颗粒裂解肽G13结构域在大肠杆菌中的高效融合表达

颗粒裂解肽G13结构域在大肠杆菌中的高效融合达 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，网址：http://www.fantibody.com 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询，期待您的加入：http://www.biomean.com 　　摘 要: 为高效表达颗粒裂解肽G13结构域并避免G13对宿主菌的毒性, 将人工合成的编码G13的基因片段, PCR扩增后克隆于原核表达载体pThioHisA中, 构建了重组表达载体pThioHisA-G13, 将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导表达融合蛋白Trx-G13, 表达产物以包涵体的形式存在, 其表达量约占细菌总蛋白的58%。包涵体蛋白经 8 mol/L尿素溶解后, 再经CNBr切割, 阳离子交换层析, 得到纯化的重组G13结构域。琼脂糖扩散法检测表明重组G13结构域多肽具有抗菌活性。 　　抗菌肽(Antimicrobial peptide)是生物体内产生的一种阳离子小分子多肽, 广泛存在于植物和动物体内, 是天然免疫防御系统的一部分[1]。当前, 抗生素的大量使用导致耐药性菌株的产生, 因而开发新型抗生素显得越来越重要。抗菌肽是通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果, 所以不容易导致耐药性菌株的产生和交叉抗性反应, 被认为是抗生素的替代品和增效剂[2], 其潜在的价值已经受到人们的广泛关注。 　　颗粒裂解肽(Granulysin)是细胞毒性淋巴细胞CTL和天然杀伤细胞NK内的颗粒中含有的一种阳离子抗菌肽, 对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、寄生虫均有杀菌活力, 尤其是对结核分枝杆菌有直接的细胞毒性[3]。G13结构域是颗粒裂解肽中含有一个a螺旋和loop结构的肽段, 由19个氨基酸残基组成。Wang等[4]化学合成不同大小的granulysin肽段, 发现G13肽段可抑制细菌、真菌的活性, 但对动物细胞和脂质体没有影响, 因此具有重要的研究和应用价值。 　　抗菌肽的基因现已成为研究热点, 建立了原核表达系统、酵母表达系统、昆虫系统等用于生产重组抗菌肽。然而在表达抗菌肽的过程中遇到了许多困难, 主要表现在抗菌肽对宿主菌产生毒性作用、易被蛋白酶降解以及表达水平低3个方面[5]。而本研究通过构建硫氧还蛋白(Trx)与G13的原核表达载体pThioHisA-G13, 克服了G13对宿主细胞的毒性, 实现了高效重组表达, 琼脂糖扩散法证明了重组G13结构域多肽具有抗菌活性。这为进一步研究G13结构域的生物学活性及开发经济有效的生产方法打下了基础, 且有可能为其他阳离子抗菌肽的表达提供借鉴。 　　1 材料和方法 　　1.1 菌株及载体 　　Escherichia coli BL21 (DE3), DH5a, 枯草芽孢杆菌, 表达载体pThioHisA均由本实验室保存。 　　1.2 工具酶及主要试剂 　　Taq DNA聚合酶、IPTG、低分子量蛋白标准为上海生物工程公司产品, 限制性内切酶EcoR I、Sal I为美国MBI Fermentas公司的产品, T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司。质粒小量快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒为北京道普生物公司产品, 酵母膏提取物、蛋白胨为OXOID公司产品, 其他试剂为国产分析纯。 　　1.3 颗粒裂解肽G13结构域基因的克隆及原核表达载体的构建 　　1.3.1 颗粒裂解肽G13结构域的基因克隆 根据颗粒裂解肽G13结构域的氨基酸序列QRSVSNAATRVCRTGRSRW, 依照大肠杆菌偏爱密码子设计基因序列: 5¢-CAGCGTTCTGTGTCTAAC GCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCTCGTTGG-3¢, 由上海生工合成; 根据合成的颗粒裂解肽G13基因片段设计一对特异性引物, 上游引物P1: 5¢-AGAATTCATGCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3¢, 下游引物P2: 5¢-ATTGTCGACTTACCAACGAGAA CGACCAG-3¢(下划线部分分别为EcoR I酶切位点和Sal I酶切位点)。在上游引物中引入了EcoR I酶切位点和Met密码子, 方便后来用CNBr将G13肽段从融合蛋白中切割下来; 下游引物中引入了Sal I酶切位点和终止密码子。 　　以G13结构域编码序列为, PCR扩增G13结构域。PCR反应条件: 94oC 30 s, 62oC 15 s, 72oC, 15 s, 30个循环。取5 mL反应产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳, 鉴定扩增产物。用凝胶回收试剂盒回收相应片段。 　　1.3.2 表达载体的构建与鉴定 PCR产物和载体pThioHisA均用EcoR I、Sal I双酶切, 酶切产物切胶纯化后, 16oC, T4 DNA连接酶连接, 连接产物转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞, 氨苄青霉素筛选阳性克隆。重组质粒命名为pThioHisA-G13, 相关帮助 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，网址：http://www.fantibody.com 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询，期待您的加入：http://www.biomean.com