活血止痛胶囊微生物限度检查方法的验证

微生物限度检查的验证 ygfyzy 整理 微生物限度检查方法的验证 包括: 1.细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证——准确性（回收率） 2.控制菌检查法的验证——专属性 3.实例 一、细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 1.验证的目的： 确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定。照 此检查法和检验条件进行供试品细菌、霉菌、酵母菌数检查能保证检验 结果的准确、可靠。 2.验证的步骤： •根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 •保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。 •按制定的方法进行试验。 •根据验证结果，判断是否符合验证的。若符合,按验证的方法和条 件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证，再进 行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所的方法 及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进 行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 3. 验证用菌株： 细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。 霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。 第 1 页 共 21 页 技术部四号机 仅供参考 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中 常见的污染菌)。 菌种的要求：不得超过 5 代。采用适宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。 4.验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心 沉淀法、联合方法。 5.样品稀释级的选择：最低稀释级，1g 或 1ml。 6.培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养 基、改良马丁琼脂培养基。 7.菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至 10ml营养肉汤中，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7， 使菌数约为 50～100cfu/ml。 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml改良马丁培养基中，23～ 28℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml， 采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7，使菌数约为 50～100cfu/ml。 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～ 28℃培养 5～7 天，加 3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出 菌液，取 1ml菌液加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法， 稀释至 10-4～10-6，使菌数约为 50～100cfu/ml。 8.供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至 100ml 液体：10ml 供试品+稀释剂至 100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或薄膜过滤。 第 2 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 • 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。 8.1 菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的 1ml 菌液（约 50～100cfu），分别注入平皿中，立 即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌 落数。 8.2 供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底 菌数。（和试验组采用同法） 8.3 试验组： 平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 和 50～100cfu 试验菌， 分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿， 按平皿法测定其菌落数。 培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 分别 注入 n 个平皿，每个平皿再注入 50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中， 立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 份，按平皿法测定其菌落 数。 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗， 应在最后一次的冲洗液中加入 50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤 法测定其菌数。至少要一张膜。 离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许 多药渣，先以低速 500r/min 离心 3～5min，取上清液，再以 3000 r/min 第 3 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 离心 10～30min，取下面 1ml 液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底， 将洗涤液与液体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。 8.4 稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜 过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微 生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验 菌，使最终菌浓度为每 1ml 供试液含 50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 9.结果判断指标 试验组的菌回收率（≥70%） 稀释剂对照组的菌回收率（≥70%） 10. 回收率计算： 表 1 试验组回收率测定结果 阳性菌 实验次数 菌液组 菌落数 试验组 菌落数 供试品对照组 菌落数 回收率％ 1 2 大肠 埃希菌 3 1 2 枯草芽 孢杆菌 3 1 2 金黄色 葡萄球 菌 3 1 2 白色 念珠菌 3 第 4 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 1 2 黑曲 霉菌 3 注： （试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数） 回收率 ＝ 菌液组平均菌落数 × 100％ 表 2 稀释剂对照组回收率测定结果 阳性菌 实验次数 菌液组菌落数 稀释剂对照组菌落数 回收率％ 1 2 大肠 埃希菌 3 1 2 枯草芽 孢杆菌 3 1 2 金黄色 葡萄球 菌 3 1 2 白色 念珠菌 3 1 2 黑曲 霉菌 3 注： 稀释剂对照组平均菌落数 回收率 ＝ 菌液组平均菌落数 × 100％ 第 5 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 每一验证菌株均应进行上述试验。 验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每 次试验的回收率。 验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。验证霉菌、酵母菌各平皿倾 入玫瑰红钠琼脂培养基。置规定温度培养 48 或 72h,菌落计数。计算回 收率。 11.回收率测定举例 11.1 供试液不用特殊制备方法 11.1.1 常规法 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml/平皿，平行 2 个平皿（计算供试 液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 1ml+ 1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算 供试液平均菌数：A） 回收率=(A－B)÷C×100% 11.1.2 培养基稀释法（5 个平皿） 菌液组：1ml 菌液/平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml 分别注 5 个平皿，0.2ml /平皿， 平行 2 份，共 10 个平皿（计算 0.2ml 供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 0.2ml+1ml 菌液/平皿，注 5 个平皿，平行 2 份（计算平均菌数：A) 回收率=(A－B)÷C×100% 培养基稀释法可以是 1ml 供试液注 2 个、5 个或更多个平皿。但是 更多的平皿由于操作繁琐易污染一般不做。 第 6 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 11.2 供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等) 11.2.1 常规法 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml /平皿，平行 2 个平皿（计算供 试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 1ml+ 1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算 供试液平均菌数：A） 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂 + 1ml 菌液，平行 2 个平皿 （计算供试液平均菌数：D） 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.2 培养基稀释法（5 个平皿） 菌液组：1ml 菌液/平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml 分别注 5 个平皿，0.2ml /平皿， 平行 2 份，共 10 个平皿（计算 0.2ml 供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 0.2ml+ +加中和剂或乳化剂 1ml 菌液/平皿， 平行 2 个平皿（计算平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+ 1ml 菌液，平行 2 个平皿（稀 释剂对照组与试验组同法操作）（计算平均菌数：D) 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.3 供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法） 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 10ml +离心，500rpm 离心取上清， 第 7 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 加稀释剂至 10ml ，取 1ml 注平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌数：B) 或 3000rpm 离心取沉淀，加稀释剂至 10ml ，取 1ml 注平皿，平行 2 个 平皿（计算平均菌数：B) 试验组：最低稀释级供试液 10ml+离心，500rpm 离心取上清，加稀释剂 至 10ml，取 1ml+1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌数：A)或 3000rpm 离心取沉淀，加稀释剂至 10ml，取 1ml+1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组：取与菌液组细菌浓度相同的稀释剂 10ml，3000rpm 离心 取沉淀，加稀释剂至 10ml，取 1ml 注平皿，平行 2 个平皿（计算平均菌 数：D)（稀释剂对照组与试验组同法操作） 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.4 试液需用特殊制备方法（薄膜过滤法） 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：含 1g 或 1ml 的供试液，过滤冲洗，至少 1 张膜（菌落 计数：B) 试验组：含 1g 或 1ml 的供试液，过滤冲洗，+1ml 菌液，过滤，至少 1 张膜（菌落计数：A) 稀释剂对照组：稀释剂+菌液，过滤冲洗，至少 1 张膜（菌落计数：D) 过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂培养基平板上， 菌面朝上。过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫瑰红钠琼 脂培养基平平板上，菌面朝上。 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 第 8 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 11.3 计数方法的确定 细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。 细菌以各试验菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的 回收率均能达到 70%以上的检测方法为准。 霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均能达 到 70%以上的检测方法为准。 11.4 计数方法的验证——结果判断 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于 70%。 若试验组的菌回收率均不低于 70%，则按此供试液制备方法和计数 法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能保证检验结果的准确、可靠。 若任一次试验中试验组的菌回收率低于 70%，应采用培养基稀释法、 离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除 供试品的抑菌活性，并重新验证。 二、控制菌检查法的验证 1.试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。 1.1 阴性对照菌株:选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外用选用大肠 埃希菌 。 1.2 菌种的要求：不得超过 5 代。采用适宜的方法保存。 1.3 加菌量:10～100cfu 验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。 第 9 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 1.3.1 试验组：取规定量供试液及 10～100cfu 试验菌加入增菌培养基 中，依相应控制菌检查法进行检查. 1.3.2 阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法 的特异性，方法同试验组。 2 控制菌检查验证用菌株：大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌、生孢梭菌 。 2.1 口服制剂 2.1.1 验证用菌株：大肠埃希菌 大肠菌群 沙门菌 2.1.2 阴性对照菌菌株：金黄色葡萄球菌 2.1.3 检查方法： 大肠埃希菌按大肠埃希菌项下检查 大肠菌群按大肠菌群项下检查 沙门菌按沙门菌项下检查 2.2 外用制剂 2.2.1 验证用菌株：铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 2.2.2 阴性对照菌菌株：大肠埃希菌 2.2.3 检查方法： 铜绿假单胞菌按铜绿假单胞菌项下检查 金黄色葡萄球菌按金黄色葡萄球菌项下检查 生孢梭菌按生孢梭菌项下检查 3.验证方法选择：常规法、稀释法、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、 联合方法。 4.供试品量：1g 或 1ml，沙门菌检查为 10g。 5.培养基：营养肉汤培养基、胆盐乳糖增菌液、MUG 培养基、胆盐乳糖 第 10 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 发酵管、四硫磺酸盐增菌液、胆盐硫乳琼脂平板、麦康凯琼脂平板、溴 代十六烷三甲胺平板、甘露醇氯化钠平板、0.1%疱肉培养基、含庆大霉 素的哥伦比亚琼脂平板。 6.菌液制备 接种大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢 梭菌的新鲜培养物至 10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养 18～24 小 时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释 法，稀释至 10-5～10-7，使菌数约为 10～100cfu/ml。 6.1 常规法： 6.1.1 大肠埃希菌：取相当于 1g 或 1ml 供试品的供试液至 100ml 胆盐乳 糖增菌液，阳性菌对照加入大肠埃希菌 10～100cfu，阴性菌对照加入金 黄色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养物 0.2ml 接种至含 5ml MUG 培养基的试管内培养，观察荧光及靛基质试验。 阳性菌 MUG 阳性，靛基质阳性，则表明该样品对大肠埃希菌没有抑菌作 用。阴性菌未检出表明该控制菌检查方法的专属性好。若阳性菌未检出 则表明该样品对大肠埃希菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。 6.1.2 大肠菌群：取含适量（不少于 10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管 3 支，分别加入含供试品 0.1g 或 0.1ml 、0.01g 或 0.01ml、0.001g 或 0.001ml 的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌 10～100cfu，阴性菌对 照加入金黄色葡萄球菌 10～100cfu， 35～37℃培养 18～24 小时观察结 果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对大肠菌群无抑菌作用 且专属性好。若阳性菌未检出则表明该样品对大肠菌群有抑菌作用，需 对供试液进行处理。 6.1.3 沙门菌：取供试品 10g 或 10ml,直接或处理后接种至适量（不少 第 11 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 于 200ml）营养肉汤培养基中，混匀，阳性菌对照加入沙门菌 10~100cfu， 阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100cfu ，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养物 1ml 接种于 10ml 四硫磺酸盐增菌液，培养 18～24 小 时后划线于胆盐硫乳琼脂平板、麦康凯琼脂平板观察结果。若阳性菌检 出而阴性菌未检出则表明该样品对沙门菌无抑菌作用且专属性好。若阳 性菌未检出则表明该样品对沙门菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。 6.1.4 铜绿假单胞菌：取相当于 1g 或 1ml 供试品的供试液至 100ml 胆盐 乳糖增菌液,阳性菌对照加入铜绿假单胞菌 10～100cfu，阴性菌对照加 入大肠埃希菌 10～100cfu， 35～37℃培养 18～24 小时，取此培养物划 线接种于溴代十六烷三甲铵平板观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检 出则表明该样品对铜绿假单胞菌无抑菌作用且专属性好。若阳性菌未检 出则 表明该样品对铜绿假单胞菌有抑菌作用，需对供试液进行处理。 6.1.5 金黄色葡萄球菌：取相当于 1g 或 1ml 供试品的供试液至 100ml 营养肉汤培养基,阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100cfu，阴性菌 对照加入大肠埃希菌 10～100cfu，35～37℃培养 18～24 小时，取此培 养物划线接种于甘露醇氯化钠平板观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未 检出则表明该样品对金黄色葡萄球菌无抑菌作用且专属性好。若阳性菌 未检出则表明该样品对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，需对供试液进行处 理。 6.1.6 生孢梭菌：取相当于 1g 或 1ml 供试品的供试液至 100ml 0.1%疱 肉培养基,阳性菌对照加入生孢梭菌10～100cfu阴性菌对照加入大肠埃 希菌 10～100cfu， 35～37℃厌氧培养 72～96 小时，取 0.2ml 涂抹于含 庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板 35~37℃ 厌氧 48~72h 观察结果。若阳性 第 12 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌无抑菌作用且专属性 好。若阳性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌有抑菌作用，需对供试液 进行处理。 7.结果判断： 阴性菌对照组未检出阴性对照菌，试验组检出试验菌，表明该法专 属性强，可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检 查。 若试验组未检出试验菌，表明该供试品有抑菌作用，应采用稀释法、 离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除 供试品的抑菌活性，并重新验证。 大肠埃希菌检查流程图 供试品→ 供试液 ↓ 不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液 ↓35~37℃ 18~24h 取 0.2ml ↓ 5mlMUG培养基中 ↓35~37℃ 5、24h 366nm紫外光下观察 ↓ 加靛基质试剂 ┌────────────┐ MUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阴性 MUG阳性，靛基质 阴性 ↓ ↓取胆盐乳糖培养液划线 报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板 ↓36±1℃ 18~24h ┌────────────┐ 阳性 阴性 ↓ ↓ 镜检、适宜的生化试验 报告 ↓ 报告 8.培养基稀释法： 供试品有抑菌作用，放大培养基量，由 1：100 放大为 1：300、1： 第 13 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 500 或 1：1000。由于盛放培养基容器体积有限，一般放大到 500ml 或 1000ml。本法适用于抑菌作用不强的中西药制剂，操作简便易行，应用 范围广泛。 9.薄膜过滤法： 采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在 最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。 10.离心沉淀法： 取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以低速 500r/min 离心 3～5min，取上清液，再以 3000 r/min 离心 10～30min，取下面 1ml 液 体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养。 本法适用于中度抑菌作用的中西药制剂。 11.中和法： 在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌性成分的 作用。中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物 亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。 常见的中和剂有: (1)磺胺类药物:加入适当的对氨基苯甲酸 (2)含重金属的药物:在培养基中加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨 酸 (3)洗必泰制剂:加入聚山梨酸 80(3%)或卵磷脂(3%) (4)卤素:加入硫代硫酸钠(0.1%) 三、药品微生物限度检查法验证示例 例 1.xxxxx 胶囊微生物限度检查法验证试验 第 14 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 1.1 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 1.1.1 样品 xxxxx 胶囊，批号 20050401，生产厂家为 xxxxx 药业有限 公司。 1.1.2 验证用菌种 枯草杆菌 CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌 CMCC （B）26003、大肠埃希菌 CMCC（B）44102、白色念珠菌 CMCC (F) 98001、 黑曲霉 CMCC(F)98003。来自 xxxxx。 1.1.3 方法 中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。 1.1.3.1 菌液制备 取经 37℃培养 18~24h，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、 枯草杆菌肉汤培养物 1 ml +9ml盐水 10 倍，稀释至 10-5~10-7为 50~100 个/ml做活菌计数，备用。取经 20℃~25℃培养一周的黑曲霉斜面培养物， 加水 3~5 ml，洗下霉菌孢子，用带有棉花的球形吸管取出菌液，用标准 比浊管比浊后，稀释为 50~100 个菌做活菌计数，备用。 1.1.3.2 供试液制备 各样品浓度均为 1：10 供试液，分别加入上述 5 种试验菌株。 1.1.3.3 培养基稀释法 采用 0.5ml/皿，0.4ml/皿，0.3ml/皿，0.2ml/ 皿，0.1ml/皿的供试液，加 15~20ml 琼脂培养基做细菌记数，测定回收 率。 1.1.4 回收率测定 1.1.4.1 试验组 取 1：10 供试液加入菌液使 50~100cfu/ml 试验菌，立 即倾注琼脂培养基，平行制备两个平皿，按中国药典 2005 年版培养及 菌落记数方法测定其菌落数。 1.1.4.2 菌液组 测定加入的试验菌数。 第 15 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 1.1.4.3 供试品对照组 取规定量供试液，按菌落记数方法测定供试品本 底菌数。 1.1.4.4 稀释剂对照组：考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试验时，加入 5 种不同代表试验菌株，使最终菌液浓度为每 1ml 含 50~100 个菌。 1.1.5 结果 常规法、培养基稀释法在 xxxxx 胶囊微生物限度检查法的验证结 果见表 1、表 2。 表 1 xxxxx 胶囊微生物限度检查方法验证 （常规法） 人工染菌回收率(%) 金黄色葡萄 球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试 验 次 数 供试 品浓 度 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 1 1:10 54.6 96.3 91.8 97.9 51.4 96.9 91.5 94.9 92.5 95.7 2 1:10 61.2 94.4 89.8 94.4 52.1 90.0 92.3 96.2 91.4 98.3 3 1:10 60.3 93.3 90.1 96.7 48.7 93.5 91.5 97.1 90.8 96.9 表 2 培养基稀释法（1ml 加 2 个平皿）xxxxx 胶囊 微生物限度检查验证 人工染菌回收率(%) 金葡菌 枯草杆菌 试验 次数 供试品 浓度 试验组 稀释剂对照组 试验组 稀释剂对照组 1 1:10 80.7 96.5 97.2 96.3 2 1:10 91.4 95.8 96.4 97.5 第 16 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 3 1:10 85.3 92.8 97.5 94.9 从表 1 结果可以看出:采用常规方法检验 xxxxx 胶囊供试品，人工 污染 5 株代表菌株，该供试品对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的 回收率试验均高于 70%，可采用常规方法检验。表 2 中的结果， 采用培养基稀释法可消除供试品对人工污染金黄色葡萄球菌和枯草杆 菌的抑菌作用。回收率达到 70%以上。因此，培养基稀释法（0.5ml/ 皿）可用于 xxxxx 胶囊的微生物限度检查。 1.1.6 结论 根据验证试验结果，确定 xxxxx 胶囊微生物限度检查法为细菌数 测定可采用培养基稀释法（0.5ml/皿）测定，霉菌数可采用常规法测 定。 1.2 控制菌检查方法的验证 1.2.1 验证试验用菌种： a.大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕 b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 c.乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B) 〔CMCC(B) 50 094〕 d.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10 104〕 e.生孢梭菌(Clostridium sporogenes) 〔CMCC(B)64 941〕 来自 xxxxxx。 1.2.2 菌液制备： 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单 胞菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培 养物到硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养 18～24 小时。用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 10～100cfu（菌落形成单位）的菌 第 17 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 悬液。 1.2.3 供试液制备 取样品 10g，加 0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液 90ml 浓度均为 1：10 供试液，分别人工污染上述 5 种代表试验菌株。 1.2.4 验证方法 (1) 试验组：取规定量供试液及 10～100cfu 试验菌加入增菌培养 中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供 试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增 菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中 (2) 阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同 试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采 用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法 时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 1.2.5 结果 试验组检出控制菌，阴性对照组未检出。 1.2.6 结论 根据验证试验结果，确定 xxxxxx 胶囊的控制菌检查可采用常规法测 定。 例 2.银翘解毒片 常规法 回收率(%) 试 验 次 供试 品浓 度 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 第 18 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 数 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 试验 组 稀释 剂对 照组 1 1:10 92.5 96.3 91.8 97.9 13.1 96.9 91.5 94.9 92.5 95.7 2 1:10 90.1 94.4 89.8 94.4 15 90 92.3 96.2 91.4 98.3 3 1:10 91.1 93.3 90.1 96.7 9.7 93.5 91.5 97.1 90.8 96.9 稀释法、低速离心+稀释法 (枯草杆菌) 回收率(%) 稀释法(5 个平皿) 稀释法(10 个平皿) 低速离心+稀释法 试 验 次 数 供试 品浓 度 试验组 稀释剂对照组 试验组 稀释剂对 照组 试验组 稀释 剂对 照组 1 1:10 32.3 96.5 48.1 96.3 72.2 97.2 2 1:10 40.3 95.8 43.0 97.5 78.5 96.4 3 1:10 36.7 92.8 52.5 94.9 75.0 97.5 结论 银翘解毒片的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法 细菌计数：低速离心+稀释法 真菌计数：常规 例 3.霍香正气水 常规法 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 1:10 2.5 1.5 5.3 39.7 25.0 2 1:10 2.6 3.2 8.3 32.9 26.9 3 1:10 1.6 1.4 5.8 30.0 21.0 薄膜过滤法 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 1:10 92.1 92.6 88.7 88.0 104.4 第 19 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 2 1:10 90.8 110.6 93.1 95.9 89.9 3 1:10 94.4 90.9 104.5 95.7 101.4 结论 霍香正气水的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法 细菌计数：薄膜过滤法 真菌计数：薄膜过滤法 例 4.通宣理肺丸 常规法 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 1:10 28.5 23.8 23.2 97.7 78.6 2 1:10 32.5 22.3 21.7 91.5 92.9 3 1:10 26.2 25.0 19.5 89.5 71.4 离心沉淀法 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 1:10 144.9 84.9 102.9 2 1:10 129.2 96.5 97.1 3 1:10 108.9 96.5 108.6 稀释法 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 1:10 93.0 73 96.1 2 1:10 90.7 70.7 85.0 3 1:10 90.2 94.6 87.2 结论 通宣理肺丸的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法 细菌计数：培养基稀释法（离心沉淀法） 真菌计数：常规法 第 20 页 共 21 页 微生物限度检查方法的验证 ygfyzy 整理 例 5.西瓜霜 常规法 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 1:10 45 0 0 0 93 2 1:10 51 0 0 0 91 3 1:10 58 0 0 0 91 培养基稀释法 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 菌 枯草杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 1:10 73 0 92 78 88 2 1:10 70 6.4 81 81 98 3 1:10 85 4.5 95 71 91 金黄色葡萄球菌 回收率(%) 试 验 次 数 供试 品稀 释级 离心法 离心+稀释法 1 1:10 13 93 2 1:10 30 89 3 1:10 49 81 结论 西瓜霜的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法 细菌计数：离心+培养基稀释法 真菌计数：培养基稀释法 第 21 页 共 21 页