补肾活血方对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中hgfmrna表达变化的影响

补肾活血方对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中hgfmrna表达变化的影响 中华中医药学会中医方证基础研究与临床应用学术研讨会论文集 补肾活血方对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中 ,,,,,,,表达变化的影响 张俊, 周明剑, (,河南中医学院郑州,,,,,平顶山市飞行化工集团公司职工医院,,,,,,) ,, ，摘要,目,々:建立肾间质纤维化大鼠模型，动态现察模型大鼠肾功能、肾组织中,,,,,,,的表达变化及补肾 活血方对其影响，探讨补肾活血方治疗慢性瞥功能衰竭的可能作用机制(方法:将大鼠随机分为假手术组、模型组、 洛汀新组、补肾活血方高剂量组(补肾活血方低剂量组。除假手术组外其余大鼠采用单侧输尿管梗阻的方法建立肾 问质纤维化大鼠模型;分别于,,,术后,(,、,,、,,(,,天现察造模大鼠血肌酐。尿素氮的动态变化;采用,,,,,, 法，观察遣模大鼠肾组织中肝细胞生长因子(,,,),,,,的表达变化及补肾活血方对其影响(结果:与假手术组 比较，造模大鼠血清肌酐，尿素氮浓度呈进行性增高。,,,(,,或,,,(,,;,,,,,,,表达于,,,术后第,天开始 增加，于第,,天达高峰，,,,(,,或,,,(,,。随后随时同延长表达逐渐渐弱(与模型组比较。各给药组大鼠肾功能改 善，,,,(,,或,,,(,,;各时问点,,, ,,,,的表达呈不同程度增加，,,,(,,或,,,(,,(结论:补肾活血方可以改 善肾间质纤维化大鼠瞥功能;可以提高肾组织中,,, ,,,,的表达。防治肾问质纤维化( ，关犍词,朴肾活血方:肾同质纤维化;单侧输尿管梗阻大鼠;肝细胞生长因子 肾纤维化是肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同病理表现，包括肾小球硬化和肾小管间质的纤 ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,， 维化。近年来，大量临床和实验研究表明，在各种肾脏疾病中，肾间质纤维化(,,,,, ,，,)程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标【?(在此过程中，细胞因子可分为促 纤维化因子和抗纤维化因子，,,,则是目前公认的最重要的抗纤维化因子，它可通过多种方式抑制 肾纤维化的发展，为观察单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中,,,,,,,表达变化及补肾活血方对其影响， 故开展本实验。 ,实验材料 ,(,实验动物 清洁级雄性,,大鼠,,,只，体重,,,,,,,克，购于河南省实验动物中心，许可证号:,, ,, (豫),,,,—,,,,，普通饲料饲养于河南中医学院动物实验中心，自由饮水。 ,(,实验朋药 补肾活血方(颗粒剂)(黄芪,,,、菟丝子,,,、制大黄,,,、丹参,,,、莪术,,,): 江苏江阴天江药业有限公司生产，购于河南中医学院第一附属医院药房，批号:,,,,,,,。使用时按比例以 蒸馏水溶解、稀释，高、低剂量组浓度分别为,(,,,,,和,(,,,,,( 洛汀新(盐酸贝那普利)片:北京诺华制药有限公司生产，批号:,,,,,(使用时以蒸馏水溶 解、稀释为,(,,,,,,,。 ,(,主要试剂 血肌酐、尿素氮试剂盒:南京建成生物研究所。,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,公司。通用 ,,,,,, 试剂盒:北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。焦碳酸二乙酯(,,,;):,,,髑;,公司。乙二 胺四乙酸(,,,,):上海润丰化工有限公司。,,,,:北京鼎国生物技术发展中心。,,,,,,,,, ,，，: 北京博大泰克生物基因技术有限责任公司(溴酚蓝:上海浦东化学品有限公司。琼脂糖:西班牙生 ?,,,? 中华中医药学会中医方证基础研究与临床应用学术研讨会论文集 产，购自真科生物有限公司。,,,,,,,, ,,,,,,:北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。,,, , 引物:参照,,,,,,,,基因序列，由赛百盛公司合成: ,,,(产物,,,,,) ,,,,, ,’,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,’ ,,,,,,,,,’,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,’ , ,,,;,,,(产物,,,,,) ,,,,, ,’,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,’(,’ ,’(, , , ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,’ ,,,,,,,,, ,实验方法 ,(,分组与造模 取大鼠,,,只，适应性饲养,周后，按体重随机分为,组，分别为假手术组、模型组、洛汀新 治疗组、补肾活血方高剂量组、补肾活血方低剂量组，每组,,只(各组大鼠予,,,水合氯醛 (,(,,,,,,,)腹腔注射麻醉后，选择左侧背部肋下约,(,,,,处为切口，备皮、铺消毒洞巾，然后纵 向逐层切开皮肤、肌层至腹腔，游离左侧肾脏及输尿管，将左侧输尿管用组织钳分离后托起近肾盂 段，在两端用,,丝线两次结扎后，从中间剪断输尿管(逐层缝合，即制备，,,,模型。假手术组手 术入路方式同,,,模型，进腹腔后分离左侧输尿管但不结扎( ,(,给药剂量 各组大鼠均在造模后次日开始灌胃，每天一次，洛汀新组灌服洛汀新混悬液～(,,,,,,,,，补肾 活血方高剂量组和低剂量组分别灌服补肾活血方,,,,,,,,和,,,,,,,，灌胃体积均为,,,,,,,,,,，假 手术组和模型组灌服同体积生理盐水，各组动物自由饮水。 ,(,标本留取 分别于术后第,、,、,,、,,、,,天，各组大鼠随机取,只，腹腔注射,,,水合氯醛(,(,,,,,,,,) 麻醉，腹主动脉取血，分离血清，(,,:,冰箱保存备用;然后摘取左侧肾脏，迅速称重后置于液氮中， 转入(,,?冰箱保存备用。 ,(,检测指标 血清肌酐浓度:苦味酸法:血清尿素氮浓度:二乙酰(肟法:肾组织中,,, ,,,,表达 一,(,,,法:取所提取总,,,,,,(加入去除,,,酶的,(,,,离心管中，加入溶液,(,,,,,(,,),,) ,山，离心,,秒后。放入,,:,水浴,分钟，立即冰浴,分钟，然后按序依次加入溶液,(,,,,,),,,( 溶液,(,,?,)，,,，溶液,(,,,,,,缓冲液),,,。溶液,(，,,,,:,),,,，溶液,(,,,,,,) ,(,,,，再加入溶液,(,,,,,)补足,,,,(轻轻混匀，离心,,秒，,,,水浴,小时，,,:,水浴,分 钟。取,山进行,,,(依次加入溶液,(,,,,,),,,，溶液,(,,？酶),(,,,，溶液，(，,,,,, ,,,,,,) ,,,，溶液,(,,,,,),,,，上游引物,,,，下游引物,,,,，加溶液,(,,,,,)补足,,,,，混匀后离 心,,秒置于,,,仪中进行扩增。扩增条件:,,?预变性,,,,，,个循环(,,?变性,,,，,,?退火 ,,,，,,:,延伸,,,,，共,,个循环;,,:,延伸,,,,(分别取,,,产物,,，，，内参，,,,,,,,扩增产物,，，,， 行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将凝胶放入全自动凝胶成像分析系统采图，并进行电泳条带光密 度(灰度)分析，各组,,,,表达水平以相对表达量即目的基因,,,,;,,,的灰度比值来计算( ,统计学处理 ?,,,? 中华中医药学会中医方证皋础研究与临床应用学术研讨会论文集 ( 采用,,,, ,,(,软件进行数据统计，以均数,,标准差表示，组间比较采刚,,,(,,,,,,, ,分析， 统计显著性水平为,,,(,,。 ,结果 ,(,一般情况 假手术组大鼠体重增长明显，精神状况良好(饮食正常，动作自如，反应灵敏，皮毛柔顺有光 泽;模型组大鼠术后,,天开始逐渐出现饮食减少，体重减轻，体毛干枯、脱落、欠光泽，精神萎靡， 活动减少，对外界刺激反应减弱;各给药组大鼠诸情况相对模型组为轻。 ,(,补肾活血方对,,,大鼠肾功能的影响 假手术组大鼠在整个实验过程中血尿素氮、肌酐浓度维持正常水平，没有升高。与假手术组相 比，模型组大鼠于,,,术后第,天即开始出现血尿素氮、肌酐浓度增高，,,,(,,:随时间延长，二 者浓度逐渐增高，,,,(,,或,,,(们。 予以相应药物治疗后，与假手术组相比，各给药组大鼠血尿素氮、肌酐浓度虽仍高于正常水平， 但与模型组相比，已有不同程度的降低，,,,(,,或,,,(,,，且随着时间延长，二者浓度呈下降趋势， 至第,,天，各给药组动物血尿素氮、肌酐浓度均明显降低，,,,(,,或,,,(,,;血尿素氮、肌酐浓 度以补肾活血方高剂量组和洛汀新组降低较为明显，,,,(,,;补肾活血方高、低剂量组存在差异性， ,,,(,,或,,,(,,((见表,、表,) 表,不同组大鼠各时间点血清尿素氮浓度(,,,,,,,,)变化的比较(,:,(,，,,,) ,,:与假手术组相比(‘尺,(,,，‘尺,(,,;与模型组相比。?尺,(,,，。尺,(,,;与高荆量组相比，尺,(,,，,尺,(,,( 表,不同组大鼠各时间点血清肌酐浓度,,,,,,,)变化的比较(,:,(,，,;,) ,,:与假手术组相比(‘尺,(,,。‘尺,(,,;与模型组相比。‘尺,(,,，‘只,(,,;与高荆量组相比。尺,(,,，,尺,(,,( ,(,补肾活血方对删,大鼠肾组织中，,,,咄,,表达变化的影响 ?,,,? 中华中医药学会中医方证基础研究与临床应用学术研讨会论文集 假手术组大鼠肾组织,,, ,,,,仅有少量表达，与假手术组比较，造模后大鼠肾组织中,,, ,,,,表达量于,,,术后第,天即开始增加，,,,(,,或,,,(,,，于第,,天表达量展多， 随后随时间延长(表达逐渐渐弱。 予以相应药物治疗后，与模型组比较，各给药组大鼠各时问点,,, ,,,,的表达量均有不同程 度的升高，,,,(,,或,,,(,,，其中，洛汀新组和补肾活血方高剂量组表达升高明显，二者无统计学 差异，,,,(,,。(见表,) 表,各组大鼠肾组织中,,,,,,,的表达变化(,士,，,,,) 注:与假手术组相比(?,,,(,,，,,,,(,,,与模型组相比，(,,如(,，(青,?(,,，与洛汀新组相比，,,锄(,，( ,讨论 单侧输尿管梗阻后尿液逆流向上(致肾盂内压力增高，肾小管压力增高(小管功能障碍(肾小 球滤过功能相应下降，或血管受压以及体内一些缩血管物质的释放，致肾血流量减少，肾小球滤过 率下降，肾功能受损。晚期肾间质为大量纤维组织填充，压迫肾小球和肾小管，使小球毛细血管襻 和小管问毛细血管受压、狭窄，血管阻力增加，肾小球血流量减少、滤过率下降，导致肾功能受损， 血肌酐、尿素氮升高。 本实验结果表明，模型组大鼠从术后第,天即开始出现血肌酐、尿素氮的升高，随时问延长， 二者水平增高更加明显，验证了肾间质纤维化导致肾功能逐渐衰竭这一病理发展过程。补肾活血方 能够降低血肌酐、尿素氮水平而改善肾功能，延缓纤维化的进展。其中，补肾活血方高、低剂量组 对肾功能的改善均较明显，但以高剂量补肾活血方的作用更为显著，这些均提示同一药物的不同剂 量对相同的指标有着不同的作用，尚待进一步深入研究。 ,,,是一种生物学活性极为广泛的细胞因子，主要由间质细胞分泌产生，通过内分泌、自分泌 或旁分泌的形式作用于数种上皮源性细胞(如肝细胞、上皮细胞、内皮细胞等)，与细胞膜上的特 异性受体;,,,,结合发挥生物学效应，促进细胞的生长、迁移和形态发生，对多种组织器官的生长发 育有重要的生理调节功斛,,。,,,在体内多个组织器官广泛表达，其中肾脏是,,,高丰度表达的脏 器之一，在肾脏，,,,仅由间充质来源的细胞生成，包括肾小球系膜细胞、内皮细胞、间质成纤维 细胞和巨噬细胞【,,:;,,,,受体的表达则更普遍、更广泛，不仅在肾小球的足细胞、系膜细胞、内皮 细胞有不同程度;(,;,表达，肾小管细胞也有大量;(,,,受体表达，甚至在特定情况下，,,,刺激也可 使肾间质成纤维细胞表达低水平的;(,,,,,,(作为一种多效性因子，,,,在肾脏的生理病理过程中同 样表现出了广泛的生物学活性，如在肾脏的形成和发育过程中，,,,具有促肾脏上皮细胞、内皮细 胞有丝分裂的作用，能够促进肾小管分支的形成，介导间质细胞向上皮细胞转化:在各种急性肾损 ?,,,?