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临床医学论文-胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较

2018-04-13 9页 doc 101KB 26阅读

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临床医学论文-胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较临床医学论文-胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较 胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的 比较 【摘要】 目的 探讨人胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的分离培养和生 物学特性,为间充质干细胞(MSC)的选择和应用提供依据。方法 采用酶消化法 分离人胎盘组织,60g/L羟乙基淀粉和密度梯度离心两步法分离脐血单个核细 胞,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别进行贴壁培养,观察不同来源 MSC的生长、增殖和表面标志的表达并做比较。结果 胎盘来源的贴壁细胞为一 种混合性细胞,脐血单个核细胞体外培养可以获得形态不...
临床医学论文-胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较
临床医学-胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较 胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的 比较 【摘要】 目的 探讨人胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的分离培养和生 物学特性,为间充质干细胞(MSC)的选择和应用提供依据。方法 采用酶消化法 分离人胎盘组织,60g/L羟乙基淀粉和密度梯度离心两步法分离脐血单个核细 胞,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别进行贴壁培养,观察不同来源 MSC的生长、增殖和表面标志的表达并做比较。结果 胎盘来源的贴壁细胞为一 种混合性细胞,脐血单个核细胞体外培养可以获得形态不均一的贴壁细胞,二 者在生长规律和形态学特征上与骨髓基质相比有一定差异性,CD106、CD44在 三种细胞均有表达。结论 胎盘和脐血来源的贴壁细胞具备间充质干细胞的基本 特征。 【关键词】 胎盘;脐血;间充质干细胞 Comparison of the adherent cells derived from human placenta,umbilical cord blood and bone marrow ABSTRACT: Objective To compare the adherent cells derived from human placenta, umbilical cord blood and bone marrow, and provide laboratory data for clinical application of mesenchymal stem cells. Methods Adherent cells were isolated from human placenta tissues by enzyme digestion, and mononuclear cells (MNC) were isolated from umbilical cord blood (UCB) by 60g/L HES and density gradient centrifugation and MNC were isolated from bone marrow (BM) by density gradient centrifugation, and then these cells were cultured in vitro. Their biological characteristics were studied and compared. Results The adherent cells cultured from human placenta and umbilical cord blood had disparate shape in vitro respectively. And they had some differences in growth and shape from those derived from bone marrow. The adherent cells derived from the three tissues all expressed CD106 and CD44 in immunohistochemistry staining. Conclusion The adherent cells derived from human placenta and umbilical cord blood have the basic features of mesenchymal stem cells. KEY WORDS: placenta; umbilical cord blood; mesenchymal stem cell 间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是成体干细胞之一,不仅支 持造血系统,还具有多向分化潜能,在一定的实验条件下可分化为成骨细胞、 软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞等。因此,在细胞微环境和组织等方面具有广泛的应用前景。近年来,已有具有干/祖细胞特征的间充质细胞自骨髓、外周血、软骨、肌肉等组织中分离出来。这些组织均来源于胚胎发育期的中胚层,胎盘由滋养细胞及大量起源于中胚层的间充质和血管共同组成,亦有报道从脐带中分离培养出间充质干细胞 。因此,提示我们,与脐带同为胎儿附属物的胎盘中可能也含有MSC。本实验试从胎盘和脐血中培养出类似于骨髓来源的间充质干细胞的贴壁细胞,并对这三种细胞进行形态学观察,利用免疫细胞化学方法对其进行表面抗原的测定和比较,探讨其作为MSC新来源的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料 胎盘、脐血均采自本院产房。供者要求是身体健康的产妇,胎儿发育良好。新鲜骨髓标本采自本院门诊营养性贫血(骨髓呈增生象)患者。二氧化碳培养箱系美国谢尔登有限公司产品;SH型、胰蛋白酶、胶原酶、DNase?酶系Sigma公司产品;牛血清白蛋白(BSA)系Roche公司产品;胎牛血清(FBS)系杭州四季青生物工程材料有限公司产品;为GIBCO公司产品;小鼠抗人CD34、CD45单克隆抗体,兔抗人CD44、CD106多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1.2 胎盘、骨髓来源贴壁细胞的分离培养 在无菌条件下,剪取新鲜胎盘蜕膜层与羊膜层之间的绒毛组织,用含肝素的PBS反复冲洗,去除其血液成分。将绒毛膜层组织剪碎至约1mm×1mm×1mm大小,并尽可能去除肉眼可见的小血管及纤维连接成分,加入含2.5g/L胰蛋白酶、1g/L胶原酶?、0.1g/L DNase?酶的,于37?恒温摇床内消化30min。消化产物经200目无菌金属滤网过滤,去除未消化的组织。过滤后的细胞悬液用PBS洗2次,然后进行细胞计数。骨髓液经Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞并计数。脐血经60g/L羟乙基淀粉和Ficoll密度梯度离心两步法分离出单个核细胞并计数。 以上三种来源的细胞计数后均用含100mL/L胎牛血清的,在37?、50mL/L CO2和饱和湿度下培养。贴壁24-48h后,换液去除悬浮细胞。继续培养,每3-4d换液1次。待细胞80%-90%融合后,胰酶消化传代。取3代以上传代细胞部分用于细胞化学染色,部分细胞液氮冻存备用,余者用于继续传代和诱导实验。 1.3 细胞诱导分化及染色 上述三种来源的原代贴壁细胞和传代细胞经胰酶消化后,分别接种于预放置有消毒无菌盖玻片(用于制备细胞爬片)的12孔板内培养,加入成骨诱导剂(地塞米松、β磷酸甘油、抗坏血酸,终浓度分别为10-8mol/L、10mmol/L、50mg/L)进行诱导分化,同时设置对照(仅含培养基),每3d换液1次。分别逐日进行观察,细胞爬片用于细胞化学染色。 1.4 观察指标及鉴定 倒置显微镜下观察原代及传代细胞生长、增殖的形态特征、分布及形成时间。 贴壁细胞的鉴定:?细胞组织化学按文献[8]方法操作。取细胞载片,行瑞 氏染色、非特异性酯酶(NSE)染色、过氧化物酶(POX)染色、糖原(PAS)染色和碱性磷酸酶(ALP)染色,光镜镜检。?免疫组化染色按文献[1]方法操作。取培养细胞载片行CD34、CD106、CD44、CD45等指标检测,显微镜下计数100个贴壁细胞,计算阳性率。 2 结果 2.1 MNC的分离培养 5份骨髓标本和9份胎盘组织分离培养后均获得了贴壁细胞。分离了7份正常脐血标本,平均获得MNC(1.55?1.15)×108个,有 4份获得了贴壁细胞,获得率为57.1%。 2.2 贴壁细胞的形态特征 胎盘细胞刚分离时,细胞大小不均一,以单核的细胞为主,多核的细胞较少(图1A)。培养2-4d出现纤维样细胞,多核细胞大多融合或出现核固缩。约需1-2周左右,镜下可见贴壁细胞呈多样性。待培养3周后可见致密的贴壁细胞层。细胞形态由早期混合形态逐渐变为相对均一的梭形。细胞接近融合时呈条索状,集落中的细胞排列呈漩涡状或辐射状(图1B),且贴壁牢、增长速度较快,用2.5g/L胰蛋白酶消化需要5-10min,传代后形态无明显改变,最多可以传10代。 脐血MNC接种时细胞呈圆形,第3-5天始出现贴壁细胞,第7天换液去除未贴壁细胞后观察,获得的贴壁细胞形态表现不均一,在少量的纤维样细胞周围混杂有大量的破骨样细胞,大小不一,边缘光滑,出现多核,胞核大且清晰;纤维样细胞出现较少,呈梭形,胞内常含有空泡和(或)颗粒,散在存在(图2A)。培养大约14-22d纤维样细胞增多占大多数,主要表现细胞体积增大,但并不融合(图2B)。脐血MNC中获得的贴壁细胞不易被胰蛋白酶消化,时间较长,以2.5g/L胰蛋白酶消化超过10min,传代后生长缓慢最多可传2代,细胞无法继续增殖。 骨髓MNC培养第2-3天出现贴壁细胞,约2-4d后出现纤维样细胞,形态均一,第5-6天后可见散在分布的典型的纤维样细胞克隆,第7天换液时部分细胞出现融合,增殖迅速,第13-17天细胞接近90%融合,集落中的细胞排列有一定方向性,呈漩涡状或辐射状。培养2周细胞可传代,1.25g/L胰酶消化时间为3-5min,传代后6h即可贴壁,形态与原代相似,长梭形,生长迅速,约3-4d左右达到90%融合,进行传代,最多可以传14代,细胞形态并无明显变化,但增殖速度已明显减慢。 2.3 细胞化学染色 三种不同来源的贴壁细胞POX染色均为阴性,PAS染色均为阳性;脐血来源的贴壁细胞ALP染色阳性率为20%,其NSE染色也较其他两种来源者阳性率高(表1)。 表1 不同来源的贴壁细胞的组织化学染色结果(略) Table 1 Histochemical staining of the adherent cells derived from different tissues 2.4 免疫细胞化学染色 三种不同来源的贴壁细胞CD44、CD106染色均为阳性(图3),CD34、CD45染色均为阴性(表2)。 2.5 贴壁细胞向成骨细胞的诱导分化 胎盘和脐血来源的贴壁细胞经地塞米松诱导向成骨细胞转化后,形态并无明显变化,碱性磷酸酶染色呈强阳性。骨髓MNC向成骨细胞转化后,细胞形态发生很大改变。加入诱导物后的第7天,胞体增大,多角形细胞增多,第14天大部分的细胞成为多角形;诱导后的细胞ALP表达明显增加,大部分的多角形细胞呈强阳性反应,梭形细胞染色略弱。 图1 胎盘来源的原代贴壁细胞(略) ived primary adherent cells A: Just isolation (×200); B: 3 weeks after isolation (×40) 图2 脐血来源的原代贴壁细胞(略) Fig.2 Isolation and morphology of primary adherent cells derived from umbilical cord blood A: 7 days after isolation (×40); B: 3 weeks after isolation (×40) 图3 脐血来源的贴壁细胞的免疫细胞化学染色(略) Fig.3 Immunohistochemical staining of the adherent cells derived from umbilical cord blood A: CD44 staining (×40); B: CD106 staining (×40) 表2 不同来源的贴壁细胞的免疫细胞化学染色结果(略) Table 2 Immunohistochemical staining of the adherent cells derived from different tissues CD: cluster of differentiation; VCAM: vascular cell adhesion molecule 3 讨论 1987年Friedenstein等[9]发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个细 胞具有成集落能力的、非吞噬细胞的和成纤维细胞的性状,而且在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,而且这些细胞经过20-30个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞是中胚层的干细胞,理论上可以分化发育为多种中胚层来源的间质细胞,故称之为间充质干细胞。目前,MSC主要来源于骨髓,但由于人骨髓中的MSC含量极少,而且骨髓源性MSC随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势。因此,在更广的范围中寻找间充质干细胞来源,已受到越来越多的关注。 本研究中胎盘贴壁细胞出现时间与骨髓细胞相近,但融合成片时间略长于骨髓;脐带血细胞培养出现贴壁细胞及细胞融合成片均比骨髓细胞的培养出现时间晚,可能是由于脐血细胞较为原始,需要更长的生长时间。骨髓和脐带血细胞培养的细胞增殖,前7d无明显差异,3周时胎盘和脐带血细胞则有继续增殖的趋势,而骨髓细胞则增殖减缓。脐血贴壁细胞在生长规律和形态学特征上与骨髓基质相比有一定差异性。胎盘贴壁细胞的生长规律近似于脐血基质细胞,而形态学特征和骨髓基质细胞相近,为典型的成纤维细胞样,并呈漩涡状生长。这两种差异性的产生反映出了胎盘贴壁细胞和脐血基质细胞自身的特点。在本实验中发现,脐血标本的个体差异非常大,贴壁细胞获得率为57.1%,且并不能形成典型的间充质干细胞。 对三种来源的MSC表面标志的检测表明,MSC不表达造血细胞表达标志CD34、CD45,其表达的主要标志为间质细胞表面标志及基质细胞黏附分子CD44、CD106。表明胎盘和脐血贴壁细胞具备造血基质细胞的基本特征。 实验中还发现,由于胎盘成分较复杂,即使通过不断换液去除非贴壁细胞,培养细胞中仍可能混有成纤维细胞或内皮细胞等成分。这些细胞可能在胰酶消化传代后逐渐失去增殖能力而消失。但是,在植入体内后细胞是否异常分化值得关注,仍需进一步探索胎盘来源的MSC的分离纯化技术,并需要通过大量动物实验深入研究胎盘MSC在体内发挥效应的机制,为今后临床应用奠定基础。 【参考文献】 [1]Deans RJ, Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and [2]Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells [J]. Science, 1999, [3]Akita S, Fukui M, Nakagawa H, et al. Cranial bone defect healing is accelerated by mesenchymal stem cells induced by [4]Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional [5]法宪恩,王利霞,侯剑峰,等氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心 肌样细胞分化观察 [J]. 郑州大学学报(医学版 [6]Zhang X, Mitsuru A, Igura K, et al. Mesenchymal progenitor cells derived from chorionic villi of human placenta for cartilage tissue engineering [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, [7]Yen BL, Huang HI, Chien CC, et al. Isolation of multipotent [8]司徒镇强, 吴军正. 细胞培养 [M]. 西安:世界图书出版西安公司, [9]Friedenstein AJ, Chailakayan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in
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