 图 1 狂犬病疫苗国家参考品的剂量反应曲线 Fig 1. Dose-response curve of national reference for rabies vaccine 2. 5 方法的特异性 用所建立的 ELISA 法检测狂犬病疫苗国家参 考品、狂犬病病毒感染的豚鼠脑组织悬液、纯化的狂 犬病病毒抗原及精制 Vero细胞狂犬病疫苗，结果均 为强阳性，且随着样品稀释倍数的增加，检测值呈递 减趋势。而对乙脑疫苗、麻风腮三联疫苗、天花疫苗、 流感疫苗、Vero细胞培养液、人血清白蛋白、牛血清 白蛋白进行检测，结果均呈阴性，见表 1。表明该方 法特异性强，非狂犬病病毒成分对检测无干扰。正常 豚鼠脑组织在原倍浓度时出现弱阳性反应，经稀释 后可排除非特异现象。目前广泛使用的狂犬病疫苗 中不含有豚鼠脑细胞成分，在检测时不会受到任何 影响。 表 1 ELISA的特异性检测 Tab 1. Specificity of ELISA A450 of samples at various dilutions Samples Original 1 ∶ 20 1 ∶ 40 Rabies vaccine（Ref.） 2. 742 2. 270 1. 812 Rabies vaccine（Vero） 2. 401 1. 068 0. 576 JE vaccine（Vero） 0. 082 0. 053 0. 062 MMR vaccine 0. 124 0. 081 0. 062 Smallpox vaccine 0. 057 0. 059 0. 057 Influenza vaccine 0. 068 0. 058 0. 064 Vero cell tissue 0. 092 0. 084 0. 068 HSA 0. 092 0. 073 0. 080 BSA 0. 062 0. 070 0. 064 Brain tissue of guinea-pig 0. 356 0. 082 0. 050 2. 6 方法的适用性 2. 6. 1 与 NIH效力试验的比较：5批狂犬病病毒收 获液经灭活纯化后，经 NIH法测定其效价在 0. 9 ～ 1. 6 IU ／ ml之间；用建立的 ELISA法对每批样品进 行 3次测定，其平均值在 0. 8 ～ 1. 4 IU ／ ml之间。两种 方法测定结果之间差异无统计学意义（t = 2. 714，P = 0. 053 3 > 0. 05），见图 2。 图 2 ELISA与 NIH方法的比较 Fig 2. Potency of rabies virus measured by NIH and ELISA 2. 6. 2 对不同狂犬病疫苗的检测：以国家参考品的 剂量反应曲线为定量标准，用直线回归法计算出待 检疫苗的体外相对效力。检测结果可见，不同毒株和 细胞系生产的狂犬病疫苗检测值在 2. 4 ～ 9. 9 IU ／ ml 之间，攻毒用标准 CVS株病毒在检测中表现出极高 的抗原性，超出参考品的定量范围，而且不能以效力 单位进行计算。见表 2。因此，将 CVS株病毒稀释为 10 -2～ 10 -6进行测定，结果样品稀释至 2 × 10-4，病毒 含量为 200 LD50时，A450 = 0. 328，与 Cutoff 值（A450 = 0. 239）比较仍为阳性反应。 表 2 ELISA测定不同狂犬病疫苗的体外相对效力 Tab 2. In-vitro potency of rabies vaccine tested by ELISA A450 Potency 1 ∶20 1 ∶40 1 ∶80 1 ∶160 1 ∶320 1 ∶640 （IU ／ ml） Vaccine 2. 042 1. 890 1. 246 0. 855 0. 510 0. 320 6. 7 （Ref.） PV 2. 315 1. 906 1. 192 0. 799 0. 475 0. 289 6. 5 （Vero） CTN 0. 925 0. 612 0. 359 0. 221 0. 148 0. 111 2. 6 （Vero） aG 2. 434 2. 172 1. 269 0. 891 0. 541 0. 341 9. 4 （Vero） aG 1. 293 0. 751 0. 463 0. 252 0. 177 0. 128 4. 7 （HK） aG 0. 846 0. 464 0. 304 0. 128 0. 129 0. 056 2. 4 （2BS） aG 2. 586 2. 421 2. 103 1. 580 1. 030 0. 690 9. 9 （Vero） aG 1. 482 1. 012 0. 613 0. 381 0. 221 0. 112 3. 2 （HK） CVS Over Over Over Over Over 2.045 NA 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 0 20 40 60 80 100 120 A 4 50 Rabies vaccine reference content（mIU ／ ml） y = 0. 012 3x + 0. 185 3 R = 0. 998 3 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 1 2 3 4 5 ELISA（n = 3） NIH（n = 1） RV sample Po te nc y（ IU ／m l） Samples 1011· · 中国生物制品学杂志 2008年 11月第 21卷第 11期 Chin J Biologicals November 2008，Vol. 21 No. 11 3. 讨论 在狂犬病病毒属的 4 种血清型中，Ⅰ型为 CVS 原型株，包括 aG株、CTN株等。目前，广泛使用的狂 犬病病毒疫苗株及固定毒株均属Ⅰ型。对所 属Ⅰ型的病毒株进行序列分析发现，毒株间的编码 糖蛋白基因序列在同一血清型中同源性为 94%［3］。 因此，考虑到方法的通用性，实验中选择狂犬病病毒 aG株作为免疫原建立检测系统。用 aG株免疫得到 的抗血清，可与所有Ⅰ型病毒株发生特异反应。另一 方面，采用来自豚鼠脑内增殖的狂犬病病毒，经离心 过滤除去细胞组织成分，不做进一步的精制纯化，可 有效保持病毒颗粒表面结构蛋白的完整性，用此病 毒免疫动物，可获得抗狂犬病病毒所有结构蛋白的 特异性抗体，使抗体在免疫反应中大大提高了结合 病毒的能力。本研究中的适用性验证结果表明，用此 抗体建立的 ELISA 法可对国内目前使用的狂犬病 疫苗进行定性和定量检测。 双抗体夹心 ELISA 法的灵敏度和特异性取决 于抗体的效价和纯度，本实验采用完整病毒免疫，使 动物接近自然感染。免疫过程中存活下来的豚鼠，体 内产生的抗体水平远远高于用精制疫苗免疫得到的 抗体。有研究表明，用鸡胚和神经组织制备的疫苗免 疫后，中和抗体效价一般不超过 1 ∶ 103，细胞培养疫 苗一般可达数千，而经病毒感染的病人血清，其中和 抗体效价可达 1 ∶ 104以上［4］。在特异性方面，用来自 同种动物细胞增殖的病毒再次免疫同种动物，可有 效地减少非特异性抗体的产生，提高了抗血清的纯 度，简化了抗体纯化工艺。 对建立的 ELISA法进行特异性验证时，正常豚 鼠脑组织悬液呈弱阳性反应。因为免疫豚鼠的病毒 来自于豚鼠脑组织，虽属同体蛋白成分，但由于血脑 屏障的作用，豚鼠脑组织成分与自身的免疫系统是 相对隔绝的，使得脑组织成分对周身的免疫系统产 生较弱的抗原性，当其成分进入机体后，会引起低水 平的免疫反应，所得抗体与豚鼠脑组织提取液会产 生微量的交叉反应。但目前广泛使用的狂犬病疫苗 大多采用 Vero细胞、地鼠肾细胞和人二倍体细胞培 养。实验结果表明，应用该方法检测不同细胞系生产 的狂犬病疫苗，其结果不受干扰。 狂犬病疫苗生产中各工艺阶段必须进行病毒的 检测，其方法和意义有所不同。毒力试验是测定病毒 感染动物和细胞的能力，效力试验是检验疫苗的保 护水平，是疫苗检定中的关键指标。两方法的检测实 质，均与病毒的表面结构和病毒含量密切相关。本研 究中以多克隆抗体建立的 ELISA 法经适用性验证 表明，与经典的 NIH法具有一定的相关性；在检测 不同毒株和细胞系制备的疫苗中，表现出良好的通 用性。有资料表明，由于狂犬病病毒不同毒株之间的 糖蛋白结构存在差异［5］，因此，如用 ELISA法检测 狂犬病病毒抗原，建议采用多克隆抗体或多株单抗 混合制备试剂，避免单抗结合位点的单一造成对抗 原的漏检。 《中国药典》三部（2005版）中明确指出，NIH法 是经免疫小鼠后，产生相应抗体，通过小鼠抗体水平 的变化测定狂犬病疫苗的免疫原性，是狂犬病疫苗 效力测定的金标准。而应用 ELISA等体外方法检测 人用狂犬病纯化疫苗的抗原含量，能否替代 NIH法 用于纯化狂犬病疫苗效力测定，尚待进一步的研究 加以证实。目前的研究结果表明［6～9］，用 ELISA法确 立一种测定狂犬病病毒含量的内部指标，保证狂犬 病疫苗批间的一致性是切实可行的。 参考文献 ［1］WHO expert consultation on rabies: first report. 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