南蛇藤生药学及指纹图谱研究

广东药学院 硕士学位论文南蛇藤生药学及指纹图谱研究 姓名：梁碧燕 申请学位级别：硕士 专业：药物化学 指导教师：李书渊 20080501 广东药学院硕士研究生学位论文 中文摘要 南蛇藤为卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.），为民间习用药材。 具有驱风除湿，活血解毒消肿的功效，民间常用该药煎汤或外敷治疗风湿痹痛。 现代药理研究表明其具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性，临床上可用于治疗类风湿性关节炎和多种自身免疫性疾病。 该植物分布广泛，资源丰富。 与它同科的雷公藤和昆明山海棠是有毒植物，三者毒性不一，并在市面上有混淆的现象，若不加以区分，将影响临床用药安全。 本文对南蛇藤有效成分、现代药理研究、临床作用以及应用中呈现的毒副作用做了综述和总结对其生药学和主要有效成分进行研究，初步建立了其质量控制方法。 本文应用显微、薄层色谱、高效液相色谱、红外光谱等技术对该南蛇藤进行性状特征、显微鉴定、理化鉴别等方面的生药学研究。 其中显微鉴定包括横切面和粉末的鉴定；理化鉴别包括薄层色谱、液相指纹图谱和红外指纹图谱。 药材鉴别可大致反映药材的真伪优劣，是中药鉴定的可靠依据，本文研究了南蛇藤性状和显微特征，有助于区分南蛇藤正品和混淆品。 本文对南蛇藤中的主要有效成分—卫矛醇和扁蒴藤素进行了研究，经过实验分别建立了卫矛醇和扁蒴藤素的薄层鉴别法。 此法简便稳定，为南蛇藤质量的制定提供参考。 本文采用高效液相色谱和蒸发光散射检测器联用技术，建立了卫矛醇的含量测定法。 本方法操作简单，结果稳定，可作为南蛇藤类药材及其制剂中卫矛醇的定量方法。 我们测定了不同产地的南蛇藤中卫矛醇的含量，发现各地的差异很大，说明当前南蛇藤药材的质量控制需要加强。 在含量测定研究的基础上，我们还对南蛇藤进行了指纹图谱方面的研究。 以扁蒴藤素为指标成分，建立了南蛇藤的高效液相指纹图谱。 经方法学考察，该法稳定可靠、专属性强。 在研究整体图谱的基础上，通过参照峰与其余十四个共有色谱峰的相对面积实现南蛇藤的质量控制。 本次研究也为南蛇藤有效组分与药效之间的关系－即组效关系的研究奠定了基础。 我们测定了不同产地的南蛇藤指纹图谱，发现药材的地区差异很大，进一步说明当前南蛇藤药材的质量控制需要加强。 本文用红外光谱法比较卫矛科的南蛇藤和昆明山海棠的粉末及醇提物的特征。 I 广东药学院硕士研究生学位论文两种药材的粉末图谱中都看到有草酸钙和淀粉的特征峰，醇提物图谱中都能看到卫矛醇的特征峰，但南蛇藤较为明显。 从两种药材醇提物的二阶导数图谱中可看到南蛇藤与昆明山海棠有明显差异，说明它们某些成分含量不同。 南蛇藤根图谱的草酸钙和卫矛醇的峰形都比茎的强和尖，说明根中草酸钙和卫矛醇的含量比茎高。 由于红外法既能快速地找出药材差异，又能准确指认出卫矛醇，所以此法制定的宏观指纹图谱可作为鉴定南蛇藤的简易方法。 关键词: 南蛇藤 卫矛醇 扁蒴藤素 南蛇藤素 高效液相-蒸发光散射 含量测定 高效液相指纹图谱 红外指纹图谱 II 广东药学院硕士研究生学位论文 Studies on Pharmacognosy and Fingerprint of Celastrus orbiculatus Thunb Master Candidate: Bi-yan Liang Medicinal Chemistry Supervisor: Professor Shu-yuan Li Abstract Celastrus orbiculatus Thunb. is one of folk medicine and distributes widely inChina. It was used for activating blood detoxification and detumescence.The extracts ofCelastrus orbiculatus Thunb. have various activities inculding anti-inflammatory anti-tumorand immunosuppressive etc. Its preparation was used for the treatment ofrheumatoid arthritis and other autoimmune diseases in clinical.Celastrus orbiculatusThunb. was reviewed in its distribution application chemical componentspharmacological function clinical applications etc. And also its pharmacognosticproperties main contents and quality control were studied. In this thesis both dulcitol and pristimerin the primary contents in Celastrusorbiculatus Thunb. have been studied by Thin Layer Chromatography TLC. The methodmay help to establish the quality standards for Celastrus orbiculatus Thunb. and itspreparation. The method of content determination was established by chromatographicexperiments. The results showed the method was easy to operate and accurate. Content ofdulcitol from Celastrus orbiculatus Thunb. was determined by HPLC method. The resultsshowed that the contents of dulcitol from Celastrus orbiculatus Thunb. in differentproducing area revealed a sharp difference and this result indicated the quality control ofCelastrus orbiculatus Thunb. should be improved. The Chromatographic Fingerprint of its bioactive component was established byHPLC method. The methods were stable reliable and specific for analysis bioactivecomponent from Celastrus orbiculatus Thunb. The method can be applied to the quality i 广东药学院硕士研究生学位论文control of Celastrus orbiculatus Thunb. In addition as a further research the relationshipbetween the bioactive components group and their effects was necessary and important. MoreoverThe FTIR spectra of Tripterygium hypoglaucum level Hutch THH andCelastrus orbiculatus Thunb are studied. The result show that the two herbs have differentratio of main substance calcium oxalate and dulcitol so their absorption frequency andform are different as well. There is an obvious different between Celastrus orbiculatusstem and root，both the peak form of calcium oxalate and dulcitol in the FTIR spectra ofroots are sharper and stronger than stems. Therefore FTIR can be a fast and simple methodto indentify Celastrus orbiculatus.Key words : Celastrus orbiculatus. dulcitol pristimerin tripterine HPLC-ELSD determined HPLC fingerprint FTIR ii 广东药学院学位论文原创性声明 本人郑重声明： 本人所呈交的学位论文，系我个人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。 除文中已特别加以标注和致谢的地方外，不包含其它个人或机构已经发表或撰写过的研究成果。 对本研究做出贡献的其它个人和集体，均已在文中明确说明和致谢。 本人充分意识到本声明的法律结果完全由本人承担。 学位论文作者签名：＿＿＿＿＿ 日 期： 年 月 日 学位论文使用授权的声明 本人完全了解广东药学院有关保留和使用学位论文的规定，学校有权保留和向有关部门或机构送交本论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印或其它复印手段保存和汇编本学位论文。 保密论文在解密后适用本声明。 论文作者签名：＿＿＿＿＿ 论文导师签名：＿＿＿＿＿ 日 期： 年 月 日 广东药学院硕士研究生学位论文 第一章 绪论1.1 南蛇藤的用药历史 南蛇藤，为卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.），又名 “黑茎长韧，参差生叶，果山藤，蔓性落霜红，始载于《植物名实图考》蔓草类，叶如南藤，面浓绿，背青白，光润有齿。 根茎一色，根圆长，微似蛇，故名”1。 本品为攀援状灌木，小枝灰褐色，密生小皮孔，单叶互生，老时带革质，边缘具紧密细锯齿，根呈圆柱形，细长而弯曲，外表棕褐色，具不规则纵皱，主根坚韧，不易折断，断面黄白色，纤维性2。 该植物生于山谷溪边灌丛或林边，分布于中国东北、华北、华东、西北、西南及湖北、湖南、广东，朝鲜和日本亦有分布1。 南蛇藤具有驱风除湿，活血解毒消肿的功效，主治筋骨疼痛、四肢麻木、风湿性关节炎、腰腿痛、闭经、小儿惊风、痧症、痢疾、肿毒、毒蛇咬伤、跌打损伤3 。 民间常用该药煎汤或外敷治疗风湿痹痛，该药的汤剂和酊剂已在临床用于治疗类风湿性关节炎多年，疗效确切4。 1.2 生药学研究进展 赵继忠等5对南蛇藤的茎和叶进行了生药学研究。 由实验得知 南蛇藤茎的主要显微特征为木栓细胞壁加厚呈横纹状 皮层细胞排列疏松 有粗大纤维散在或成束存在，木部细胞均木化 纤维发达 射线细胞1列 髓外有数列厚壁细胞 薄壁细胞中含草酸钙簇晶 叶的主要显微特征为叶肉细胞中亦含草酸钙簇晶 栅栏细胞2～3列 叶脉厚角细胞的壁有内缩现象；粉末主要显微特征为纤维众多 多成束存在 壁较厚 有时可见纹孔，石细胞较多 成群或散在 多为不规则分枝状 壁厚 有的层纹明显，导管多为网纹、孔纹和梯纹导管。 草酸钙簇晶较多，可见草酸钙方晶，木栓细胞表面观类方形或多边形侧面观扁平长方形；理化鉴定的薄层色谱中可见3个荧光斑点，紫外零阶光谱中有一个明显的吸收峰，二阶导数光谱中有3个明显的吸收峰和3个明显的谷。 1.3 化学成分研究进展 自1949 年首次报道从南蛇藤叶中提取分离得到黄酮苷类化合物以来 已从南蛇藤种子、根皮、叶及地上部分中分离得到50多种成分，主要有β-二氢沉香呋喃倍半 1 广东药学院硕士研究生学位论文萜和生物碱，此外还有三萜类、黄酮类、有机酸类、多元醇类、甾体类及鞣质，其中萜类、生物碱、黄酮类含量较高6。 Hwang BY等在南蛇藤茎的乙酸乙酯提取物中分离并鉴定出--表儿茶素、- –epiafzelechin和 3-苯甲酰基 5-β-D-葡萄糖--表儿茶素。 已报道的还有山奈素类和槲皮素类黄酮苷，主要存在于南蛇藤叶中7。 蒋毅用低压硅胶柱层析法从南蛇藤根的石油醚提取物中分离鉴定了扁蒴藤素（pristimerin），β-谷甾醇、β-香树脂醇、β-香树脂醇棕榈酸酯、正三十醇乙酸酯。 Hui Zi Jin等人从南蛇藤根的甲醇提取物中用硅胶柱层析法分离并鉴定出 orbiculinH、orbiculin I、orbiculin A、orbiculin D、orbiculin E、orbiculin F、南蛇藤素和 celaphanolA。 王明安从南蛇藤茎中分离并鉴定了 1α，2α，8β-三乙酰氧基-9β-肉桂酰氧基-二氢沉香呋喃等倍半萜和生物碱。 另外还含有卫矛醇和鞣质7。 1.4 药理作用研究进展 南蛇藤常以其根入药，治疗风湿性关节炎和类风湿性关节炎。 临床上，单用可治疗慢性风湿性关节炎和类风湿性关节炎、绞肠痧、原发性血小板增多症，以及耕牛的多种病症8-12；配方可治疗坐骨神经痛、强直性脊柱炎和痹症1314；中西医结合可治疗血栓性浅静脉炎和牛血痢15。 现有的南虎凝胶剂便是以南蛇藤、虎杖、没药的有效成分，与卡波姆和其它试剂一起按照一定的比例制成，用以治疗膝关节创伤性滑膜炎16。 近年的国内外研究表明，南蛇藤在抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗多药耐药性以及在抗生育方面都有着广阔的研究和应用前景，尤其值得关注的是它在抗炎和免疫抑制及抗肿瘤方面的显著作用17 18。 1.4.1 有效部位的药理研究 杨蒙蒙等4考察南蛇藤不同提取部位的抗炎作用。 实验结果表明，南蛇藤甲醇提取物对角叉菜致大鼠的足趾肿胀和醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加和大鼠棉球肉芽的生长有明显的抑制作用，并且分别强于雷公藤多苷片的抑制作用和阿司匹林的抑制作用，高剂量组抑制大鼠棉球肉芽肿的效果与吲哚美辛组相比无显著性差异。 这说明南蛇藤的甲醇提取物对炎症的不同时相有着相应的抑制作用，为抗炎的有效部位。 2 广东药学院硕士研究生学位论文 另有研究表明，南蛇藤乙醇提取物能显著提高小鼠热板实验中的痛阈；减少扭体次数；显著抑制醋酸致小鼠急性腹膜炎的毛细血管通透性；对鸡蛋清致小鼠背部气囊滑膜炎渗出液中白细胞的趋化有显著抑制作用；显著抑制角叉菜胶致大鼠足肿胀和切除双侧肾上腺的大鼠足肿胀。 也就是说，南蛇藤乙醇提取物具有显著的抗炎及镇痛作用，并且其抗炎作用与兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴作用无关，具体机制和有效成分仍需进一步研究19。 1.4.2 有效成分的药理研究 南蛇藤的生物碱和倍半萜具有较强的昆虫拒食活性和毒杀作用20-22。 而从南蛇藤中分离出的卫矛醇和南蛇藤素（又名雷公藤红素）、orbiculin H等8种萜类成分分别作用于炎症的不同环节，因而对风湿性关节炎模型的炎症反应有抑制作用7。 南蛇藤中含有大量卫矛醇，其合成物二溴卫矛醇在体内能通过脱去溴化氢，形成双环氧结构发挥药效作用。 环氧结构作为缺电子体在体内可以与生物大分子如DNA RNA或某些重要的酶类 中含丰富电子的基团如氨基、巯基、羧基、磷酸基等 发生共价结合，使其丧失活性或使DNA分子发生断裂。 这类结构属于生物烷化剂类抗肿瘤药。 二溴卫矛醇和脱水卫矛醇在临床上主要用于慢性粒细胞白血病的治疗，对某些实体瘤，如胃癌、肺癌和乳腺癌等肿瘤有一定的疗效。 脱水卫矛醇对白血病L1210的效果比二溴卫矛醇强3倍，并能通过血脑屏障，对支气管肺癌、肾癌、胃肠道及泌尿道肿瘤有效23。 南蛇藤中含有较少量南蛇藤素，和较大量的扁蒴藤素。 南蛇藤素具有抗炎、抗癌和抗生育作用，也有毒副作用，一般停药可恢复。 它对豚鼠精子的向前运动、获能、顶体反应和穿透去透明带仓鼠卵均有明显的抑制作用，强于乙酸棉酚24。 它的微摩尔级浓对多种细胞呈现毒性作用，而纳摩尔级浓度，对细胞无毒性25，只要注意使用 避免其毒副作用 它就可以为我们提供很多意想不到的效果26。 扁蒴藤素是南蛇藤素的结构类似物，同样具有抗氧化与抗肿瘤活性。 实验证明，扁蒴藤素在体外对白血病P388细胞，HL-60细胞以及乳癌细胞均有很强的抑制作用2728。 目前尚未报导南蛇藤中含有雷公藤甲素，因而毒性较小，安全范围更大，可开发为新的抗肿瘤药和可逆的男性避孕药。 3 广东药学院硕士研究生学位论文 RH 南蛇藤素 RCH3 扁蒴藤素 南蛇藤也是有毒中药，尚有山砒霜之称 服用后有胃肠道反应 表现为轻度的胃部不适、恶心、呕吐等，但其毒副作用比雷公藤小29。 其主要毒性成分为南蛇藤素和扁蒴藤素，宜煎煮 3.5 小时以上30。 据报导，其小鼠 ip 的 LD50 为 30-60 mg/kg2。 《潮汕青草药彩色全书》31载：“本品有毒，多吸易致恶习心呕吐，可饮麻油 30-60毫升解毒。 ”但此法还未见有现代研究证实。 1.5 中药治疗类风湿性关节炎的概况和展望 类风湿性关节炎rheumatoid arthritis RA是一种以关节滑膜慢性炎症为特征的自身免疫功能障碍性疾病是世界性的难治重大疾病之一。 其主要病理变化为关节的滑膜炎症、细胞浸润、滑膜翳形成 当累及软骨和骨质时 可导致关节结构的破坏、畸形和功能障碍。 由于发病机理不明，缺乏理想的治疗方法与药物筛选的理论指导，目前尚无特异性治疗 RA 的药物，发病率呈持续上升趋势。 西医西药治疗 RA，多采用非甾体类抗炎药物、肾上腺皮质激素、金制剂、抗代谢药物与免疫抑制剂等32，33，虽可缓解病情特别是控制急性期症状，但均不能改变病情，即不能阻止与减低关节的侵蚀程度和持久改善功能，从而逆转病理改善直至痊愈。 并且由于药物的毒副作用，如肾毒性、肝毒性等往往病人难以接受，被迫停药。 中医中药治疗类风湿性关节炎则以祛风除湿、活络通痹等为治疗原则，辨证论治。 某些单味药、复方一直用于 RA 的临床治疗，如雷公藤、昆明山海棠、清风藤、乌头汤、桂枝芍药知母汤、蠲痹汤等，临床应用效果良好，其中以雷公藤的研究最多。 雷公藤，为卫矛科雷公藤属植物雷公藤（Tripterygium wilfordii level. Hook.f.）有清热解毒，舒筋活血通结，消肿止痛，杀虫止痒之功。 作用类似并优于激素，长于治疗类风湿性关节炎、肾炎及多种皮肤病，其抗肿瘤、抗生育作用亦很显著34。 然而雷公藤有大毒，特别是对肝脏、心血管系统、泌尿系统、生殖系统、消化系统 4 广东药学院硕士研究生学位论文及神经系统有很大的毒副作用以及致突变作用，中毒死亡率高达 29.635。 其毒性与剂量呈平行关系，常规剂量服用，副作用发生率约为 36.7 34。 雷公藤含有多种活性成分，包括雷公藤甲素和南蛇藤素。 其中雷公藤甲素既是主要有效成分，又是主要毒性成分，且活性最高，纳克级就能产生药效和毒性，它的构效关系特殊，产生药效的结构同时也是产生毒性的结构，仅仅依靠炮制的方法来提高疗效和降低毒性是难以凑效的36，因而寻找高效低毒的替代药也显得非常重要。 与雷公藤同科同属的昆明山海棠，常作为雷公藤的替代药材用于临床。 它所含成分与雷公藤相似，都含有雷公藤甲素和南蛇藤素，只是雷公藤甲素的含量甚微，仅为雷公藤的十分之一，因而其毒性比雷公藤小，但服用剂量过大可致中毒，甚至循环衰竭或呼吸停止而死亡37，这些都限制了它在临床中的应用。 南蛇藤中含有少量南蛇藤素及大量扁蒴藤素，尚未报导含有雷公藤甲素，因而与昆明山海棠相比，南蛇藤的毒性更小，安全范围更大。 南蛇藤素的安全范围比雷公藤甲素大得多， 近几年随着 RA 发病机制的研究进展，中医药研究也从单纯的疗效及抗炎、镇痛研究，发展到免疫机制调节等的研究，而且取得了很大进展。 RA 作为一种致残性疾病，严重影响患者的生活质量。 中医药治疗本病具有独特优势，如能在临床实践基础上，对临床确有良效的中药进行系统性、前瞻性研究，中医药治疗 RA 将会取得更大进展32。 1.6 本课题的研究内容及意义 南蛇藤在国内分布广，野生资源丰富，且其抗炎和抗肿瘤活性成分含量大，毒性比雷公藤属的植物小，具有良好的开发价值。 本课题研究的主要目标就是采用现代化的手段对南蛇藤进行生药学研究，为南蛇藤的鉴别提供可靠依据；采用液相色谱技术建立南蛇藤的抗炎活性成分卫矛醇的含量测定方法，并以抗肿瘤成分扁蒴藤素为参照，建立南蛇藤的液相指纹图谱，又以光谱技术建立南蛇藤的红外宏观指纹图谱，为今后控制南蛇藤药材的质量提供理论依据。 我们研究南蛇藤的指纹图谱就是为了深入探讨南蛇藤的品质评价标准，以便日 5 广东药学院硕士研究生学位论文后开发出具有一定经济与社会意义的产品、使它们能在多种领域中有着更加广阔的前景，并对开发抗肿瘤药、可逆避孕药及雷公藤替代药提供一个可探索的途径。 6 广东药学院硕士研究生学位论文 第二章 南蛇藤生药学研究 2.1 仪器与材料 2.1.1 仪器 滑走切片机、显微镜、层析缸、薄层板、点样毛细管、紫外分析仪。 2.1.2 材料 南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb）药材（采自广东省乳源县城郊，经广东药 学院中药学院药用植物与中药鉴定教研室李书渊教授鉴定） 2.1.3 试药与试液 95乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、硝酸、盐酸（以上 试剂均为分析纯，广州化学试剂厂生产）；卫矛醇对照品（购自德宝生化），扁蒴藤 素对照品（自制）；66硫酸、稀.