鸡胚尿囊模型

1.鸡的胚胎发育 第一天，在入孵的最初24h，即出现若干胚胎发育过程。4h心脏和血管开始发育；12h心脏开始跳动，胚胎血管和卵黄囊血管连接，从而开始了血液循环；16h体节形成，有了胚胎的初步特征，体节是脊髓两侧形成的众多的块状结构，以后产生骨骼和肌肉；18h消化道开始形成；20h脊柱开始形成；21h神经系统开始形成；22h头开始形成；24h眼开始形成。中胚层进入暗区，在胚盘的边缘出现许多红点，称“血岛” 第二天，25h耳开始形成、卵黄囊、羊膜、绒毛膜开始形成，胚胎头部开始从胚盘分离出来，照蛋时可见卵黄囊血管区形似樱桃，俗称“樱桃珠”。 第三天，60h鼻开始发育；62h腿开始发育；64h翅开始形成，胚胎开始转向成为左侧下卧，循环系统迅速增长。照蛋时可见胚和延伸的卵黄囊血管形似蚊子，俗称“蚊虫珠”第四天，舌开始形成，机体的器官都已出现，卵黄囊血管包围蛋黄达1/3，胚胎和蛋黄分离。由于中脑迅速增长，胚胎头部明显增大，胚体更为弯曲。胚胎与卵黄囊血管形似蜘蛛，俗称"小蜘蛛"。 第五天，生殖器官开始分化，出现了两性的区别，心脏完全形成，面部和鼻部也开始有了雏形。眼的黑色素大量沉积，照蛋时可明显看到黑色的眼点，俗称“单珠”或“黑眼”。 第六天，尿囊达到蛋壳膜内表面，卵黄囊分布在蛋黄表面的1/2以上，由于羊膜壁上的平滑肌的收缩，胚胎有规律的运动。蛋黄由于蛋白水分的渗入而达到最大的重量，由原来的约占蛋重的30%增至65%。喙和“卵齿”开始形成，躯干部增长，翅和脚已可区分。照蛋时可见头部和增大的躯干部两个小圆点，俗称“双珠”。 第七天，胚胎出现鸟类特征，颈伸长，翼和喙明显，肉眼可分辨机体的各个器官，胚胎自身有体温，照蛋时胚胎在羊水中不容易看清，俗称“沉”。 第八天，羽毛按一定羽区开始发生，上下喙可以明显分出，右侧蛋巢开始退化，四肢完全形成，腹腔愈合。照蛋时胚在羊水中浮游，俗称“浮”。 第九天，喙开始角质化，软骨开始硬化，喙伸长并弯曲，鼻孔明显，眼睑已达虹膜，翼和后肢已具有鸟类特征。胚胎全身被覆羽乳头，解剖胚胎时，心、肝、胃、食道、肠和肾均已发育良好，肾上方的性腺已可明显区分出雌雄。 第十天，腿部鳞片和趾开始形成，尿囊在蛋的锐端合拢。照蛋时，除气室外外整个蛋布满血管，俗称“合拢”。 第十一天，背部出现绒毛，冠出现锯齿状，尿囊液达最大量。 第十二天，身躯覆盖绒羽，肾、肠开始有功能，开始用喙吞食蛋白，蛋白大部分已被吸收到羊膜腔中，从原来占蛋重的60%减少至19%左右。 第十三天，身体和头部大部分覆盖绒毛，胫出现鳞片，照蛋时，蛋小头发亮部分随胚龄增加而减少。 第十四天，胚胎发生转动而同蛋的长轴平行，其头部通常朝向蛋的大头。 第十五天，翅已完全形成，体内的大部分器官大体上都已形成。 第十六天，冠和肉髯明显，蛋白几乎全被吸收到羊膜腔中。 第十七天，肺血管形成，但尚无血液循环，亦未开始肺呼吸。羊水和尿囊也开始减少，躯干增大，脚、翅、胫变大，眼、头日益显小，两腿紧抱头部，蛋白全部进入羊膜腔。照蛋时蛋小头看不到发亮的部分，俗称“封门” 第十八天，羊水、尿囊液明显减少，头弯曲在右翼下，眼开始睁开，胚胎转身，喙朝向气室，照蛋时气室倾斜。 第十九天，卵黄囊收缩，连同蛋黄一起缩入腹腔内，喙进气室，开始肺呼吸。 第二十天，卵黄囊已完全吸收到体腔，胚胎占据了除气室之外的全部空间，脐部开始封闭，尿囊血管退化。雏鸡开始大批啄壳，啄壳时上喙尖端的破壳齿在近气室处凿一圆的裂孔，然后沿着蛋的横径逆时针 敲打至周长2/3的裂缝，此时雏鸡用头颈顶，两脚用力蹬挣，20.5天大量出雏。颈部的破壳肌在孵出后8天萎缩，破壳齿也自行脱落。 第二十一天，雏鸡破壳而出，绒毛干燥蓬松。 2.灯照观察受精蛋存活情况（图示） 3.鸡胚的结构图 鸡胚最外面的是蛋壳，紧贴蛋壳的白色膜为蛋壳膜（鸡胚分大小头，一般正常孵化的鸡胚的气室在大头），沿气室边沿敲开气室顶端的蛋壳，可以看见白色的蛋壳膜，用眼科镊和眼科剪剪掉白色的蛋壳膜后，可见紧贴蛋壳膜的一层半透明、上面有血管分布的那层膜就是你说的绒毛膜，也叫绒毛尿囊膜。 4.CAM 实验 4.1 Ø  材料准备： l  材料：孵化箱、检卵灯、高压消毒锅、小钢锯、小剪刀、小镊子（眼科用）、针头、微量加样器、种鸡蛋、数码相机、切片机、显微镜等 l  试剂：酒精棉球、碘酒、新洁尔灭、明胶海绵、甲基纤维素、bFGF、甲醛、石蜡、甲苯胺蓝等 Ø  实验操作： 鸡胚准备： 新鲜来航种鸡蛋80只，于（37.5 0C～38.5 0C）、相对湿度为60％～80％的孵化箱中孵化、每日照蛋两次，第三天无血管鸡胚抛弃。 开 窗 ： 鸡胚发育3天，选取发育良好的鸡胚，无菌条件下操作在外壳上开10mm×10mm大小的开口，暴露尿囊膜具体操作如下： l  取鸡胚，于检卵灯下标记气室及胎位，并在胎位附近无大血管处画一记号。 l  用碘酒，乙醇消毒气室顶部和记号处，然后在气室顶部钻一小孔，同时用小钢锯在记号处将卵壳磨一个和纵轴平行的裂痕，勿伤及壳膜。 l  将卵平放，轻轻将裂痕处卵壳去掉，勿伤及壳膜，于壳膜上刺破一小缝但不伤及下面的绒毛尿囊膜，滴加无菌生理盐水一滴于壳膜上。 l  用橡皮乳头从气室端小孔处缓缓将气室内空气吸去，造成气室负压，此时可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜下陷，壳膜与尿囊膜之间形成人工气室。 l  用无菌透明胶带将封好假气室封好，继续孵化3d。 植入明胶：开窗后第3 d将无菌明胶海绵（4mm×4mm×5mm）为载体小心放置于矩形窗口的边缘1/3处，远离已形成的致密血管网。用微量加样器加样，设立一定梯度的测试药物浓度， 同时设立相应的阳性、阴性、空白对照（阳性对照组载体中加入100ng bFGF和4μg PBS； 阴性对照组加入8μL PBS； 实验组加bFGF的同时加不同剂量的待检药物），加样后用无菌透明胶带封闭窗口，继续孵化3 d，每12h 观察一次。 结果处理：第10 d用Leica图像分析系统观察、拍摄实验区域（以药物—明胶海绵片为中心范围约1cm2），明确可辨的血管，测定、计算其面积。进行统计学分析。 鸡胚处理：鸡胚发育12d后，将载体及其周围的尿囊膜剥离，平铺于洁净的玻璃板上，显微镜下计数长入载体边缘的血管，然后将载体与尿囊膜分离，甲醛固定。 MVD检测：取固后的明胶海绵载体，乙醇脱水，石蜡包埋，沿平行与CAM方向，连续切片，厚度8μm。0.5％甲苯胺蓝染色。取标本于250×视野下计数微血管的横截面，分别随机6个不重复的高倍视野，取其平均值作为该标本的单位面积下的MVD（微血管密度）。采用SPSS10.0 统计软件，对CAM的MVD用方差分析和秩和检验。 4.2鸡胚绒毛尿囊膜模型 孵蛋第d,用尖针在蛋气室表面扎1小洞, 使鸡胚的尿囊绒毛膜与鸡蛋的内壳膜分开,便于后续操作。照蛋灯下寻找胚头,划定开窗位置,消毒蛋壳表面,在蛋壳表面划刻出凹痕,轻揭凹陷处蛋皮,轻轻撕掉内壳膜,此时该处CAM下陷,形成假气室(区别于自身的气室)。用透明胶带纸封贴假气室，制备假气室时切勿损伤CAM，否则剔除。 选择纤维素滤膜为载体,用打孔器制成直径5ｍｍ的小圆片,蒸馏水浸泡后灭菌干燥备用。轻轻撕掉透明胶带纸,将载体置于正对观察窗的ＣＡＭ表面的血管,然后将药物分别滴加于载体上,加用透明胶带纸封贴,继续孵育。 将（中速定性滤纸）载体加到鸡胚（大头端）下方CAM的两根大血管之间,窗口下方一层透明的并有丰富血管的是鸡胚绒毛膜和小部分尿囊膜,我不否认以上方法可能可以做出结果.鸡胚绒毛尿囊膜准确是可参看北大出的动物胚胎发育学(记不大清了): 取鸡胚，于检卵灯下标记气室及胎位，确定拟加药位置,消毒气室顶部，然后在气室顶部钻一小孔。将卵平放，轻轻将拟加药位置处卵壳去掉，勿伤及壳膜，于壳膜上刺破一小缝但不伤及下面的绒毛尿囊膜，滴加无菌生理盐水一滴于壳膜上。用橡皮乳头从气室端小孔处缓缓将气室内空气吸去，造成气室负压，此时可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜下陷，壳膜与尿囊膜之间形成人工气室。用透明胶带将封好假气室封好，继续孵化。 4.3 鸡胚绒毛尿囊膜血管形成(CAM)试验方法:(1)．鸡胚准备和接种组织：选择北京白鸡种蛋，洗净，用l：1000苯扎溴铵(新洁尔灭)液浸泡3分钟，置37．8土0．5℃培养箱中孵育。鸡胚发育第7天，蛋壳消毒后，标记制作2cmX3cm左右观察窗。接种组织视研究目的而定，一定要在接种当日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1～2mm组织小块。 (2)组织接种：在制备鸡胚观察窗的次日，即鸡胚发育第8天进行组织接种。每个鸡胚可接种5—7个组织小块于接种部位CAM表面，再用透明胶纸封好，继续孵育。 (3)接种组织的收获与观察：组织接种后每12小时观察一次，到组织接种第11天(鸡胚发育第18天)收获接种组织，取出鸡胚，置接种组织连同周围的CAM于解剖显微镜下观察，并用10％甲醛固定保存，部分组织可作石蜡切片，用作血管生成研究的免疫组化染色等。 (4)CAM的血管生成表现：组织接种24小时后，CAM血管开始向接种组织生长，随培养时间的延长，血管数目及直径均明显增加；第2天，新细小血管直接趋向组织；第3天，新生血管形成以接种组织为中心，10～20条放射状血管网；尔后，CAM血管继续明显增加。非接种部位与接种部位比较，CAM血管数目少，大血管与小血管呈脉样均匀分布；而接种部位的CAM血管在接种组织周围弥散样增加，以组织为中心向周围呈放射状分布，在首先与组织发生联系的区域CAM血管更多。第4天，可见新生细小CAM血管生长形成中、粗血管，并在中、粗血管继续分支出细小血管，形成新的血管网。CAM血管管腔结构清晰，可区别动、静脉。 (5)CAM血管生成实验模型的用途：CAM血管生成模型用于血管生成的研究，可取得两方面结果：①检测评价接种物刺激CAM血管增生的血管生成作用，用于分析研究血管生成促进因子、抑制因子的活性和作用的检测，如肿瘤血管生成的研究等；②对接种物，如肿瘤组织、自身的血管生成进行研究，用于分析不同组织的血管生成活性和作用，如肿瘤组织有引发新生血管生成的作用，但肺癌与其他癌组织的血管生成活性和作用可能不同。 尽管血管生成的体内动物模型研究更为接近人体的生理状态，使研究结果更为可靠，但仍有一些不足之处，如操作繁琐，耗时过长；另外，在该类模型中，血管生成物必须植入眼角膜囊、颊囊、或绒毛尿膜囊使之诱导血管生成，难免产生人为因素诱导的血管生成；血管生成促进因子、抑制因子等需要从多聚载体中释放出来；操作方法和测定其结果的技术较为复杂. 补充点：鸡胚卵用o．1％新洁尔灭消毒，在37．6℃(上下浮动 o．2℃），60％湿度的隔水式恒温孵箱内孵育c每日翻动2次，孵育第7天时(满24h为1天)，在绒毛尿囊膜体表投影距胚头1cm处上划定开窗位置。无菌条件下，磨切暴露绒毛尿囊膜，制出假气室。透明胶带封闭窗口。鸡胚开窗后24h，甲基纤维素盘放人假气室(避开大血管)，对照组盘中加入 20微升灭菌PBS，实验组盘中各加入待测物20微升，透明胶带封闭假气室，继续孵育。每日加样一次，第十二天取材。假气室注入丙酮甲醇混合液固定20分钟后，取假气室一侧的蛋壳后固定20分钟，剥离CAM膜．铺在滤纸上，阴干保存。 总的说来，这个方法有很多不如意的地方， 我觉得如果仅仅是为了测定新生血管生成的实验， 完全可以做免疫组化， 如CD 34， F8 因子， 等等， 效果确定 。 4.4我做过，实际上很简单，实验方法包括：将测试药物先溶于1000ml∙L-1甲醇，再用无血清RPMI-1640稀释至终浓度10~150mmol∙L-1，如果检测物是细胞，则直接用RPMI-1640稀释至一定浓度。不同浓度的测试药物或细胞20mL与5g∙L-1甲基纤维素制成直径约2mm的药物--甲基纤维素薄片。设立相应的阳性、阴性、空白对照。受精鸡卵在370C，55%的相对空气湿度下孵育3 d，每1 h翻动一次，第3 d以700mL∙L-1 酒精清洗卵壳，超净台中吹干后用无菌眼科镊子和小钢锯在鸡蛋的平钝端小心开出一直径约2.0cm的矩形小窗，移去蛋壳和其内面的壳膜，小心用无菌石蜡膜覆盖以防干燥，鸡卵窗口朝上在370C、55%相对空气湿度和3%CO2的条件下继续孵育，但不再翻动。 开窗后第3 d将药物--甲基纤维素薄片小心放置于矩形窗口的边缘1/3处，远离已形成的致密血管网。设立一定梯度的测试药物浓度， 同时设立相应的阳性、阴性、空白对照。盖上石蜡膜后继续孵育3 d。 第10 d用Leica图像分析系统观察、拍摄实验区域（以药物--甲基纤维素薄片为中心范围约1cm2），明确可辨的血管，测定、计算其面积。进行统计学分析。 处理因子可用明胶海绵，也可用甲基纤维素 5.封窗后,为什么透明胶会有水珠,3天后撕开透明胶,发现加样的滤纸发生漂移.? 有文献说透明胶带是为了便与观察,但是,谁能透过透明胶带看见东西?不过是和外界隔开,更符合生理状态吧了.透明胶带不透气,和蛋壳不同,扰乱了生理状态,不能呼吸,当然会有水珠,换个透气胶布就行了. 加样的滤纸发生漂移:鸡胚绒毛尿囊膜包括鸡胚绒毛膜,鸡胚尿囊膜两部分,是在发育过程中,不断动态变化,但有个相对稳定时期,要看你的目的了.你可参看北大出的动物胚胎发育学(记不大清了),有个图示,一看就清楚了.加对了地方,漂移会很少的.这当然和你划定的开窗位置有关,也就是你的目的有关.先把这弄清楚,就不会有以上问题了. 其实很多文献做的是鸡胚绒毛膜,不是鸡胚绒毛尿囊膜,也是没有把概念弄清楚.照搬Auerbach R,Kubal L etal.As imple procedure for the long term cultivation of chicken embryos.Dev Biol, 1974;11∶391等,还有军事医科院的文献而已 6.0 用透气胶布，开窗后会感染吗？ 气胶布可以灭菌的.更重要的是,鸡胚发育中,免疫尚未建立,一般不会有严重的感染炎症反应,真要有的话,可以剔除,所以要检查.水珠不会影响血管的生长,不管他也可,但可能与滤纸移位有一定关系.当然,滤纸移位主要原因是鸡胚绒毛尿囊膜的生长. 总之,大碗牛人做的实验过程也可能很多问题没弄清,这不一定妨碍他作出结果,但我等做之前一定要多查文献,多问为什么,很多问题就迎刃而解了. 7.0先将滤纸加于CAM再将药加于滤纸上，或将加好药的滤纸放入CAM，两者有区别吗? 鸡虽然胚发育中,免疫尚未建立,放入滤纸也是个刺激,开窗后立即封窗，第二或第三天将透明胶打开，使之有个适应的过程,再加药,在不影响实验的情况下,似乎更好,但加大了损伤的机会,可自己权衡.先将滤纸加于CAM再将药加于滤纸上，有利于避免漂移,加好药的滤纸放入CAM,则有些湿滑. 8.0改进的鸡胚模型 9.0 1。取10－13日龄鸡胚，于检卵灯下标记气室及胎位，并在胎位附近无大血管处画一记号。 2。用碘酒，乙醇消毒气室顶部和记号处，然后在气室顶部钻一小孔，同时用磨卵器在记号处将卵壳磨一个和纵轴平行的裂痕，勿伤及壳膜。 3．将卵平放，轻轻将裂痕处卵壳去掉，勿伤及壳膜，于壳膜上刺破一小缝但不伤及下面的绒毛尿囊膜，滴加无菌生理盐水一滴于壳膜上。 4．用橡皮乳头从气室端小孔处缓缓将气室内空气吸去，造成气室负压，此时可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜下陷，壳膜与尿囊膜之间形成人工气室。 5．揭开人工气室上的壳膜，暴露该处的绒毛尿囊膜，滴加0.2-0.5ml病毒悬液于绒毛尿囊膜上，用无菌胶布封口。将鸡胚横卧，于37度孵育，不能翻动，以免人工气室移位。 6．4－5天后取出收获。用碘酒，乙醇消毒接种部位及四周，撕去封闭处卵壳，用无菌镊子扩大开口处，轻轻夹起绒毛尿囊膜用无菌剪刀剪下接种面及周围的膜。置于生理盐水平皿内，观察白色斑点或做其它检测。 如果你要是做药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成影响实验，可以在第五步把滴加病毒悬液改为滴加药物悬液。 我认为分组应该分两组：实验组和对照组，实验组要药物刺激，对照组用无菌生理盐水。实验组中为了观察药物不同浓度大小对绒毛尿囊膜血管生成的影响，可以从低到高分为几个不同浓度组 10.0 加入载体的目的 不加载体不好确定加药位置，我认为载体的作用一个是可以定位，另 一个还可以对药物起到缓释作用。明胶海绵不错，孔径4.5微米的滤膜也可以。开窗后无菌操作不需要加抗生素。 11.0 制作假气室的目的何在？ 假气室的目的还是避免伤及CAM. 12.0我做实验的时候，使用甲基纤维素莫，但我发现试验后他消失了，那么我用膜的意义何在？我是不是可以不加载体而直接加药呢？那么最终如何确定加药的位置呢〉 13.0接种鸡胚前用多大浓度的碘酒消毒？ 标出鸡胚的气室，先用碘酒擦拭，再用70%酒精擦净碘酒，即可接种。 14.0化实际生产中我们常遇到孵化早、中、晚期出现鸡胚胎的异常死亡，其表现和造成的主要原因 一）胚胎前期死亡：孵化前6天胚胎的死亡率占入孵蛋的1-3%，若超过这个范围，说明我们的孵化存在问题。从孵化的角度讲，造成胚胎的早期死亡率偏高的主要原因是：种蛋熏蒸消毒不当（浓度太高，时间过长）和孵化前期温度过高。夏季孵化，种蛋从温度较低的蛋库中取出，未经逐渐升温处理，而直接孵化，会因温差太大，蛋壳表面出现冷凝水现象，此时若进行熏蒸消毒，往往会造成鸡胚胎早期死亡。 （二）中期死亡：若7-12天胚胎的中死占入孵蛋的5%左右，一般可视为正常情况。造成鸡胚胎大量的死亡一般与孵化温度过高、通风不良、翻蛋不正常有关，其中翻蛋不正常是鸡胚胎中期死亡的主要原因。 （三）后期死亡（13-18天）：温度过高，小头向上孵化和通风不良可引起后期死亡偏高，孵化正常时，胚胎后期死亡率不会超过入孵蛋的5%。 （四）出雏期间的死亡： 1．闷死壳内：通常出雏时的高温高湿，特别是通风不良是其主要原因。 2．啄壳后死亡：如果洞口多粘液是高温高湿所致；而蛋黄未吸收完全，尿囊合拢不全多因落盘时温度骤降所致。出雏期胚胎的死亡率在整个孵化过程中一般占入孵蛋的6-7%。 人工孵化的数量大，一批种蛋中会存在一定比例的弱胚，各期胚胎的死亡率的在正常范围内，说明孵化技术方案没有大的问题。同时胚胎的死亡除不正确的孵化方案外，种蛋的保存期太长，保存期内温度过高过低，种鸡的营养不良和疾病，都会造成鸡胚胎的死亡率增高。 15.0 16.0肿瘤血管模型的研究现状 将固定后的眼球梯度乙醇脱水，顺序依次为：750ml/L 乙醇溶液2h→850 ml/L 2h→乙醇溶液→950ml/L 乙醇溶液2h×2次→1L/L乙醇溶液2h×2次，二甲苯透明15min ×2次、60℃石蜡液浸蜡1.5h×2次,然后以角膜顶点在下、使角膜中央至视乳头连线垂直水平面进行石蜡包埋；或以12点角膜缘在下、使角膜中央至视乳头连线平行水平面进行石蜡包埋。连续切片，厚度4µm，在37℃温水中展平，捞片于预处理过的载玻片70℃烘干，置58℃恒温箱烤片24h。二甲苯溶液脱蜡10min×3次→1L/L乙醇溶液10min→950ml/L 乙醇溶液10min→850ml/L 乙醇溶液10min→750ml/L 乙醇溶液10min 。苏木素液染色5min→自来水漂洗1min→trisHCL分化5-10s→750ml/L 乙醇溶液1min →自来水漂洗1min→5g/L酸化伊红乙醇溶液1min→750ml/L 乙醇溶液1min→850ml/L 乙醇溶液1min→950ml/L 乙醇溶液1min→1L/L乙醇溶液1min→二甲苯透明1min×2次→ 中性树胶封片→光学显微镜观察拍片。 _1268565847.pdf 昆明医学院学报 　2004 , (2) :21～24 CN 53 - 1049/ R Academic Journal of Kunming Medical College 论 　著 鸡胚尿囊膜模型血管生成定量指标的研究 杨丽华1) ,王凯峰2) ,周轶平2) ,李玛琳2) (1)昆明医学院第二附属医院妇产科 ,昆明 　650101 ;2) 云南省天然药物药理重点 ,昆明 　 650031) [摘要 ]目的 :确定鸡胚尿囊膜模型血管生成指标. 方法 :30 只发育良好的 10 日龄鸡胚分为 3 组 (每组 10 只) :rbFGF ,kringle 5 和 NS组. 分别吸取 rbFGF ,kringle 5 ,NS液 10μL 于甲基纤维素膜上 ,加于鸡胚 CAM上. 用计算 机图像分析系统对鸡胚 CAM 血管生成的血管数目 ( VN) 、血管平均管径 ( VD) 、血管面积 ( VA) 、血管面积/ 鸡胚 CAM面积之比值 ( VA/ CAM) 四项指标进行定量. 结果 : Kringle 5 组的 VN , VA , VA/ CAM 值显著低于生理盐水 (NS) 对照组 ( P < 0105) . rbFGF组的 VN , VA , VA/ CAM 值显著高于 NS 对照组 ( P < 0105) ,各组间 VD 无显著差异 ( P > 0105) . 血管定量指标 VN 和 VA , VA/ CAM 值之间的相关系数分别为 :01967 ,01973 ( P < 0101) ;回归系数分别为 01947 ,01935 ( P < 0101) . 结论 :与常规定量指标 VA 相比 ,VA/ CAM 值更为客观有效 . [关键词 ]鸡胚尿囊膜 ;血管生成模型 ;血管生成指标 [中图分类号 ]R332 　[文献标识码 ]A 　[文章编号 ]1003 - 4706(2004) 02 - 0021 - 04 On the Quantitative Indexes of the Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in Angiogenesis Models YANGLi - hua1) ,WANG Kai - feng2) ,ZHOU Yi - ping2) ,LI Ma - lin2) (1) Dept1 of Obstetrics and Gynecology , The 2 nd Affiliated Hospital of Kunming Medical College , Kunming 650101 ;2) Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Product Research , Kunming 650031 , China) [ Abstract] Objective :To study the quantitative indexes of the chick embryo chorioallantoic membrane(CAM) in angiogenesis models1Methods :Thirty well - developed eggs were divided into three groups of ten for each group : rbFGF ,kringle 5 and NS group ( n = 10) ,respectively subtracted 10μL of each onto methylcellulose discs and added into CAM1Computer image analysis system(CIAS) was used to quantify angiogenesis with the vascular number( VN) , vascular diameter ( VD) ,vascular area ( VA ) , the ratio between the vascular area and the CAM area ( VA/ CAM)1Results : VN , VA and VA/ CAM index of Kringle 5 were lower than that in the control group ( P < 0105) ,and those of rbFGF were higher than that in the control group ( P < 0105) with no big difference in VD ( P > 0105) 1The corre2 lation coefficients of VN between VA and VA/ CAM were respectively 01967 and 01973 ( P < 0101) ;the regression coefficients were respectively 01947 and 01935 ( P < 0101) 1Conclusions :Among several evaluating indexes of angio2 genesis ,VA/ CAM is more effective and objective1 [ Key words] Chick embryo chorioallantoic membrane ;Angiogenesis model ;Angiogenesis index [基金项目 ] 云南省自然科学基金资助项目 (2001C0051M) [作者简介 ] 杨丽华 (1972～) , 女 , 纳西族 , 云南永胜人 , 博士 , 主要从事妇科肿瘤研究. 　　新血管生成是肿瘤生长转移的基础 , 因此 , 抗肿瘤内血管生长的治疗是抑制肿瘤生长和扩散 的一个重要策略[1 ] . 建立各种血管生成的模型是 研究肿瘤内血管生长机理和筛选抗血管生长药物 必须的关键性步骤[2 ] , 因而有着十分重要的意 义. 近 30 年来 , 科学工作者建立了很多新血管 生成的模型已用于血管生成的研究[3 ] . 在众多的 模型中 , 鸡胚尿囊膜模型 (CAM) 因其实用、简 单、方便和价廉而被广泛地应用[4 ] , 但该模型血 管生成的观察指标较单一 , 且不够客观 , 因此本 研究对其不足之处进行改进. 1 　材料和方法 111 　材料 实验器材 : CO2 培养箱 , 德国 Heraeus 公司 生产 ; 净化工作台 SW - CJ - IF , 苏州安泰空气 技术有限公司 , YJ - 1450 型 ; 电热恒温培养箱 (303 - 型) , 上海沪南科学仪器联营厂制造 ; 752 型紫外光栅分光光度计 , 山东高密分析仪器厂 ; Q970 型图像分析系统 , 云南大学实验中心 , 英 国剑桥仪器公司生产 ; 照相机 , 日本 Cannon 制 造. 药物及试剂 : ①Kringle 5 , 基因工程表达的 纤溶酶原 kringie 5 区粗提物 , 浓度约 925μg/ mL , 纯度约 40 %～50 % , - 20 ℃保存 , 由中国医学科 学院昆明生物研究所戴长柏研究员提供 ; ② rbFGF , 基因工程表达的重组成纤维细胞生长因 子 ( recombiant fibroblast growth factor) , 浓度为 1 mg/ mL , - 20 ℃保存 , 由中国医学科学院昆明生 物研究所马艳冰助理研究员提供 ; ③甲基纤维素 ( methylcellulose ) , Sigma 公 司 产 品 , 批 号 73H0365. 鸡胚 : 德国伊沙鸡种 , 购自昆明实验养鸡 场. 112 　方法 甲基纤维素滤膜的制作 : 取甲基纤维素粉 10 g , 溶解于 1 L 无菌三蒸水 , 4 ℃搅拌 48 h , 配 制成 1 %的甲基纤维素溶液 , 取 20μL 该溶液置 于无菌的直径 5 mm 的塑料小孔上 , 使其成膜 , 超净台下吹干即可应用. CAM 窗法 : 30 只发育良好的 10 日龄鸡胚随 机分为 3 组 (每组 10 只) , rbFGF , kringle 5 和 NS组. 将鸡胚于超净台上消毒后去除鸡胚气室 端外壳、外膜、内膜 , 暴露含有丰富血管的尿囊 膜组织. 分别吸取 rbFGF , kringle 5 , NS液 10μL 置于甲基纤维素膜上 , 加入鸡胚 CAM 的两大血 管间的无血管区. 鸡胚加药后 , 用无菌透明胶带 封住鸡胚的“开窗”处. 96 h 后 , 揭去透明胶 带 , 滴加 10 %的福尔马林以杀死鸡胚并固定尿 囊膜 , 20 min 后 , 剪下尿囊膜 , 平铺于培养皿 中. 将标本置于显微镜下观察并拍照 , 用计算机 图像分析系统对 CAM 进行扫描 , 记数血管数量 ( VN) 、血管直径 ( VD) 、血管面积 ( VA) 和血 管面积/ 尿囊膜面积比值 ( VA/ CAM) . 113 数据处理 鸡胚尿囊膜实验数据以均数 ±差 ( x ± s) 表示 , 用《医百·医统》 ( PEMS211 版) 和 SPSS910 版统计软件包进行方差齐性检验、方差 分析处理、相关性检测 , P < 0105 为有显著性差 异. 2 　结果 211 　血管生成指标的确定 NS , Kringle 5 , rbFGF对鸡胚 CAM 血管生成 指标的影响 : NS组鸡胚 CAM 血管形态和分支基 本呈树枝状均匀分布 , 无异常血管增多或减少的 区域 , VN 平均为 ( 15110 ±6167) 根 , VD 为 (0125 ±0104) cm , VA 为 (11176 ±5144) cm2 , VA/ CAM 为 29181 ±15105. 纸片周围无异常的血 管增生或减少的区域 (图 1) . Kringle 5 组可见鸡胚 CAM 血管分布稀疏 , 血管呈树状分布 , 血管形态基本正常 (图 2) . 与 NS 相比 VN , VA , VA/ CAM 显著减少 ( P < 0105) , 而 VD 无显著差异 ( P > 0105) . rbFGF组可见血管以加药纸片为中心 , 呈放 射状向外周生长 , 失去正常的血管树枝状分布 (图 3) . 与对照组相比 , VN 、VA 及 VA/ CAM 显 著增加 ( P < 0105) , 但 VD 未见显著性增大 ( P > 0105) , 见表 1. 22 昆明医学院学报 第 25 卷 表 1 　Kringle 5 , rbFGF , NS对 CAM血管生成指标的影响 ( x ±s) 组 　别 n VN (根) 　　 VA ( cm2) 　　　 VA/ CAM 　　　 VD (cm) NS组 10 15110 ±6167 11104 ±4171 29181 ±15102 0125 ±0104 rbFGF 9 65110 ±17142 3 53187 ±13157 3 133150 ±31162 3 0120 ±0104 Kringle 5 10 5110 ±1166 3 3113 ±1138 3 　8166 ±3184 3 0124 ±0109 　与 NS组相比 , 3 P < 0105 ; VN : 血管数目 ; VA : 血管面积 ; VA/ CAM : 血管面积/ 尿囊膜面积 ; VD : 血管直径. 图 1 　生理盐水对照组 血管呈树状均匀分布 , 无异常诱导区域 , 形态正 常. 图 2 　kringle 5 对 CAM血管生长的影响 血管分布稀疏 , 基本上呈树状分布 , 形态无异常. 图 3 　rbFGF对 CAM血管生长的影响 血管以加药纸片为中心呈辐射状向外生长 , 失去正 常的血管树枝状分布. 212 　各指标间的关系 应用 Pearson 相关分析研究 NS 组 VN , VD , VA , VA/ VAM 各指标间的相关关系 , 发现 VD 与 VN , VA , VA/ CAM 均无相关性 , 其余各指标间 均显著相关 (表 2) . 应用直线回归分析研究 VN 与 VA , VA/ CAM 之间的关系 , 发现 VN 与 VA ( r2 = 01947) 和 VA/ CAM ( r2 = 01935) 均呈直线 相关. 表 2 　NS组鸡胚 CAM的 VN 与 VA , VA/ CAM , VD 的相关性比较 指 　标 R VN 与 VA 01967 VN 与 VA/ CAM 01973 VN 与 VD 01204 3 　讨论 鸡胚 CAM 模型血管生成的定量是该模型应 用中关键的环节 , 国内外用的方法多种多样[5 ] . 在国外有的研究者计数呈放射状排列的血管数、 血管密度[6 ] . Thompson 等通过内皮细胞 DNA 合 成过程氘标记的胸腺嘧啶 (thymidine) 和亮氨酸 (leucine) 的结合而测量鸡胚 CAM 的胸腺嘧啶脱 氧核苷酸混合物来定量鸡胚 CAM 上的新血管生 成[7 ] . Fajardo 用夹有待测样品的两片聚乙烯醇 炮沫滤膜制成“盘面血管生成系统”来计数长入 该系统内的新生血管数量[8 ] . Gush 等测量了卵 黄囊 (yolk sac) 的血流[9 ] . 还有学者直接测量 了血管长度密度和血管分级结构所占据的空间 , 将其作为血管密度指数与血管图像区域的分级比 较[10 ] . Rieder 用计算机图像数字技术来定量鸡胚 CAM 上的新生血管[11 ] . 32第 2 期 杨丽华 , 等. 鸡胚尿囊膜模型血管生成定量指标的研究 在国内的鸡胚 CAM 实验中 , 血管生成的定 量方法一般是采用人工计数血管生成数量及血管 密度. 这些方法是目检估计并与一系列标准反应 比较而得来. 根据血管反应或对肿瘤种植物或其 它物质的血管反应 , 用数字或符号 (如 + 、 0、 - ) 或 ( - 2、 - 1、0、 + 1、 + 2) [12 ] . 然而 主观的计数方法使实验室之间客观比较困 难. 并且人工计数方法速度慢 , 误差大且许多细 小的血管难以计数 , 观察指标较单一. 为了提高血管生成指标的客观性及计数的自 动化程度 , 便于客观、准确、快速的定量鸡胚 CAM 血管生成. 该模型建立的过程中 , 使用了 一个新的血管生成定量指标 ———血管生成面积与 鸡胚尿囊膜面积比 ( VA/ CAM) , 它指的是每平 方厘米的尿囊膜面积的血管面积. 由于鸡胚 CAM的血管数量与血管面积及面积比呈正相关 , 并且存在一回归直线 , 血管数目随着血管面积而 变化. 故鸡胚 CAM 血管面积的大小可反映血管 数量的多少 , 但是鸡胚 CAM 血管面积的绝对数 并不能反映血管生成的真实情况 , 因为每一个鸡 胚 CAM 大小并不一致 , 用总的血管面积并不能 准确的反映血管的密度 , 故使用 VA/ CAM 作为 血管生成的定量指标 , 可以真实的反映血管生成 情况 , 而且血管面积和鸡胚 CAM 面积均可通过 计算机自动计数 , 使血管生成定量指标更为客观 准确 , 计数速度加快. 本研究用 VA/ CAM 作为 鸡胚 CAM 血管生成定量指标 , 结果表明与生理 盐水组比较 , rbFGF 组 VA/ CAM 显著增加 , Kringle 5 组则明显减少. 且 VA/ CAM 与传统的血 管计数 VN 相关性良好 , 存在一直线回归关系 , 说明 VA/ CAM 可作为鸡胚 CAM 血管生成定量指 标 , 并且客观、准确、能快速测量. 本研究还同 时把血管管径作为一个血管定量指标 , 但实验组 与对照组相比差异均无显著性 , 与血管数目、血 管面积比之间亦无相关性 , 说明它并不能作为血 管生成定量指标. 总之 , 与常规计数血管数目的方法相比 , VA/ CAM 可作为客观、快速、简单、有效的鸡胚 尿囊膜血管生成定量指标. [参考文献 ] [1 ] HARJAI K J , CHOWDHURY P , GRINES C L. Thera2 peutic angiogenesis : a fantastic new adventure [J ] . Interv Cardiol , 2002 , 15 (3) : 223 [2 ] NORFLEET A M , BERGMANN J S , CARNEY D H. Thrombin peptide , TP508 , stimulates angiogenic respons2 es in animal models of dermal wound healing , in chick chorioallantoic membranes , and in cultured human aortic and microvascular endothelial cells [J ] . Gen Pharmacol , 2000 , 35 (5) : 249 [3 ] BOOTLE W C A , TAZZYMAN S , THOMPSON W D , et al. Fibrin fragment E stimulates the proliferation , migra2 tion and differentiation of human microvascular endothelial cells in vitro [J ] . Angiogenesis , 2001 , 4 (4) : 269 [4 ] RIBATTI D , NICO B , VACCA A , et al. Chorioallantoic membrane capillary bed : a useful target for studying angio2 genesis and anti - angiogenesis in vivo [J ] . Anat Rec , 2001 , 264 (4) : 317 [5 ] THOMPSON W D , REID A. Quantitative assays for the chick chorioallantoic membrane [J ] . 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Microvasc Res , 1995 , 49 (2) : 180 [12 ] 刘剑平 . 肿瘤微血管生成模型的应用现状 [J ] . 中 国肿瘤 , 2002 , 11 (1) : 457 (2003 - 12 - 10 收稿) 42 昆明医学院学报 第 25 卷 _1268566275.pdf 中国肿瘤 2002 年第 11 卷第 1 期 45 刘剑平 1综述 ,侯 梅 2审校 (1. 川北医学院附属医院 ,四川 南充 637000 ;2. 四川大学华西医院肿瘤中心 ,四川 成都 610041) 收稿日期 :2001 - 09 - 18 肿瘤微血管生成 , 在大多数肿瘤进行性生长过程中起重 要作用 , 也是肿瘤侵袭与转移的关键。抗肿瘤微血管生成已 成为研究热点之一 , 也是肿瘤治疗的希望所在。该领域的 研究需要借助相应的实验模型来进行。自从 1979 年 Folkman 建立长期培养内皮细胞的方法后 , 许多实验模型相继用于此 项研究 ,已成功筛选了 300 余种血管生成促进因子 (促进剂) 和抑制因子 (抑制剂) 。这些模型中有的是直接借用或加以改 进后用于肿瘤微血管生成研究 , 如兔角膜囊模型、苍鼠颊囊 模型等 ;有的系近年新建 ,如人胎盘血管段培养、大鼠皮下气 囊模型等。一般将其分为体内研究和体外研究两大类 [1 ]。现 将目前较常用的方法作一些回顾与介绍。 1 肿瘤微血管生成体外研究方法 体外实验研究分细胞水平和组织学水平两类 , 前者根据 有无细胞外基质而分普通培养和三维培养 , 若与肿瘤细胞同 时培养而称共同培养。 1. 1 内皮细胞体外培养 1977 年 Del Vecchio 等将内皮细胞从大鼠肾上腺中分离 , 体外培养成活数周。Folkman 等于 1979 年加以改进 , 建立了 内皮细胞长期培养的方法。为模拟肿瘤环境 ,Folkman 等首先 使用了肿瘤条件培养基 ,即先将 Kaposi’ s 肉瘤细胞或 NIH3 T3 细胞培养一定时间后取上清 , 其中富含血管生成促进因子 , 在培养内皮细胞时加入培养基中 [2 ]。该方法与现在一般细胞 培养方法相似。 前述培养系统中 , 内皮细胞在没有基质的培养基中呈二 维生长 ,与生理状态相差甚远。后来发现 ,细胞基质对内皮细 胞生长有重要影响 , 故而在培养系统中加入 Ⅰ型胶原形成细 胞外基质 ,内皮细胞生长其中 ,可形成血管形态 ,较为接近生 理状态。该系统可称作内皮细胞体外三维培养。 1. 2 共同培养模型 以上系统中 , 虽有肿瘤条件培养基 , 但内皮细胞生长在 没有肿瘤细胞的环境中 , 不能反应肿瘤和内皮细胞的相互作 用。有学者将肿瘤细胞与内皮细胞一起置于 Ⅰ型胶原基质中 培养 ,用于分析血管生成情况 ,而构成共同培养模型 [3 ]。 细胞水平的培养方法 ,简便易行 ,便于观察 ,且建立在没 有预先存在的血管系统中 , 没有本身存在的血管系统的影 响。但是 ,这些内皮细胞的生长和血管形成 ,是暴露在细胞外 基质中或不同的血管生成作用因子中 , 内皮细胞已被激活 , 有很强的人为因素。虽有肿瘤条件培养基或与肿瘤细胞共同 培养 ,仍缺乏体内的微环境 ,尤其是肿瘤内的微环境 ,故不能 代表体内情况 [4 ] ,其应用价值有限。 1. 3 血管段培养模型 为了克服细胞培养的不足 , 使血管生成过程与体内过程 相似 , 1996 年 Kathryn 在 Leighton、Roberto 等的组织培养基础 上 ,建立完善了人胎盘血管段培养模型 [4 ]。其方法如下 : ①材 料 :剖宫产后 24 小时内 ,取直径为 1mm～2mm的胎盘表浅血 管 ,长 2cm～5cm ,无菌条件下将其剪成 1mm～2mm的片段。 ②培养 :48 孔培养板每孔加入 15μl 凝血酶 ,再加入 0. 5ml 199 培养基 , 迅速摇匀 , 于凝固前将一血管小片段置于培养孔中 央 , 30 秒内血管段被包围在形成的凝胶中 , 然后每孔再加入 0. 5ml 199 培养液和一定量的待测剂 , 常规培养 , 每周换液两 次。③观察 :每 2 天观察一次 ,用专门的图像分析系统定量分 析 ,作出生长曲线。④检测 :培养约 3 周后将母本血管从纤维 肿瘤微血管生成模型的应用现状 The Utility of Tumor Angiogenesis Model LIU Jian2ping , HOU Mei 摘 要 :肿瘤微血管生成研究需要借助相应的实验模型来进行 ,本文对近年常用的肿瘤 微血管生成研究模型的应用作回顾与评价 , 对有改进的鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM) 微血管生成 模型、新建立的血管段培养模型和鼠皮下气囊模型作较详细的介绍和评价。 关键词 :血管生成 ;肿瘤 ;模型 中图分类号 :R73 - 3 文献标识码 :C 文章编号 :1004 - 0242(2002) 01 - 0045 - 03 46 中国肿瘤 2002 年第 11 卷第 1 期 蛋白凝块中取出 , 新生的微血管旁枝则保留在培养孔内 , 取 出凝块 , 固定 , 石蜡包埋切片 , 然后进行免疫组化和电镜检 测 , 确定其是否为内皮细胞组成。亦可用流式细胞仪检测内 皮细胞的百分比定量分析微血管生成情况。 该模型利用损伤与修复的生理反应 , 动态观察微血管生 成情况 , 不需加入外源血管生成促进因子。其最大的优点在 于 ,它具备了类似体内模型的特征 ,能动态、立体观察微血管 生成情况 , 没有本身存在的血管和炎性细胞的干扰。可用于 筛选血管生成促进因子和抑制因子 , 是一个较好的体外血管 生成模型。但它同样不能反映肿瘤微环境 , 不一定能代表肿 瘤微血管生成。 2 肿瘤微血管生成体内研究模型 体外实验虽然有较多优越性 , 但其毕竟不能完全代表肿 瘤的实际情况 , 因此体内实验有相当的必要性。下面将主要 的动物模型作一些介绍。 2. 1 鸡胚绒毛尿囊膜微血管生成模型 根据研究目的和操作方法不同 ,鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM) 也可归为体外模型 , 它最初由 Lewis 等于 1931 年建立 , 1977 年 Knighton、Folkman 等首先将其用于肿瘤微血管生成的研 究 ,此后 ,CAM模型成为使用较多的模型之一 ,且有较多改进 型 ,国内应用较多。 现介绍一种较常用的改进方法 [5～7 ] : ①鸡胚准备 :一定数 量种蛋 ,置 37 ℃、5 %CO2、适当湿度的孵箱内孵育 ,鸡胚发育 第 3 天 , 消毒蛋壳后 , 制作 2cm×2cm左右的观察窗 , 并抽出 2ml～3ml 蛋清 ,用无菌透明胶封闭窗口。②载体 :用组织相容 性较好 ,不易引起炎症反应的材料如明胶海绵 (也可用胶原、 甲基纤维素或醋酸纤维滤纸) 作为载体 , 将待测试剂加入其 中 , 若待测物可能为抑制剂 , 则需同时加入一定量 VEGF或 bFGF 。③植入 :胚胎发育第 8 日 ,将载体植于 CAM表面 ,然后 用透明胶封严 ,继续孵育。④观测 :植入后每 12 小时用解剖 显微镜观察一次。第 12 天