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上皮细胞培养

yingzi
2013-02-04 3 侵权/举报
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上皮细胞培养

1)表皮细胞培养

1.取材:取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.51平方厘米小块。

2.EDTA处理:先置入0.02EDTA中室温置5分钟。

3.冷消化:换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过夜。

4.分离:取出皮肤,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。

5.温消化:取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化3060分钟。

6.用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液。

7.培养液:通过80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2温箱培养。

 

2)  乳腺组织培养

直接培养法:(适于培养含纤维少的软组织)

1.在含有少量培养液或Hanks液的容器中,用锋利刀片将组织反复切割成碎块。

2.把组织碎块连同液体注入离心管中,再补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架35分钟。吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。重复23次。

3.末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,使沉降物重悬。不待细胞团块下降立即通过34层无菌纱布滤入另管中。

4.调整好适宜密度,接种入培养瓶中培养。

 

胶原酶消化法:(适于处理含纤维多的较硬组织)

其过程与培养其它组织相同。

 

3)  胃上皮细胞培养

1.取材:取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。

2.清洗:用含庆大霉素(400微克/毫升)和二性霉素(2微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm3大小。

3.消化:在I型胶原酶和透明质酸酶中,于37℃中消化80分钟。

4.离心:收集细胞悬液,800/分离心后,Hanks液漂洗两次。

5.接种:末次离心后加入含有1%~2%胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中,接种量依不同实验目的而定。

 

4)  肝细胞培养

初代组织块培养:


取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3左右的小块,采用帖壁培养法。

 

初代消化法培养:

1.把肝组织切成24立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS液洗两次。

2.移入110.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS配置)中,4℃冷消化1012小时后,通过250微米和64微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。

3.收集细胞、BSS液洗12次、计数、接种培养。

消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法;肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好。

1.无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS洗除血污。

2.5ml注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入肝管系统,并不时轻揉压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留2030分后,在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出。

3.待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI 1640培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。

 

传代培养:

待细胞生长连接成片后,用BSS洗一二次,加110.025%胰蛋白酶和0.02 EDTA混合消化35分钟,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液,用BSS洗一二次,注入营养液,吹打,制成细胞悬液,再接种培养。

 

5)内皮细胞培养

1.取产后的新鲜脐带。如不立即培养可以保存于4℃中,但不宜超过12小时。无菌剪取长1015厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养。

2.先用三通注射器吸温PBS液注入脐带的静脉中,洗除残血,注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流。

3.用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后结扎之,令充满血管,注入口亦应结扎,以防液体返流,消化310分钟。

4.吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,为获取更多细胞,可再注入温PBS冲洗23次彻底清除干净残余细胞,一并注入离心管中离心。

5.吸除上清,加1640培养液,制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养,顺利时23天内细胞即可长成单层。

 

6)毛细血管内皮细胞培养

肿瘤条件培养基制备:

1.C3H小鼠的S-180实体肉瘤组织。

2.胰蛋白酶消化,Dulbecco改良Eagle氏培养液15ml(含10%小牛血清),接种到T-75 Falcon产培养瓶中培养。

3.在细胞生长接近完全汇合时,收集培养液制成条件培养基;再用含10%小牛血清的新培养液后,也每隔两天收集一次,可获得多量条件培养基。


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