人体组织液中葡萄糖浓度精密检测技术研究（可编辑）

人体组织液中葡萄糖浓度精密检测技术研究（可编辑） 人体组织液中葡萄糖浓度精密检测技术研究 人体组织液中葡萄糖浓度的 精密检测技术研究 TheResearchonPrecisionMeasurementof GlucoseConcentrationinHuman InterstitialFluid 申请博士学位 一级学科:仪器科学与技术 学科专业:测试计量技术及仪器 研究生:黄福祥 指导教师:徐可欣教授 天津大学精密仪器与光电子工程学院 二零零九年六月 一苓专兀，牛八月 ’j? 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导F进 J :作和嫩得的 二的研究J 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞叁鲎或其他教育机构的’7: 妒或i jE 扣f而使J吲过的材料。与我一同(T作的f刊忠对木研究所做的ft!f,,I吹献均L亿沦艾f 】 作了11』j确的并表示了c身于意。 嚏 。‘心 ? Ill 学僦„签穗两绎。„删:2m四小l| 学位论文版权使用授权 何天保刚、使川，’ 他沦文f内脱定。 本学位论文作者究全了解:苤垄叁鲎 特授卡义苤注盘堂町以将学位论义l!;|勺令部或部分内容编入仃天数捌J，fi进 J:枪 向 q家自‘关部门或机构送交论文的复1711件和磁髓。 保密的学位论文?:解密后适J j本授权说 】』j 学位论文作 导师签名: 专镭‘L 签’#I 期: 褡’7"-I J,圳 I其Jl:砂弘肜J p 中文摘要 人体血糖浓度的准确检测是糖尿病预防和治疗的前提和基础。传统的单点血 糖检测，不能反映人体24小时内实际发生的血糖波动。所以，人体血糖检测正在 朝着动态检测、连续检测的方向发展。在现有的检测方法中，有创方法不适合于 连续血糖检测，而无创光学方法目前还有许多关键问题有待 突破。因此，近些年 来，微创血糖检测技术已经成为科技发达国家研究开发的热点领域。利用微创血 自l 7二 糖检测技术开发连续血糖监测系统对糖尿病患者的病情控制 和治疗有重要意义， i 一 有重要的研究价值和广阔的市场应用前景。 本课题旨在开发一种新型的基于组织液测量的微创血糖连续监测系统。对低 浓度的葡萄糖溶液及组织液中的葡萄糖的测量需要考虑到测量分辨率以及针对 组织液中葡萄糖的特异性检测这两个要求。论文研究的微创血糖监测系统利用表 面等离子共振技术，并研究使用对葡萄糖有特异性吸附的D(半乳糖,D(葡萄糖结 合蛋白，通过检测人体表皮组织液中的葡萄糖浓度，来预测人体血糖浓度，可实 现血糖连续监测。论文完成的主要工作包括: 1(研究了表面等离子共振理论。分析了金属表面等离子波的产生及其在金 属内部和金属表面的传播。分析了光全反射激发金属表面等离子共振原理。比较 分析了各种类型表面等离子共振系统的调制方式，选用了固定光源的角度调制方 式。分析了各种类型的表面等离子共振系统的结构形式，选用了Kretschmann棱 镜型表面等离子结构形式。通过对表面等离子共振结构模型进行理论分析和计算， 研究了影响表面等离子共振光谱的因素，确定Kretschmann棱镜型系统结构参数。 2(研究了生物分子作用原理在表面等离子共振传感器中的应用。研究了对 于葡萄糖有特异性吸附能力的D(半乳糖绑定蛋白在表面等离子共振葡萄糖检测 中应用，研究了经过不同突变位点改造后的D(半乳糖绑定 蛋白对葡萄糖的吸附 特性。研究了将蛋白质固定在金膜表面的方法，使用胺耦合的方法实现蛋白质的 绑定。研究了蛋白质与传感器金膜表面结合的模型，和蛋白质活性及保护方法。 3(构建了一套自动化的表面等离子共振葡萄糖浓度检测系统。设计了机械 结构、控制软件以及算法软件等。围绕该系统开展了葡萄糖溶液以及人体组织液 的直接和间接的测量，改进了实验的流程，研究了影响实验结果的一些因素并提 出了改进的办法。 4(开展了表面等离子共振信号处理方法的研究。根据表面等离子共振检测 葡萄糖系统的信号和噪声的特点，研究了不同的算法在表面等离子共振数据分析 和处理中的应用。采用加权质心法精确地捕获到了表面等离子 共振曲线的最低点， 采用固定计算点数的动态基线法调整基线位置，消除了基线附近点值的波动对测 量结果的影响。 5(开展了葡萄糖溶液以及人体组织液的直接和间接的测量。通过对葡萄糖 溶液和组织液的测量实验表明: 1 表面等离子共振实验系统直接测量葡萄糖 溶液时，测量小浓度葡萄糖溶液时，获得的折射率与葡萄糖溶 液浓度成线性的正 比关系，直接测量时能够测量葡萄糖溶液的浓度范围为5mg,dL--209,dL。其中 折射率和葡萄糖溶液的浓度线性关系好的浓度部分为10mg一,dL--4009,dL。使用 直接法测量组织液中葡萄糖的浓度时，葡萄糖浓度的改变并不是组织液折射率变 化的唯一影响因数，所以测量所得到的折射率变化不能反映组织液中葡萄糖的真 实浓度。 2 表面等离子共振实验系统绑定蛋白测量葡萄糖溶液时，测量的灵 敏度和检测的特异性有所提高，测量下限0(05 mg,dL。使用不同突变的蛋白有不 同的工作范围。绑定蛋白测量组织液中葡萄糖的浓度时，能实现对葡萄糖的特异 性检测。 实验表明了表面等离子共振测量方法在人体葡萄糖连续检测领域有良好应 用前景。论文的创新点为: 1(论文将GGBP蛋白质引入基于表面等离子共振传感器的人体组织液中葡 利用GGBP蛋白质对葡萄糖分子的特异 萄糖浓度的精密测量， 性吸附特性，实现 了对微量、多组分人体组织液中葡萄糖浓度的排他性高精度检测。 2(论文采用加权质心法精确地捕获到了表面等离子共振曲线的最低点，采 用固定计算点数的动态基线法调整基线位置，消除了基线附近点值的波动对测量 结果的影响，用改进后的算法对人体组织液中的葡萄糖浓度进行测量，提高了表 面等离子共振的检测分辨率。 3(论文构建了基于微型表面等离子共振传感器的检测系 统，为人体组织液 中葡萄糖浓度检测仪器的小型化和临床应用奠定了基础。 k 关键词:葡萄糖组织液表面等离子共振D(半乳糖,D(葡萄 糖结合蛋白 吨 r ABSTRACT Theaccuratedetectionhuman of concentrationisthebasicand work glucose premise ofme andtreatmentofthediabetes(The conditionalof prevention waysglucose detectioncannot thereal fluctuationofblood thatoccurredin24 represent glucose hours(The detectionneedstobecome andcontinuous the glucose dynamic system(In detection invasive isnotsuitforthecontinuous existingglucose methods，the way the detection,andnon―invasive isstillunderresearch opticalway now(So，the measurementwhich minimally-invasive is tobeusedin glucose system promising clinic becomesthefocus ofresearchworldwide(The of quickly exploitation measurementhasexcellent minimally-invasive clinicvalueand glucose system marketinthetreatmentofthediabetes( promising Inthis novel measurementbased thesis，a onthe minimally-invasiveglucose system measurement ofinterstitialfluidiS the detectionofconcentrationof proposed(In intheinterstitial to the and glucose fluid，the approachesimprovespecificity in detectionare thatneedtobe sensitivity solved(Surface glucose urgentproblems is in tobuild plasmonresonance SPR techniquebrought upminimally-invasive measurement with Protein glucose system(Combined D??galactose,D-glucose Binding Can absorbthe GGBP ，which glucosespecially，theminimally-invasive glucose measurementcanestimate theblood concentrationthe system glucose through interstitial fluid(Themainworksinclude: 1(We the ofsurface resonance(Wethe of analyzedprinciple plasmon analyzedway surface resonancebe withother plasmon differentmodulation inspired(Compared SPR modulationwithf?ed sourcestructureissuitforOur systems，theangular light usedtheATR method―KretschmanntobuildSPR system(We geometryup system( 2(We the ofbiomolecular interactionusedintheSPR analyzedtechnology analysis Canabsorbthe mutated system(TheGGBP，which atdifferent glucose specially，were tofittheneedsofthemeasurementof differentconcentrationsof positions glucose( TheGGBPwereimmobilized ontheSPRbiosensoramine using couplingway( ontheminiaturesurface resonance builtthesurface 3(Basing plasmon sensor，we up resonance measurement withthis palsmon system(Togethersystem，mechanical andcontrolsoftwarewerealso structure developed( the ofsurface resonance 4(We thecharacteristicof outputsignal plasmon analyzed thatthe baselinemethodand simulationand showed dynamic experiment system(The Call theresolutionofSPR improve system( weigh―centroidalgorithm measurementcarriedoutthe onthesurface resonance system，we 5(Basing plasmon fluid(Theresultsshowed of solutionandinterstitial measuringglucose experiments theSPRsensormeasuresthe solution measured that: 1 When glucose directly，the rises withtheincreaseofconcentration( refractiveindexof solution glucose linearly linear in include has Thework relationship 5mg,dL--209,dL，andgood range theinterstitial measuredrefractive measures fluid,the 10mg,do--4009,dL(When of ininterstitial of indexcannotreflecttherealconcentration fluid， because glucose SPRsensorswith intheinterstitialfluid( 2 The theinfluenceofother components difference sensorwith GGBPmutatedatdifferent have workingrange(The positions sensorsucceedsin 1 the immobilizedSPR GGBP E49C hashighestsensitivity(The ininterstitialfluid( the distinguishglucose the Theresultsreveala futureto SPRin minimally-invasiveglucose bright apply innovationsofthethesisare: measurement(The was into measurementof 1(Inthe thesis，GGBP precision glucose brought surface resonance concentrationinhumaninterstitialfluidbasedonthe plasmon realize callabsorbthe call sensor(Wi也the GGBP，which glucosespecially，we concentrationinmicro―volumeand andexclusivemeasurementof precision glucose interstitialfluid( human multi-component Cancatchtheminimumofsurface 2(Inthe point thesis(weigh―centroidalgorithm baselinewithfixcalculation resonancecurve(Themethodsof dynamic plasmon ofsurface resonancecurve(The areusedtoeliminatethefluctuation poiIlts plasmon Can theresolutionof baselinemethodand dynamic weigh-centroidalgorithmimprove SPR system( measurementwas resonance 3(Inthethesis(surface system plasmon glucose buildtheblue totheminiaturizationof constructed，which glucose up print inhumaninterstitialfluid( concentration Fluid，SurfacePlasmonResonance， KEYWORDS:Glucose，Interstitial Protein D-(galactose,D??-glucoseBinding 目录 第一章 绪论„„„„„„„„„„„„„„„„„((1 1(1糖尿病的危 害„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„l 1(2连续血糖监测技 术„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 1(2(1连续血糖监测的意 义„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((2 1(2(2连续血糖监测的方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((3 1(3微创血糖检测技 术„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。4 1(4基于组织液分析的微创血糖榆测技 术„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(5 1(5基于表面等离子共振的葡萄糖浓度检测技术„„„„„„„„„„„„„„„„6 1(5(1表面等离子共振技术„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(6 1(5(2表面等离子共振测量葡萄糖浓度„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 1(6论文完成的主要工 作„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„8 第二章表面等离子共振技术„„„„„„„„„„„„„„10 2(1表面等离子共振技术理 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((10 2(1(1表面等离子共振技术的发展„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 2(1(2表面等离子共振技术的应用„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 2(1(3表面等离子共振技术的检测仪器„„„„„„„„„„„„„„„„„„12 2(2表面等离子共振理论„„„„„„„„„„„„„^„„„„„„„„„„„。14 2(2(1表面等离子波的产生„„„„„„„„„„。:„„„„„„„„„„„„(14 2(2(2表面等离子波的传播„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(15 2(2(3光激发表面等离子共振„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„17 2(2(4Ib'emchmann棱镜结构的表面等离子共振理论„„„„„„„„„„„„(19 2(2(5表面等离子共振调制方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„。j„„(21 2(3表面等离子共振系统的结 构„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((23 2(3(1Otto棱镜耦合型结 构„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((23 2(3(2 Kretschmann棱镜耦合型结 构„„„„„„„„„„„„„„„„„„„24 2(3(3其它棱镜形式结构„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 2(3(4光栅型结构„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„26 2(3(5光纤型结构„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„27 2(4表面等离子共振系统的结构分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(29 2(4(1不同金属的介电常 数„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 2(4(2不同金属中等离子波的传 播„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(30 2(4(3金膜厚度的影 响„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 2(5叫、结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((34 第三章基于GGBP蛋白质的表面等离子共振葡萄糖浓度检测技术„„„(35 3(1基于生物分子作用分析的SPR检测„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„35 3(1(1生物分子作用分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„35 3(1(2基于生物分子作用分析的SPR检测方法„„„„„„„„„„„„„„„36 3(1(3基于生物分子作用分析的SPR检测流 程„„„„„„„„„„„„„„„37 3(2 GGBP蛋白质及其制备方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。38 3(2(1 GGBP蛋白质„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ „(38 3(2(2 GGBP蛋白质的制 备„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39 譬 3(3 GGBP蛋白质在SPR传感器表面的绑 定„„„„„„„„„„„„„„„„„(40 3(3(1 GGBP蛋白质在SPR传感器表面的绑定过程„„„„„„„„„„„„„40 3(3(2 SPR传感器金膜表面的自组装分子 层„„„„„„„„„„„„„„„„41 313(3GGBP蛋白质在SPR传感器金膜表面基于胺耦合的绑定方法„„„„„„42 3(3(4SPR传感器绑定GGBP蛋白质后的保护„„„„„„„„„„„„„„„45 3(3(5 SPR传感器的再 生„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„46 3(4$PR动力学分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(46 3(4(1SPR动力学模型„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„46 3(4(2绑定蛋白的浓度分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„48 3(5硝、结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((48 第四章表面等离子共振检测葡萄糖浓度的数据处理方法„„„„„((49 4(1表面等离子共振检测的数据处理方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„。49 4(2表面等离子共振检测系统的噪声分 析„„„„„„„„„„„„„„„„„„((51 4(3表面等离子共振检测的数据预处 理„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(53 4(4寻找最低点算 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(54 4(4(1寻找曲线最低点的算 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„54 4(4(2寻找曲线最低点算法的模 拟„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„55 4(5基线选择算 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((59 4(5(1动态基线法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„59 4(5(2固定计算点数动态基线法„„„„„„„„„一-„„„„„„„„„„„60 4(5(3动态基线法的模 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参考文献„(:„„„„„„„????„„„(((((((((((„((((((((89 发表论文和科研情况说明„„„„„„„„„„„„„„„97 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((99 段是通过监测人体血糖浓度来调整降糖药物剂量，进而控制血糖浓度水平以预防 和减轻糖尿病及其并发症。因此，人体血糖浓度的准确检测是糖尿病预防和治疗 的前提和基础。国际上人体血糖浓度检测技术的研究主要集中在有创测量、无创 其中，有创血糖检测技术使病人疼痛，伤口易感测量和微创测量三个领域。 染、 需要耗材、不能实现血糖浓度的动态、连续检测，而光学无创血糖检测技术在世 界上尚处于研究阶段，距临床应用还有较大距离。本课题组将低频超声皮肤增透 PlasmonResonance， 技术、真空负压组织液抽取技术和表面等离子共振 Surface SPR 葡萄糖浓度测量技术有机结合，首次提出了一种全新的微创血糖浓度的动 态、连续、精确检测方法，能够满足动态、连续、精确血糖监测的需求。 1(1糖尿病的危害 糖是我们身体必不可少的营养物质。人们摄入的食物，经过消化系统转化为 如葡萄糖等 进入血液，被运送到全身的细胞，作为能量的来源。人体单糖 中 所有的细胞所需的糖都由血液来输送，血液中的糖称为血糖。人体血糖必须保持 在一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要，所以，维持人体血糖的正常浓 度非常重要。 糖尿病是一种慢性疾病，严重威胁着全球近1亿9000万人的健康。糖尿病主 要是因为胰腺分泌的胰岛素不足或者分泌出来的胰岛素不能发挥应有的作用引 起。当人体内的胰岛素不能将吸收的葡萄糖带入细胞内有效地转化为能量，也不 能将这些葡萄糖有效储存起来时，就会导致过多的葡萄糖在血液中积聚，引发糖 尿病。由于许多原因和疾病都可能引发糖尿病，因此，糖尿病实际上是一种新陈 代谢障碍综合症。糖尿病以高血糖为特征，糖尿病患者如果长期处于高血糖状态， 其眼、肝脏、神经、血管等组织会受到损伤，甚至会导致其器官功能衰竭。 国际糖尿病联盟 IDF 估计，至11J2025年，全球将有超过3亿3000万的人患糖尿 病。截止j!lJ2003年，中国已成为世界上糖尿病第二大国，拥有2380万糖尿病患者， 我国用于糖尿病的医疗费用为188(2亿人民币，约仅次于印度。2002年， 占全国 卫生事业费的4,，普通糖尿病病人的人均医疗费用为每年3726元，有并发症的 雹 曩 圈:?蜘呻姗 主翘O ? S O 善t40 ^警黜瓣 g移:。。锄 ’T删姗 为 琵蕊fl冰确鼍姒矗孙1?啷旧 O ?嘲倒矗 O 2 4 6 8 10121416'8?筮M Time稍。一 图1―1 传统血糖检测与血糖波动 2 第一章绪论 天津大学博士学位论文 相对于常规的自我血糖监测，连续血糖检测 Continuousglucosemonitoring， CGM 的优点在于: 1(连续血糖监测可以使患者及时快速地掌握自身血糖值，进行病情控制和治疗; 2(连续血糖监测可以作为夜间低血糖的警报手段，并能在足够短的时间内唤醒 患者，防止出现低血糖事件; 3(连续血糖检测系统能够存储患者一天之内的血糖实际的波动情况，供医疗工 作人员分析使用，制定更完善的治疗方案; 4(连续血糖监测系统还可以和植入式胰岛素注射泵结合使用，当血糖浓度过高 时可自动注射胰岛素，那样将更加方便糖尿病患者的使用。 1(2(2连续血糖监测的方法 血糖检测方法按照对人体的创伤的程度，可以分为:有创伤检测、微创伤检 测和无创伤检测。 1( 有创检测 目前，家庭中使用的血糖检测主要通过小型血糖仪来实现。这种检测属于有 创检测。有创测量需要通过提取患者的血液进行测量，虽然随着产品的改进，所 目前已经达N 需取血的量越来越少 Y4pL左右的水平 ，但测量过程还是会给 糖尿病患者带来一定程度的痛苦，而且存在感染的风险。许多糖尿病患者不愿频 繁采血，而是选择一天两次采血，根据当时的血糖值来进行血糖调节，或者干脆 不采血，根据经验在固定的时间，如在餐后进行血糖调节。这些做法对于糖尿病 人来说都是极其危险的。有创检测方法不适合于连续血糖测量。 2( 无创检测 r]l―n11 血糖的无创伤检测一一是研究的热点，方法有很多，主要是使用光学、微 通过激光或微波等作用于人体组织，计算人体组织的吸收等来推波等方法， 测血 糖浓度。无创检测方法适合于连续血糖检测，但是无创测量中许多方法目前还处 于研究阶段。例如，无创光学血糖检测方法直接将光射向皮肤进行测量，检测信 号容易受到皮肤的复杂结构和人体个体差异性的影响，很难建立起一套有效而统 一的测量，并且需要一系列复杂的算法才能从杂乱无章的测量信息中，提取 微弱的血糖信号。虽然许多机构正在开展无创血糖检测方法的研究，但是距离成 熟产品面世还有一段距离。 3( 微创检测 由于有创检测方法不适合于连续血糖检测，而无创光学检测方法目前还有许 多关键问题有待突破。所以，近些年来，微创血糖浓度检测技术已经成为科技发 达国家研究开发的热点领域。微创血糖浓度检测技术首先采用微创伤的方法从人 天津大学博士学位论文 第一章绪论 体皮肤中无痛 或微痛 提取和葡萄糖浓度相关的体液，包括组织液，眼泪等， 然后使用传感技术测量这些液体中的葡萄糖含量，最后根据这些液体中葡萄糖浓 度与血液中葡萄糖浓度的相关性，进而推断出人体血液中葡萄糖的浓度。通过在 皮下植入微型传感器的方法也属于微创血糖浓度检测技术的研究范畴，但是这种 方式给人体带来的创伤往往更大一些。微创血糖检测已有成功的产品问世，例如， 的产品测量血糖手表一 GlucoWatch 用于组织液中葡萄糖的测Cygnus公司 量。 MineMed一公司的植入式血糖检测系统CGMS，通过植入人体内的传感器提供血 糖值读数。 开发连续血糖监测系统有重要意义。连续葡萄糖监测产品逐渐地由有创测量 过渡到微创测量，并以最终实现无创测量为目标，将为世界上数以千万计的糖尿 GlueoWatch@”和 病人的生活带来了革命性的变化。第一代的CGM，如“Cygnus ‘'MiniMed CGMS@”等连续血液和组织液葡萄糖浓度测量产品已经通过美国FDA 认证，开始被有保留地使用在糖尿病的治疗中。随着技术的进步，CGM将会成 为糖尿病日常监测中的新标准一，为更多的人造福。尤其是对于需要进行加强 胰岛素治疗的病人而言，在一天中，他们需要密集测量血液中的葡萄糖浓度以决 定胰岛素的用量，CGM显得更为重要。而对于无需进行频繁血糖监测的人群来 说，连续血糖监测仪也将成为一个进行潜在的糖尿病评估和诊断的重要工具。有 预测指出，在未来的五年内，市场上必将出现一种方便使用的葡萄糖实时测量产 品，并获得FDA的认证来取代现有的依靠指尖取血的产品 1(3微创血糖检测技术 相对于有创和无创血糖检测技术，微创血糖浓度检测技术在最大限度降低对 可以实现人体血糖浓度的动态、连续监测。微创血人体造成创伤的基础上， 糖检 测技术原理相对简单，具有可实现性更强、使用方便、测量速度快和无痛 或微 痛 等特点，能满足糖尿病人血糖浓度检测的临床需要，具有重要的应用价值和 商业前景。因此，国内外的许多科研机构都在积极开展微创血糖技术的研究。例 如，美国的UC Berkeleygl 学:‘J，Carnegie Institute State ofTechnology大学，MississippiUniversity大学‘。，荷兰的University ofGroningen‘。大学，日本北里大学和千叶大学，香港中文大学和香港城市大学， 和开发工作。近年来，国内的浙江大学开展了基于微透析的微创血糖检测技术研 中科院微电子中心开展了基于反向离子电渗和酶电极的微创血糖检测技究， 术研 究。目前，微创血糖检测有两个主要的方向。 1( 基于植入式血糖传感器 4 天津大学博士学位论文 第一章绪论 植入式的血糖传感器的研究十分活跃，不断有新产品问世， 如MiIliMed公司 Laboratories公司的Free 的CGMS系统和GuardianREAL(Time系统，AbboR Style 系统，Menarini公司的微透析系统等。植入式测量系统测量 精度较高，如Free Style 系统采用微创针技术，测量结果与传统方法的相关系数为0，956，CGMS系统将葡 萄糖传感器植入皮下进行组织液的采集测量，与传统方式相关系数为0(92。植入 式系统存在的问题是:?它们并非为糖尿病患者日常应用而设计，它需要训练有 素的专业医学人员将该微型葡萄糖传感器植入人体皮下;?在体内检测，信号响 应容易受到削弱;?同时，将传感器植入皮下的过程中对人体带来的创伤还是比 较大的。 鼍 2( 基于组织液透皮抽取检测 基于组织液透皮抽取检测方法主要是通过酶电极的方法来实现葡萄糖的测 量，将酶电极传感器贴附在经过微针或激光作用过的皮肤表面，利用酶电极上固 定的葡萄糖氧化酶与组织液中的葡萄糖反应产生的微电流来测量组织液中的葡 watch仪器，每20分钟经皮肤发送微电流 萄糖浓度。例如，Cygnus公司的Glucose 来获取皮肤中的组织液，依靠反向离子电渗法采样皮肤中的组织液，使用酶电极 来测定这些组织液中的葡萄糖水平。但是这类系统存在的问题是:?依靠反向离 子电渗法采样皮肤中的组织液，组织液的抽取量很小，皮肤通透性的不稳定性和 人体排汗很容易导致传感器读数不准确;?由于酶电极采用化 学原理进行测量， 检测的电流十分微弱;?在使用中有患者皮肤刺激性皮疹的报道。加州大学伯克 利分校采用MEMS和酶沉积技术，开发微针阵列，多晶硅透析膜葡萄糖传感器， 但是他们的系统的线性响应范围为O一160mg,dL，还不能满足糖尿病检测的需要。 1(4基于组织液分析的微创血糖检测技术 微创血糖检测许多都是针对组织液开展研究。组织液是充 满于组织及细胞之 间空间的液体，它是组织细胞直接所处的环境。组织、细胞通过细胞膜和组织液 发生物质交换。而组织液与血液之间则通过毛细血管壁进行物质交换。因此，组 织、细胞和血液之间的物质交换需通过组织液作为中介。组织 液中的葡萄糖含量 真实反映了人体各组织细胞所能获得的葡萄糖量，因此，研究组织液中的葡萄糖 浓度，比研究血液中的葡萄糖浓度更有现实意义。组织液中的葡萄糖浓度与血液 中的葡萄糖浓度是高度对应的，通常情况下，糖尿病人的血糖浓度大于7(8mmol,L， 此时组织液中的糖浓度为血液中的血糖浓度的90,左右。 本课题组将低频超声皮肤增透技术、真空负压组织液抽取技术和表面等离子 共振葡萄糖浓度测量技术有机结合，首次提出了一种全新的微创血糖浓度的动态、 连续、精确检测方法。检测的基本原理是首先采用低频超声对皮肤表层进行预处 天津大学博士学位论文 第一章绪论 理，通过超声的空化作用破坏皮肤角质层中的脂质双层结构，增大皮肤表层对人 体组织液的通透性，然后用真空负压的方法从皮肤表层中无痛、快速和大流量地 抽取出组织液，最后将抽取出的组织液通过微通道输送到表面等离子共振传感测 量系统，进行分析。 相对于以往微创血糖检测系统，论文采用系统的优点在于: 1(使用真空负压抽取组织液，相对于反向等离子电渗方法抽取，能够在更 长时间内保持皮肤通透型，吸取更大量的组织液。 2(表面等离子共振是对液体折射率的测量，对折射率的变化十分敏感，测 量的精度比酶电极测量精度高出许多。 量 3(使用表面等离子共振技术分析还能解决酶电极测量中存在的酶电极 保存 周期短，需要耗材的问题。 所以论文采用的低频超声皮肤增透技术、真空负压组织液抽取技术和表面等 离子共振葡萄糖浓度测量技术结合的测量方法，更加适合于组织液的测量。 1(5基于表面等离子共振的葡萄糖浓度检测技术 1(5(1表面等离子共振技术 _?? 对低浓度的葡萄糖溶液及组织液中的葡萄糖的测量是一项挑战。因为，首先， 组织液及其稀释液是一种混合液，其中含有电解质，蛋白质，葡萄糖等多种物质， 测量时需要排除其它物质的干扰，实现对葡萄糖的针对性的精确测量。另外由于 (组织液被提取时，组织液本身已经被稀释数十倍，所以组织液的中葡萄( 糖的含量 很低。因此组织液测量中就需要同时考虑到测量分辨率以及测量的特异性两个要 求。使用表面等离子共振技术测量能够满足这两项要求。 表面等离子共振是近十几年来迅速发展的基于折射率测量的检测技术。表面 等离子共振的原理可以归纳为:光在玻璃与金属薄膜交界面处发生全内反射时的 倏逝波，引发金属表面的自由电子产生表面等离子波(当入射角或波长为 某一适 当值时，表面等离子波与倏逝波的频率和波数相等，二者将发生共振，入射光被 吸收，使反射光能量急剧下降，在反射光谱上出现共振峰 即反射强度最低值 。 当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时，共振峰位置将不同。 表面等离子共振技术在各种检测领域扮演了重要的角色，越来越多的科学研 究都开始围绕着SPR来进行。表面等离子共振技术具有待测物无需纯化，样品无 需标记，测量精度高，能够实时监测反应的动态过程的优点。SPR传感器既可以 作为普通的折射率传感器来使用，同时也可以利用在SPR传感器表面绑定特殊的 受体,配体的方式，来测量与这种被绑定的配体有特异性吸附的配体,受 体。SPR 6 第一章绪论 天津大学博士学位论文 传感器通过将其中的一种分子固定在传感器表面，让其与一种待测分子相互作用， 通过检测传感器表面的折射率变化情况，判断分子间结合的情况。 1(5(2表面等离子共振测量葡萄糖浓度 国外的几个研究小组分别进行了使用SPR测量葡萄糖溶液的探索。如中国 科学院化学所使用SPR传感器系统地分析了其在测量单糖和低聚糖中的效果， 比较了包括葡萄糖、乳糖、山梨糖、甘露糖、核糖、树胶醛醣、麦芽糖等单糖和 低聚糖的测量效果，以及在各种糖溶液的浓度为0(1mol,L时，在入射角分别为 『1蚋 730和670时共振波长的变化情况，为直接测量葡萄糖提供了实验依据‘。。香港 中文大学以及香港城市大学的联合研究组，使用他们自己搭建的SPR系统测量 其理论分辨率已经能够达到6(23mg,dL，实验中他们比较测葡萄糖溶液， 量了从 30mg,dL到600mg,dL的葡萄糖溶液，得到了很好的折射率近似直线上升的测量 ?91 结果一，由于他们仪器的理论分辨率已经超过了糖尿病人的200mg,dL的诊断标 准，他们进而提出了是否能够将这项技术应用于对于糖尿病人的微创测量上。这 项研究是在人体血糖浓度的范围内进行的 30mg,dL--600mg,dL ，对今后的微 创血糖研究具有很好的指导意义。HelenV(Hsieh等人提出使用在金膜表面包裹 r201 GGBP一蛋白质的方法来增强SPR传感器对于葡萄糖溶液的测量效果，他们采用 了SPR测量中常用的三明治结构，将整个金膜表面的物质分为三层，第一层为 单分子层，是金膜与蛋白质固定的中间层，第二层为蛋白质层，蛋白质层选择性 的吸附葡萄糖分子。在Helen等人的研究中，他们比较了GGBP在不同位点进行 定点突变后，突变蛋白对于测量效果的影响，使用GGBP测量葡萄糖溶液的浓 其它研究小组也尝试了不同的方法来提高测量度使测量精度提高到分子级。 的精 度，如Fuji等人将葡萄糖氧化，通过测量葡萄糖的氧化物的浓度来间接得到葡 r211 萄糖溶液的浓度一。 参考其它小组的研究成果，论文搭建了基于SPR技术的葡萄糖溶液测量系统， 论文提出两种测量方案:第一种为直接测量，即对SPR传感开展实验研究。 器不 作处理，直接测量葡萄糖溶液和组织液。第二种方法，利用GGBP蛋白质与葡萄 糖的特异性吸附的特点，在SPR传感器上绑定蛋白，称为间接测量。 7 天津大学博士学位论文 第一章绪论 1(6论文完成的主要工作 本课题的目标是研究并开发一种全新的基于组织液测量的微创血糖检测技 术及仪器。微创血糖检测技术以组织液中的葡萄糖为研究对象，研究了应用表面 等离子共振技术测量组织液中的葡萄糖，将表面等离子共振技术和生物分子作用 分析技术相结合，研究了对于葡萄糖有特异性吸收的GGBP蛋白质在微创血糖表 利用改造后的表面等离子共振检测系统开面等离子共振检测系统中的应用， 展了 葡萄糖溶液和组织液的测量分析。实验表明，论文开发实验系统能够成功应用于 葡萄糖浓度及组织液中葡萄糖的测量。 主要的研究工作包括: 1(研究了表面等离子共振理论。从电磁理论出发，推导了平面电磁波方程、 分析了表面等离子体和表面等离子波的产生，分析了表面等离子波在金属内部及 金属表面的传播。分析了全反射中倏逝波的产生，以及倏逝波激发表面等离子波 产生表面等离子共振的条件。比较分析了各种类型表面等离子共振系统的调制方 式，在论文系统中选用了固定光源的角度调制方式。分析了各种类型的表面等离 子共振系统的结构形式，在论文的系统中选用了Kretschmann棱镜型结构。通过 对表面等离子共振结构模型进行理论分析和计算，研究影响了表面等离子共振光 谱的因素，确定了Kretschmann棱镜型系统结构参数。 2(研究了生物分子作用原理在表面等离子共振传感器中的应用。研究了对 于葡萄糖有特异性吸附能力的D(半乳糖绑定蛋白在表面等离子共振葡萄糖检测 中应用，研究了经过不同突变位点改造后的D(半乳糖绑定蛋白对葡萄糖的 吸附 特性。GGBP蛋白质在E149位点定点突变，提高了其与葡萄糖特异性结合能力。 对GGBP蛋白质引入了两点突变 E149C，A213S 和三点突变蛋白 E149C， A213S，L238S ，为蛋白质分子提供一定的极性，从而降低了它吸附葡萄糖的 研究了将蛋白质固定在金膜表面的方法，使用胺耦合的方法实现蛋白能力。 质的 绑定。研究了蛋白质与传感器金膜表面结合的模型，和蛋白质的活性及保护方法。 3(构建了一套自动化的表面等离子共振葡萄糖浓度检测系统。设计开发了 SPR检测实验系统，包括数据采集电路、泵阀液体传输控制系统以及相应的检测 和控制软件，使仪器能够根据需要选择样品，根据需要设定被测液体流速，完成 自动检测过程。 4(开展了表面等离子共振信号处理方法的研究。根据表面等离子共振检测 葡萄糖系统的信号和噪声的特点，研究了不同的算法在表面等离子共振数据分析 采用加权质心法精确地捕获到了表面等离子共振曲线的最和处理中的应用。 低点， 采用固定计算点数的动态基线法调整基线位置，消除了基线附近点值的波动对测 第一章绪论 天津大学博士学位论文 量结果的影响，用改进后的算法对人体组织液中的葡萄糖浓度进行测量，提高了 表面等离子共振的检测分辨率。 5(分别使用未经过GGBP处理的SPR传感器和经过GGBP处理后的SPR 传感器进行了葡萄糖溶液和组织液的测量。试验了使用直接测量的方法时，SPR 传感器测量的下限，测量了不同浓度葡萄糖溶液及组织液的响应，建立了测量模 型。试验了使用间接测量的方法时，SPR传感器测量的下限，比较了绑定不同 GGBP蛋白质的SPR系统的测量范围，对比直接测量法和间接测量法所得到的 葡萄糖溶液以及组织液的测量结果。 6(分析了实验中的各种影响因素。流速、传质效应、温度、蛋白质活性等 因素对测量结果都会造成影响，分析了这些因素的影响并提出改进方法，优化 SPR实验条件，构建SPR检测血糖浓度的数学模型。 9 表面等离子体共振是一种物理光学现象，由入射光波和金属导体表面的 自由 电子相互作用而产生。入射光线从光密介质照射到光疏介质，当在入射角大于某 个特定的角度 临界角 时，会发生全反射现象。如果在两种介质界面之间存在厚 那么全反射时产生的倏逝波 EvanescentWave 的P度几十纳米的金属薄膜， 偏振 分量将会进入金属薄膜，与金属薄膜中的自由电子相互作用，激发出沿金属薄膜 Plasmon 表面传播的表面等离子体波 Surface wave，SPW 。当入射光的角度或波 长到某一特定值时，入射光的大部分会转换成SPW的能量，从而使全反射的反射 。一?? 光的能量突然下降，在反射谱上出现共振吸收峰，此时入射光的角度或波长，称 为SPR的共振角或共振波长。SPR的共振角或共振波长与金属薄膜表面的性质密 切相关，如果在金属薄膜表面附着被测物质 一般为溶液或者生物分子 ，会引起 从而引起SPR光学信号发生改变。根据这个信金属薄膜表面折射率的变化， 号， ’