GB14755-2010食品安全国家标准 食品添加剂 维生素D 2 （麦角钙化醇）

中华人民共和国国家标准 GB 14755—2010 中华人民共和国卫生部 发布 2010-12-21 发布 2011-02-21 实施 食品安全国家标准 食品添加剂 维生素 D2（麦角钙化醇） GB 14755-2010 I 前 言 本标准代替 GB 14755—1993《食品添加剂 维生素 D2》。 本标准与 GB 14755—1993 相比，主要变化如下： ——增加了红外光谱鉴别； ——维生素 D2 的测定系统适用性试验所用样品由维生素 D2 改为维生素 D3，高效液相色谱含量测定 方法由内标法改为外标法； ——洋地黄皂苷试验检查麦角甾醇修改为薄层色谱法； ——增加了还原性物质指标和试验方法； ——增加了重金属指标和试验方法； ——增加了砷指标和试验方法。 本标准的附录 A 和附录 B 为性附录，附录 C 为性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB 14755-1993 GB 14755-2010 1 食品安全国家标准 食品添加剂 维生素 D2（麦角钙化醇） 1 范围 本标准适用于以麦角甾醇为原料制得的食品添加剂维生素 D2。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 化学名称、分子式、结构式和相对分子质量 3.1 化学名称 9,10-开环麦角甾-5,7,10（19）,22-四烯-3β-醇 3.2 分子式 C28H44O 3.3 结构式 CH2 HO CHCH H3C CH3 CHCH CH3 CH(CH3)2 3.4 相对分子质量 396.66（按 2007 年国际相对原子质量） 4 技术要求 4.1 感官要求：应符合表 1 的。 表 1 感官要求 项 目 要 求 检验方法 色泽 无色或白色 取适量样品置于清洁、干燥的试管中，在自然光 线下，观察色泽和组织状态，嗅其气味。 气味 无臭 组织状态 针状结晶或结晶性粉末 4.2 理化指标：应符合表 2的规定。 GB 14755-2010 2 表 2 理化指标 项目 指标 检验方法 维生素 D2（C28H44O）,/ % 98.0～103.0 附录A中A.4 麦角甾醇，w /% ≤ 0.2 附录A中A.5 比旋光度αm(20℃,D)/〔( º)·dm2· kg-1〕 +102.0～ +107.0 附录A中A.6 质量吸收系数α （265nm）/（L/cm·g） 46～49 附录A中A.7 还原性物质 （四唑蓝显色试验），w /% ≤ 0.002 附录A中A.8 砷（As）/(mg/kg) ≤ 2 附录A中A.9 重金属（以Pb计）/(mg/kg) ≤ 20 附录A中A.10 GB 14755-2010 3 附 录 A （规范性附录） 检验方法 A.1 安全提示 本标准试验方法中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，按相关规定操作，使用时需小心谨慎。若 溅到皮肤上应立即用水冲洗，严重者应立即治疗。在使用挥发性酸时，要在通风橱中进行。 A.2 一般规定 本标准所用试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和 GB/T 6682—2008 中规 定的三级水。 试验方法中所用杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按 GB/T 602 、 GB/T 603 之规定制备。 A.3 鉴别试验 A.3.1 醋酐浓硫酸呈色试验 A.3.1.1 试剂和材料 A.3.1.1.1 三氯甲烷。 A.3.1.1.2 乙酸酐。 A.3.1.1.3 硫酸。 A.3.1.2 分析步骤 取约0.5 mg实验室样品，加5 mL三氯甲烷溶解后，加0.3 mL醋酐与0.1 mL硫酸，振摇，初显黄色， 渐变红色，迅即变为紫色，最后变为绿色。 A.3.2 红外光谱试验 采用溴化钾压片法，按照 GB/T 6040 进行试验，实验室样品的红外光谱应与对照的图谱一致（对 照图谱见附录 B）。 A.4 维生素D2 的测定 A.4.1 方法提要 用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，通过色谱柱使样品分离，用紫外吸收检测器检测， 用外标法定量，计算样品中维生素 D2 的含量。 A.4.2 试剂和材料 A.4.2.1 正戊醇：色谱纯。 A.4.2.2 正己烷：色谱纯。 A.4.2.3 异辛烷：色谱纯。 A.4.2.4 维生素D2对照品。 GB 14755-2010 4 A.4.2.5 维生素D3对照品。 A.4.3 仪器和设备 高效液相色谱仪（HPLC）。 A.4.4 色谱分析条件 推荐的色谱柱及典型色谱操作条件见表 A.1，维生素 D3 系统适用性试验高效液相色谱图参见图 C.1，各组分的相对保留时间参见表 C.1。其他能达到同等分离程度的色谱柱和色谱条件均可使用。 表 A.1 色谱柱和典型色谱操作条件 色谱柱 柱长 250mm，柱内径 4.6mm，硅胶色谱柱 流动相 正己烷-正戊醇 （1000+3） 流速 2 mL/min 检测器检测波长 254 nm A.4.5 分析步骤 A.4.5.1 维生素D3对照品系统适应性试验贮备液的制备 称取约 25 mg 维生素 D3对照品，精确至 0.000 1 g，置 100 mL 棕色容量瓶中，加 80 mL 异辛烷， 用超声处理助溶 1min，避免加热，使完全溶解，再加异辛烷至刻度，摇匀充氮密塞，避光，0℃以下 保存。 A.4.5.2 实验室样品溶液的制备 称取约 25 mg 实验室样品，精确至 0.000 1 g，置 100 mL 棕色容量瓶中，加 80 mL 异辛烷，用 超声处理助溶 1min，避免加热，使完全溶解，再加异辛烷至刻度，摇匀。量取 5 mL±0.05 mL 上述 溶液，置 10 mL 棕色容量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 A.4.5.3 维生素D2对照品溶液的制备 称取约 25 mg 维生素 D2对照品，精确至 0.000 1 g，置 100 mL 棕色容量瓶中，加 80 mL 异辛烷， 用超声处理助溶 1min，避免加热，使完全溶解，再加异辛烷至刻度，量取上述溶液 5 mL±0.05 mL， 置 10 mL 棕色容量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 A.4.5.4 系统适用性试验 以硅胶为填充剂的色谱柱，正己烷-正戊醇（1000+3）为流动相，检测波长254 nm，流速约为2 mL/min。量取维生素D3对照品贮备溶液5 mL，置具塞玻璃容器中，充氮后密塞，置90℃水浴加热1h， 取出迅速冷却，加正己烷5 mL±0.05 mL，摇匀，置1 cm具塞石英吸收池中，在2支主波长分别为254 nm 和365 nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°，并距灯管5 cm～6 cm，照射5min，使溶液中含有 前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3。取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D3的峰 值，先后进样5次，相对标准偏差应不大于2.0%，前维生素D3（与维生素D3的比保留时间为0.5）与 反式维生素D3（与维生素D3的比保留时间约为0.6）以及维生素D3与速甾醇D3（与维生素D3的比保留 时间约为1.1）的峰分离度均应大于1.0。 A.4.5.5 测定 取20μL实验室样品溶液注入液相色谱仪, 色谱图，另取维生素D2对照品溶液，同法测定。 按外标法以峰面积计算出供试品中维生素D2的含量。 A.4.6 结果计算 GB 14755-2010 5 根据色谱图计算维生素D2的质量分数w1，数值以%表示，按公式(A.1)计算 1 21 1 2 100%m Aw A m ×= ×× ………………………………（A.1） 式中： 1m ——对照品溶液中维生素D2的进样量的数值，单位为微克（μg）； 2A ——实验室样品溶液中维生素D2的峰面积的数值； 1A ——对照品溶液中维生素D2的峰面积的数值； 2m ——实验室样品溶液中维生素D2的进样量的数值，单位为微克（μg）。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定的允许绝对差不大于 1.5 %。 A.5 麦角甾醇的测定 A.5.1 方法提要 将维生素 D2 溶液点样于薄层板上，经展开，显色后，所得的色谱图与对照品溶液按同法所得的 色谱图作对比，对维生素 D2 进行杂质检查。 A.5.2 试剂和材料 A.5.2.1 角鲨烷氯仿溶液：10 g/L。 A.5.2.2 展开剂:环己烷-乙醚（1+1）。 A.5.2.3 维生素D2对照品。 A.5.2.4 麦角甾醇对照品。 A.5.3 分析步骤 A.5.3.1 对照品溶液的配制 称取约 50 mg 维生素 D2对照品，精确至 0.000 2 g，用 1 mL 角鲨烷氯仿溶液溶解，得对照品溶 液。 A.5.3.2 实验室样品溶液的配制 称取约50 mg维生素D2实验室样品，精确至0.000 2 g，用1 mL角鲨烷氯仿溶液溶解，得实验室样 品溶液。 A.5.3.3 麦角甾醇对照溶液的配制 称取约5 mg麦角甾醇对照品，精确至0.1 mg，置于50 mL容量瓶中，加角鲨烷氯仿溶液40 mL溶 解并稀释至刻度，摇匀。 A.5.3.4 显色剂的配制 取1.0 g三氯化锑，加20 mL乙酰氯溶解。 A.5.3.5 测定 分别取10 μL对照品溶液、实验室样品溶液及麦角甾醇对照溶液，分别点于以羧甲基纤维素钠为 粘合剂的硅胶G 薄层板上，用展开剂暗处展开，晾干，用显色剂显色。实验室样品溶液与对照品溶 液的主斑点Rf值及颜色应一致，实验室样品溶液的杂质斑点不得深于麦角甾醇对照溶液相应的斑点。 A.6 比旋光度的测定 GB 14755-2010 6 A.6.1 试剂和材料 无水乙醇。 A.6.2 仪器和设备 旋光仪。 A.6.3 分析步骤 取实验室样品适量，精确至0.000 2 g，加无水乙醇制成1 mL中约含40 mg的溶液，其他按GB/T 613-2007规定的方法进行。（注：在溶液配制后30min内测定）。 A.6.4 结果计算 比旋光度аm(20℃,D)按公式(A.2)计算： ( )20 ,m C D l αα ρ∂° = × ……………………………………………(A.2) 式中： α —— 测得的旋光角,单位为度(°)； l —— 旋光管的长度,单位为分米(dm)； αρ —— 溶液中有效组分的质量浓度,单位为克每毫升(g/mL)。 A.7 质量吸收系数的测定 A.7.1 试剂和材料 无水乙醇。 A.7.2 仪器和设备 紫外分光光度仪。 A.7.3 分析步骤 称取实验室样品适量，精确至0.000 2 g，加乙醇制成每1 mL中约含10 μg样品的溶液，按照GB/T 9721 在265 nm±1 nm的波长处测定吸光度A，求其质量吸收系数。 A.7.4 结果计算 根据吸光度A计算维生素D2的质量吸收系数α ，数值以 ( º)·dm2· kg-1表示，按公式(A.3)计算： A b α α ρ= × …………………………(A.3) 式中： A——样品溶液的吸光度的数值； b ——光路长度（即吸收池厚度）的数值，单位为厘米（cm）； αρ ——实验室样品溶液的质量浓度的数值，单位为克每升（g/L）。 A.8 还原性物质的测定 A.8.1 方法原理 GB 14755-2010 7 还原性物质在强碱性溶液中能将四唑蓝还原为有色甲月替（formazan），与对甲二酚无水乙醇还 原物质的标准溶液颜色比较做限量检查。 A.8.2 试剂和材料 A.8.2.1 无水乙醇。 A.8.2.2 甲醇。 A.8.2.3 冰乙酸。 A.8.2.4 四唑蓝甲醇溶液：50 mg/mL。 A.8.2.5 羟化四甲铵溶液：羟化四甲铵水溶液(100 g/L) -无水乙醇（1+9）。 A.8.2.6 对甲二酚无水乙醇溶液：0.2 μg/mL。 A.8.3 分析步骤 A.8.3.1 实验室样品溶液的制备 称取约0.1 g实验室样品，精确至0.001 g，溶解于无水乙醇中，稀释至10 mL，加入0.5 mL四唑蓝 甲醇溶液和0.5 mL羟化四甲铵溶液，静置5min，加入1.0 mL冰乙酸，摇匀。 A.8.3.2 对照溶液的制备 量取10 mL±0.05 mL 0.2 μg/mL对甲二酚无水乙醇溶液，加入0.5 mL四唑蓝甲醇溶液和0.5 mL羟 化四甲铵溶液，静置5min，加入1.0 mL冰乙酸，摇匀。 A.8.3.3 空白溶液的制备 取 10 mL 无水乙醇，加入 0.5 mL 四唑蓝甲醇溶液和 0.5 mL 羟化四甲铵溶液，静置 5min，加入 1.0 mL 冰乙酸，摇匀。 A.8.3.4 测定 在525 nm波长处，用空白溶液调零，分别测定实验室样品溶液与对照溶液的吸光度，实验室样 品溶液的吸光度不得大于对照溶液。 A.9 砷的测定 取5 g±0.01 g实验室样品，用干灰化法处理样品。取相同量的氧化镁、硝酸镁与试样同法处理， 做试剂空白试验。量取10 mL±0.05 mL砷标准溶液（含砷2.0μg），同法处理，制备砷限量标准。按 GB/T5009.76—2003砷斑法的规定进行。 A.10 重金属的测定 A.10.1 试剂和材料 A.10.1.1 硝酸。 A.10.1.2 硫酸。 A.10.1.3 盐酸。 A.10.1.4 甘油。 A.10.1.5 乙酸铵。 A.10.1.6 硝酸铅。 A.10.1.7 硫代乙酰胺。 A.10.1.8 氨试液：400→1000。 GB 14755-2010 8 A.10.1.9 氢氧化钠溶液：c（NaOH）=1 mol/L。 A.10.1.10 盐酸溶液：c（HCl）=2 mol/L。 A.10.1.11 盐酸溶液：c（HCl）=7 mol/L。 A.10.1.12 氨水溶液：c（NH3·H2O）=5 mol/L。 A.10.1.13 酚酞指示液：10g/L乙醇溶液。 A.10.1.14 乙酸盐缓冲液（pH3.5）：取25 g 乙酸铵，加水25 mL溶解后，加7 mol/L盐酸溶液38 mL， 用2 mol/L盐酸溶液或氨水溶液准确调节pH至3.5（pH计），用水稀释至100 mL。 A.10.1.15 硫代乙酰胺试液：取4 g硫代乙酰胺，精确至0.01 g，加水使溶解成100 mL，置冰箱中保 存。临用前取5.0 mL混合液（由1 mol/L 15 mL氢氧化钠溶液、5.0 mL水及20 mL甘油组成），加上述 1.0 mL硫代乙酰胺溶液，置水浴上加热20s，冷却，立即使用。 A.10.1.16 铅标准溶液：称取0.160 g硝酸铅，精确至0.000 2g,置于1000 mL容量瓶中，加5 mL硝酸 与50 mL水溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前，移取（10±0.02）mL贮备液， 置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL相当于10 µg的Pb）。配置与贮存用的 玻璃仪器均不得含铅。 A.10.2 分析步骤 按《中华人民共和国药典》2005年版二部 附录Ⅷ H 重金属检查法第二法，具体方法如下： 取 1 g ±0.01 g 实验室样品，缓缓灼烧至完全炭化，放冷，加 0.5 mL～1.0 mL 硫酸，使恰湿润， 用低温加热制硫酸除尽后，加 0.5 mL 硝酸，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，在 500 ℃±50 ℃炽 灼至完全灰化，放冷，加 2 mL 盐酸，置水浴上蒸干后加 15 mL 水，滴加氨试液至对酚酞指示液显 中性，再加 2 mL 乙酸盐缓冲液（pH3.5），微热溶解后，移置纳氏比色管甲管中，加水稀释成 25 mL； 另取配制实验室样品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加 2 mL 乙酸盐缓冲液（pH3.5）与 15 mL 水， 微热溶解后，移置纳氏比色管乙管中，加 2 mL±0.02 mL 标准铅溶液，再用水稀释成 25 mL；再在甲 乙两管中分别加 2 mL 硫代乙酰胺试液，摇匀，放置 2min，同置白纸上，自上向下透视，甲管中显 示的颜色与乙管比较，不得更深。 GB 14755-2010 1 附 录 B （规范性附录） 维生素D2红外光谱图 注：引自《药品红外光谱集》第一卷（1995） 图B.1 维生素D2红外光谱图 GB 14755-2010 1 附 录 C （资料性附录） 系统适用性试验高效液相色谱图和相对保留时间 图 C.1 系统适用性试验高效液相色谱图 表 C.1 各峰保留时间和相对保留时间 峰序 组分名称 相对保留时间 1 溶剂峰 — 2，3 未知峰 — 4 前维生素 D3 0.54 5 反式维生素 D3 0.60 6 维生素 D3 1.00 7 速甾醇 D3 1.11 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