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融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及G13结构域的分离纯化

2013-01-24 1页 doc 12KB 19阅读

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融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及G13结构域的分离纯化
融合蛋白在大肠杆菌中的诱导达及G13结构域的分离纯化 相关帮助 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库,其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成,以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台,网址:http://www.fantibody.com 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的,可以访问探生网进行咨询,期待您的加入:http://www.biomean.com   融合蛋白的诱导表达及包涵体的处理   将含有重组质粒pThioHisA-G13的工程菌接种到含氨苄青霉素(50 mg/mL)的LB培养基中37oC振荡培养过夜, 按1%的接种量接种到相同的LB培养基中进行放大培养, 37oC振荡培养至OD600为0.5~0.6时, 加入终浓度1 mmol/L的IPTG, 37oC振荡培养, 诱导4 h后, 8000 r/min离心10 min收集菌体, 把菌体重悬于Buffer A(50 mmol/L Tris·HCl pH 7.9; 0.5 mmol/L EDTA; 50 mmol/L NaCl; 5% 甘油; 0.5 mmol/L DTT)中, 超声破碎菌体(超声4 s, 间隔 6 s, 120次循环, 功率500 W), 12 000 r/min离心 10 min, 取上清、沉淀进行SDS-PAGE (5%分离胶, 15%浓缩胶)电泳。   将沉淀用Buffer B (50 mmol/L Tris·HCl pH 7.9; 0.5 mmol/L EDTA; 50 mmol/L NaCl; 1% Triton X-100; 0.5 mmol/L DTT)洗涤, 4oC离心(12 000 r/min) 15 min。将洗涤后的包涵体溶于尿素溶液(8 mol/L Urea, 0.1 mol/L HCl), 4oC离心(12 000 r/min) 15 min, 收集上清, 进行SDS-PAGE电泳, 用凝胶分析软件BandScan进行灰度扫描分析融合蛋白在包涵体中所占的比例, Bradford法测定包涵体溶解液中的蛋白含量。   重组G13结构域的纯化及鉴定 按照蛋白质: CNBr为1:5的比率(W/W), 将 CNBr溶液(400 mg/mL)加入到包涵体溶解液中, 于室温下避光反应24 h[6], 加1倍体积的ddH2O终止反应, Tricine-SDS-PAGE(16.5%)电泳分析切割效果, 剩余样对2000 mL PB缓冲液透析48 h。透析产物经0.45 mm的滤膜过滤后上PB缓冲液(20 mmol/L, pH 8.0)预平衡的CM-32阳离子交换柱, 0~1 mol/L NaCl线性梯度洗脱, 收集目的峰。Tricine-SDS- PAGE分析纯化产物, ESI-MS其分子量。纯化后的样品透析脱盐后冻干, 溶于pH 7.2、10 mmol/L的PBS缓冲液中。
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