质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳

nullDNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳 一、目的要求 二、原理 1、类型： （1）聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 一、目的要求 二、原理 1、类型： （1）聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 （2）琼脂糖凝胶电泳 可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用荧光染料染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。 （2）琼脂糖凝胶电泳 可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用荧光染料染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。琼脂糖：从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。 琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。琼脂糖：从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。 琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。null不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围   2、DNA电泳影响因素 主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。 （1）DNA分子大小 DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大，泳动也越慢， 迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 （2）DNA分子构型 相同分子量质粒DNA，构型不同电泳时受的阻力不同，泳动速率不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状次之，开环最慢。 2、DNA电泳影响因素 主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。 （1）DNA分子大小 DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大，泳动也越慢， 迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 （2）DNA分子构型 相同分子量质粒DNA，构型不同电泳时受的阻力不同，泳动速率不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状次之，开环最慢。 （3）胶浓度 （4）电场强度：根据需要选择合适电压。 为了尽快得到实验结果，所用电场强度约为5V/cm， 但分辨率不高。 精确测定DNA分子大小时，电压1V/cm。 （5）溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂。（3）胶浓度 （4）电场强度：根据需要选择合适电压。 为了尽快得到实验结果，所用电场强度约为5V/cm， 但分辨率不高。 精确测定DNA分子大小时，电压1V/cm。 （5）溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂。具有扁平 结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。具有扁平 结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。（6）电泳缓冲液 常用DNA电泳缓冲液（1000ml) TAE （50×） 242gTris 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) （6）电泳缓冲液 常用DNA电泳缓冲液（1000ml) TAE （50×） 242gTris 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) TBE（5×） 54gTris 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) TPE （10×） 108g Tris 15.5ml 磷酸 (85%，1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) TBE（5×） 54gTris 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) TPE （10×） 108g Tris 15.5ml 磷酸 (85%，1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 3、DNA电泳上样缓冲液 主要作用如下： （1） 螯合Mg2＋，防止电泳过程中DNA被降解（2） 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。 （3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。 3、DNA电泳上样缓冲液 主要作用如下： （1） 螯合Mg2＋，防止电泳过程中DNA被降解（2） 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。 （3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。 4、 DNA电泳上样量的控制 性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/带，即可观察到清晰结果。 珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。 4、 DNA电泳上样量的控制 分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/带，即可观察到清晰结果。 珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。 null5、 DNA电泳的分子量（DNA Marker） 目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。 nullnull6、DNA染料 （1）溴化乙锭 简称EB，电泳中的染色剂。 （2）荧光染料 GoldViewTM核酸染料 （2）荧光染料 GoldViewTM核酸染料 nullnull三、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备（浓度依照质粒大小确定）. 凝胶板的制备 加样（加样体积在10~30ul） 电泳 结果观察nullnull 1：DNA Marker2； 2～3：Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切的pET/dhaT质粒； 4：pET-28a-c(＋)空质粒 1 2 3 4