药物依赖性研究技术指导原则

药物依赖性研究技术指导原则 - 1 - 一、概述……………………………………………………………1 二、基本原则………………………………………………………2 （一）实验管理……………………………………………………2 （二）具体问具体分析…………………………………………2 （三）整体性………………………………………………………2 （四）试验……………………………………………………2 三、基本内容………………………………………………………2 （一）适用范围……………………………………………………2 （二）受试物………………………………………………………3 1、中药、天然药物 ………………………………………………3 2、化学药物 ………………………………………………………3 （三）试验系统……………………………………………………4 1、选择试验系统的依据………………………………………………4 2、实验动物…………………………………………………………4 3、离体试验系统……………………………………………………4 （四）给药剂量……………………………………………………4 （五）给药途径……………………………………………………5 （六）对照组………………………………………………………5 （七）试验要求……………………………………………………5 1、神经药理学试验…………………………………………………5 2、躯体依赖性试验…………………………………………………6 - 2 - 3、精神依赖性试验…………………………………………………7 4、体外依赖性试验…………………………………………………8 （八）依赖性研究项目的选择………………………………………9 （九）依赖性研究的阶段性……………………………………………9 （十）结果分析与评价………………………………………………9 四、参考文献………………………………………………………10 五、附录……………………………………………………………11 （一）躯体依赖性试验 …………………………………………11 1、小鼠跳跃试验（催促戒断试验）…………………………………11 2、大鼠体重减轻试验（自然或催促戒断试验）……………………11 3、大鼠替代试验（替代试验、交叉躯体依赖性试验）……………12 4、大鼠攻击试验（自然或催促戒断试验）……………………13 5、戒断症状的记分评定（自然或催促戒断试验）…………………14 （二）精神依赖性试验 …………………………………………14 1、自身给药试验……………………………………………………14 2、大鼠药物辨别试验 …………………………………………16 3、条件位臵偏爱试验 …………………………………………16 - 3 - 药物依赖性是指药物长期与机体相互作用，使机体在生理机能、 生化过程和/或形态学发生特异性、代偿性和适应性改变的特性，停止用药可导致机体的不适和/或心理上的渴求。依赖性可分为躯体依赖性和精神依赖性。躯体依赖性主要是机体对长期使用依赖性药物所 产生的一种适应状态，包括耐受性和停药后的戒断症状。精神依赖性 是药物对中枢神经系统作用所产生的一种特殊的精神效应，表现为对 药物的强烈渴求和强迫性觅药行为。依赖性倾向可以在动物或人体的 药物研究过程中反映出来。 躯体依赖与精神依赖可能同时存在，也可能有分离，如兴奋剂通 常表现为精神依赖，躯体戒断症状并不明显。 耐受性和敏感性（敏化）是中枢神经系统适应性改变的两种不同 表现形式。耐受性是指反复使用某种药物以后，机体对药物的敏感性 降低，需增大剂量才能产生原有的效应。与耐受性相反，敏化是指在 反复使用药物以后，机体对药物的敏感性提高，药物的效应增强。成 瘾药物敏化现象表现为行为反应和自主性觅药动机增强。 目前已知可产生依赖性的化合物主要有阿片类、可卡因、苯丙胺 类、大麻类、苯二氮卓类和巴比妥类及某些甾体激素类等。 本指导原则的目的，是为在药物研发过程中进行动物潜在依赖性 研究时提供技术指导。非临床药物依赖性研究可为临床提供药物依赖 性倾向的信息，获得的非临床试验数据有利于指导临床研究和合理用 - 1 - 药，警示滥用倾向。 本技术指导原则适用于中药、天然药物和化学药等新药的依赖性 研究。 （一）实验管理 依赖性研究是药物非临床安全性研究的一部分，根据《中华人民 共和国药品管理法》，必须执行“药物非临床研究质量管理”。 （二）具体问题具体分析 中药、天然药物和化学药等的情况复杂，本文所提及的内容不可 能涵盖所有中药、天然药物和化学药依赖性试验的全部内容，依赖性 研究应遵循“具体问题具体分析”的原则。 （三）整体性 药物的研发是一个连续的、渐进的系统工程，依赖性试验是药物 开发的一个有机组成部分。依赖性研究应结合该受试物的药学、药动 学、药效学、一般药理学及毒理学试验结果综合分析与评价。 （四）试验设计 试验设计应符合随机、对照、盲法和可重复性的原则。 （一）适用范围 1、与已知具有潜在依赖性化合物结构相似的新的化合物； 2、作用于中枢神经系统，产生明显的镇痛、镇静、催眠及兴奋 作用的药物； - 2 - 3、复方中含有已知较强依赖性成分的药物； 4、直接或间接作用于中枢阿片受体、大麻受体、多巴胺受体、 去甲肾上腺素受体、5-羟色胺受体、N-胆碱受体、γ-氨基丁酸受体、 苯二氮卓受体等受体的药物； 5、已知代谢物中有依赖性成份； 6、拟用于戒毒的药物； 7、原认为不具依赖性，而在临床研究或临床应用中发现有依赖 性倾向的药物。 （二）受试物 1、中药、天然药物 依赖性试验拟用受试物应能充分代表拟临床试验受试物或拟上 市药品，因此该受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试用质量 规定的样品，并附有研制单位的自检报告。一般采用中试样品，并注 明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方 法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容量或给 药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应 标明批号、规格及生产厂家。 2、化学药物 依赖性试验的受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标 准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、 保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶 媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。 - 3 - （三）试验系统 1、选择试验系统的依据 为了获得科学有效的依赖性信息，应选择最适合的动物模型或其 他试验系统。选择试验系统的因素包括试验系统的药效学反应，如敏 感性、特异性和重现性；受试物的背景资料，如药效学、药代动力学 等特点；试验动物的种属、品系、性别和年龄等。如果选择特殊的试 验系统，应说明原因。 2、实验动物 常用实验动物包括小鼠、大鼠、猴等，一般情况下选用雄性动物， 必要时增加雌性动物。通常选用大、小鼠，对于高度怀疑具有致依赖 性潜能的药物，而啮齿类动物试验结果为阴性，则应选择灵长类动物。 动物应符合国家有关规定的等级要求。 3、离体试验系统 离体试验系统可用于支持性研究（如研究药物的活性特点和作用 机理）。常用离体试验系统主要包括：离体器官、组织、细胞、亚细 胞器、受体、离子通道和酶等。 （四）给药剂量 依赖性研究应在一个较宽的剂量范围内进行，可根据不同的试验 方法和目的选择不同的给药剂量。一般采用主要药效ED的倍数递增50 或最小有效剂量的倍数递增，同时结合药物的溶解性、毒性及对运动 功能、学习能力和记忆能力的影响来设计剂量。每个试验至少应设三 个剂量组。 - 4 - （五）给药途径 原则上给药途径应和临床一致，尽可能增加静脉给药途径。由于 模型的选择或者考虑到以后可能的非临床滥用的不同给药途径，也可 考虑增加其他给药途径。 （六）对照组 应设立阳性对照和溶媒对照组，如受试物需采用特殊的溶媒溶 解，还应增设空白对照。如果受试物为较纯的单一化合物，与其母核 结构类似的化合物具有明显的依赖性，则还应选择此化合物为阳性对 照药。 （七）试验要求 药物依赖性研究一般包括神经药理学试验、躯体依赖性试验和精 神依赖性试验三部分内容。 1、神经药理学试验 如有早期的体外依赖性试验，所获阳性试验结果还应通过体内研 究来进一步确认（除1.1的情况外）。可利用神经药理学方法，对行为学效应和神经递质进行测定，初步判断受试物有无依赖性倾向，这 些内容可通过药效学试验、一般药理学试验或毒理学试验进行观察， 具体方法不再列出。 1．1一般情况下，充分揭示药物的药理特性之后，还需要进行 进一步潜在躯体依赖性和精神依赖性的研究。同时出现下述三种情况 除外： （1）在有效浓度范围内，药物与依赖性相关的分子靶点无相互 - 5 - 作用，或者虽然观察到药物与相关靶点的结合，但这种结合不会引起 相应的功能变化。 （2）体内研究结果未显示出潜在依赖性。 （3）未发现此药物具有可能与依赖有关的新的作用机制。 1．2当潜在依赖性的类别和程度已经从体外试验中充分暴露出 来（例如一个完全μ受体激动剂），就不需再进行进一步的研究。 1．3如果发现此药物有可能与依赖有关的新的作用机制，则需 要作进一步的研究。 2、躯体依赖性试验 各种有依赖潜力的药物产生躯体依赖症状不同，没有理想的反映 躯体依赖性的单一指标，所以需要多种指标来综合评价。生理指标可 采用体重、体温、呼吸、摄食量等；在行为学试验中，可采用反映运 动功能、学习能力、记忆能力和动机行为改变的指标。指标选择的标 准为：适宜在给药前、给药期间和给药后进行动态观察，从而有利于 描述机体产生的耐受及敏化的程度、特征及发展过程。 2．1方法 评价药物躯体依赖性的一般试验方法有三种：自然戒断试验、催 促戒断试验、替代试验。无论是自然戒断还是催促戒断，动物都会出 现一系列程度不同的表现，但不是所有戒断症状在一个受试动物身上 都能出现。由于每种方法观察的指标都不相同，可结合药效学、一般 药理学表现选择适当的方法。结合我国的具体情况，可以采用： 小鼠自然戒断试验 - 6 - 小鼠催促戒断试验 大鼠自然戒断试验 大鼠催促戒断试验 大鼠替代试验 小鼠替代试验 猴自然戒断试验 猴催促戒断试验 也可采用其他的方法，但需加以说明。 2．2戒断反应观察主要注意事项 a.给药剂量、频率和周期应该使动物产生神经适应性反应。 b.戒断反应的观察应该有足够时间和频度，并且注意给药前后的 自身比较。 c．自然戒断和催促戒断两种方式都需进行，但可在不同动物模 型上进行。 d. 尽可能采用仪器检测的客观指标。 e. 有依赖性的药物在戒断后往往表现出反跳现象（急性药理学 作用相反的症状），在选择观察指标时加以注意。 3、精神依赖性试验 具有精神依赖性的药物能促使用药者周期性或连续性地出现感 受欣快效应的用药渴求，但这是一种主观体验，只能间接用药物所导 致的动物行为改变来反映。常选用的方法有：自身给药试验、药物辨 别试验、条件性位臵偏爱试验、行为敏化试验。 - 7 - 3．1方法 猴自身给药试验 大鼠自身给药试验 大鼠条件性位臵偏爱试验 小鼠条件性位臵偏爱试验 大鼠药物辨别试验 小鼠行为敏化试验 大鼠行为敏化试验 也可采用其他的方法，但需加以说明。 3．2精神依赖性研究主要注意事项： c.在自身给药试验中需要注意药物毒副作用相关的无应答期（动 物表现出觅药行为之前的一段时间）、增加剂量的时间点和替代的程序。 d.自身给药试验中，尽可能结合躯体依赖性试验结果，设计合适 的剂量，并至少变换三次剂量。 e.在条件性位臵偏爱实验中应使用平衡的实验设计，避免动物天 然倾向性影响。 4、体外依赖性试验 （八）依赖性研究项目的选择 为了获得足够的药物依赖性信息，药物依赖性研究内容的选择需 要参考药效学、一般药理学及其他毒理学试验结果，同时至少应进行 躯体依赖性试验（自然戒断和催促戒断）和一项精神依赖性试验。有 - 8 - 强烈精神活性并拟用于改变精神神经活动的药物，应有灵长类动物试 验数据。 （九）依赖性研究的阶段性 1、对于可能存在依赖性的单一化合物： 体内神经药理学研究应该在?期临床试验前完成。在早期非临床 或临床研究中观察到的安全性信息可以为进一步非临床依赖性研究 提供参考。更进一步的躯体依赖性和精神依赖性试验观察应在?期临 床试验开始前完成。必要时需进行体外试验和依赖性的机理探讨。 2、对于中药有效部位或中药复方制剂： 中药有效部位或中药复方制剂成份复杂，作用靶点多，体外试验 结果参考意义有限。体内神经药理学研究结果对于判断是否具有依赖 性有一定的意义，但其结果的评价往往有较大的难度和局限。体内依 赖性试验应作为中药有效部位或中药复方制剂依赖性考察的主要方 法。 对于需进行药物依赖性研究的中药有效部位或中药复方制剂，应 在?期临床开始前提供全面的体内依赖性试验的相关数据。 （十）结果分析与评价 在对所得到的非临床试验数据进行分析与评价时，一般应从以下 几方面进行考虑： 1、统计学差异与生物学差异的问题。统计学差异可判断受试物 对考察的试验结果是否存在影响，但由于样本数的限制，有时可能掩 盖真正的生物学差异，故样本数应足够充分，同时，还应注意对每个 - 9 - 样本试验结果进行分析。对于统计学上的差异，还应结合动物的正常 反应加以分析。 2、阳性药的选择。尽可能选择结构相似和/或作用机理相似的合适阳性药。 3、对动物异常行为出现的时间、持续时间及作用强度的观察。 4、所选择的动物是否合适，模型是否可靠。 5、分析所选择指标的灵敏性、特异性和可靠性。 6、对具体试验结果进行评估及整体评估。 7、比较产生依赖性的剂量与有效剂量、中毒剂量的关系。 8、分析是否存在耐受性，及耐受与依赖的关系。 9、根据药物拟定的适应症、有效性，综合分析继续进行临床研 究的可行性。 总之，在对药物潜在依赖性风险评估中，应充分利用所有的非临 床研究数据，并结合药学、药理学和临床研究信息，进行科学客观的 分析和综合评价，以判断是否具有潜在依赖性。 药物依赖性试验，新药（西药）临床前研究指导原则汇编（药学、 药理学、毒理学）。中华人民共和国卫生部药政局，1993:219-221 药物依赖性试验，徐叔云主编，药理实验方法学，第三版，人民 卫生出版社。北京，2002：251-258 Guideline on the Non-Clinical Investigation of Dependence Potential of Medicinal Products. EMEA, 2006 - 10 - （一）躯体依赖性试验 1、小鼠跳跃试验（催促戒断试验） (1)原理：短期内重复大剂量给药，然后注射阿片受体拮抗剂， 如受试物属于阿片类药物，则动物发生跳跃反应，跳跃次数可反应依 赖性程度。 (2)动物：健康小鼠。 (3)实验步骤：药物剂量常按递增法，有时也配合采用恒量法， 给药总量可按镇痛ED的倍数计算。连续给药数天（根据药物镇痛作50 用的强弱确定给药时间），末次药后2h（以吗啡为例）腹腔注射纳络 酮，观察30min内的跳跃动物数及跳跃次数，还可观察1h内的小鼠体重减轻程度。 2、大鼠体重减轻试验（自然或催促戒断试验） (1)原理：阿片类药物的戒断症状出现后，大鼠体重减轻，但非 阿片类镇痛药和镇静催眠药则无明显作用。阿片类戒断后大鼠体重急 剧下降，以戒断后24-48h最明显，是考察阿片类身体依赖性的较好 指标。 (2)动物：健康大鼠。 (3)实验步骤：自然戒断试验每天早、晚相同时间测定大鼠体重， 每次测重后按体重给药，每天2次，连续给药数周。剂量根据LD50 和ED及给药途径制定。末次给药后每隔一定时间测量体重1次，比50 较停药后不同时间的体重变化。（按体重给药，每天2-3次，连续给 - 11 - 药4周。剂量根据LD和ED及给药途径制定。原则低剂量应高于药5050 效学有效剂量，高剂量应尽可能高，但不能出现毒性反应。末次药后 每天测量体重2-3次（与给药次数相同），计算平均值，比较停药前 后不同时间的体重变化。催促戒断试验以剂量递增法给药，连续给药 1周，末次药后2h注射拮抗剂，在2h内每隔30min测量体重1次，比较体重下降百分率。也可同时观察大鼠给药后行为变化和体温及自 发活动的变化情况，并以第1次给药至反复给药1周内为重要。 (4)结果评价：如戒断后大鼠体重急剧下降，则反应受试药具有 身体依赖性。 3、大鼠替代试验（替代试验、交叉躯体依赖性试验） (1)原理：阿片类药物都有基本相同的药理作用，给动物阿片类 药物并使之产生身体依赖性后停药，代之以受试药，观察动物是否发 生戒断症状。 (2)动物：健康大鼠。 (3)实验步骤：掺食法连续给以吗啡使动物产生身体依赖性，5天后以生理盐水、吗啡或不同剂量受试药代替，每8h给药1次，连续6次。替代前（基础值）及替代后每隔4h测定体重1次，计算各组大鼠的体重变化，比较替代药物组和吗啡依赖组之间的差异。 (4)结果评价：按等效镇痛ED的倍数计，比较达到同样替代程50 度的受试药的剂量和吗啡的剂量，可以确定受试药物的身体依赖性潜 力的强弱程度。对体内代谢迅速、皮下给药不易形成依赖性的药物， 用掺食法诱发依赖性可以获得较明确的结果。 - 12 - 4、大鼠攻击试验（自然或催促戒断试验） (1)原理：大鼠对阿片类药物形成依赖性后停药或用拮抗剂催 促，可发生戒断症状，易与同笼大鼠发生相互攻击（一般停药后72h 最明显，24h时极不明显；具有间断性的特点，可连续几小时甚至几 天）。 (2)动物：健康大鼠。 （3)实验步骤：按递增剂量给药，连续数天，如有依赖性，则 停药后大鼠出现体重减轻、摇体、眼睑下垂及扭体等戒断症状；此时 如将大鼠同居一笼，则出现嘶叫、对阵和相互攻击现象，甚至受伤致 死。一般于停药后第3天进行试验（将动物同居一笼），观察1h，记 录对阵时程和嘶叫，以及攻击和互咬次数。 (4)结果评价：本试验可反应吗啡成瘾后脑内多巴胺能神经系统 的功能。停药后戒断症状是多巴胺功能亢进的表现，多巴胺受体激动 剂可增强攻击反应。所以注意排除药物对多巴胺功能的干扰所产生的 假阳性或假阴性。 5、戒断症状的记分评定（自然或催促戒断试验） (1)原理：动物长期获得阿片类药物后，其中枢神经系统能产生 一种适应状态，停药或注射拮抗剂后机体出现一系列生理干扰现象即 戒断症状。对这些戒断症状的轻重程度进行综合评分即可判断药物的 身体依赖性潜力。 (2)动物：常用大鼠和猴。其中阿片类药物在猴上的依赖性表现 与人较接近，戒断症状比较明显且易于观察。 - 13 - (3)实验步骤：按剂量递增法并配合恒量法给药，也可用拮抗剂 纳络酮催促戒断。自然戒断或催促戒断后观察一系列戒断症状，根据 戒断症状的严重程度和持续时间进行综合评分。 (4)结果评价： 戒断症状的综合评分目前尚无统一标准，可对戒断症状进行全 面综合评分，也可对其中主要戒断症状进行综合评分。猴戒断症状可 分为轻、中、重、极重4个等级，每一等级的评分可根据症状种类的 多少和出现的频率定分，但不能大于级差分值。 依赖性潜力的大小可依据等效依赖性剂量来判断，即产生近似 依赖状态的剂量来判定，也可按相同的等效镇痛ED的倍数剂量来比50 较。 本方法同时也可进行替代试验。可在自然或催促戒断试验中观 察。 附录（二）精神依赖性试验 1、自身给药试验 (1)原理：药物的精神依赖性可产生对该药的渴求，对觅药行为 和用药行为具有强化效应。本试验模拟人的行为，通过压杆方式来获 得药物，反映药物的强化效应，可信度较高且可进行定量比较。 (2)动物：常用大鼠和猴。 (3)实验步骤： 动物麻醉后无菌条件下行静脉插管并用马甲背心固定，连接弹 簧保护套及转轴，弹簧套内硅胶管与插管相连，转轴使动物在笼内能 - 14 - 自由活动，转轴另一端与恒速注射泵及储药系统相连。术后常规抗感 染，恢复4-7天后进行踏板训练，使动物形成稳定的自身给药行为。 试验过程中注意保持套管畅通。如药物具有强化效应，动物经过短期 训练后产生稳定的自身给药行为，能自动踩压踏板接通注药装臵将药 物注入体内。 (4)结果评价： 通过观察是否形成自身给药行为来判断药物是否具有强化效 应；由于动物个体差异较大，建议将每只动物自身给药前后踏板次数 变化的百分率进行组间统计。 本试验中也可同时进行替代试验。 通过更换受试药的剂量，比较它们在等效ED倍数剂量条件下的踏板50 次数或比较产生类似踏板模式的药物剂量，即可反映受试药的精神依 赖性的强度。 本试验设计适用于静脉给药，实验中应注意药物稳定性和配药 时间的关系。如受试药为口服给药，则不需进行手术，而仅将每次踏 板的反应变为给一次口服制剂即可。 2、大鼠药物辨别试验 (1)原理：依赖性药物使人产生的情绪效应如欣快、满足感等， 属于主观性效应。具有主观性效应的药物可以控制动物的行为反应， 使之产生辨别行为效应。本试验可准确判断受试药是否属于阿片类药 物，以及产生精神依赖性潜力大小。 (2)动物：常用大鼠。 - 15 - (3)实验步骤： 利用辨别试验箱和训练程序训练动物正确压杆，然后通过辨别 训练训练动物产生稳定准确地辨别吗啡和生理盐水的能力。最后进行 替代试验，以不同剂量吗啡和受试药进行替代，观察压杆正确率与剂 量之间的关系，做出剂量-效应曲线，求得药物辨别刺激的半数有效剂量（ED，值越小精神依赖性潜力越大）。 50 (4)结果评价： 药物辨别刺激ED值越小反映精神依赖性潜力越大；如替代药50 物不产生训练药物反应，则说明该药不属于吗啡类药物。本试验不适 用于阿片类拮抗剂。由于药物辨别刺激并非完全基于药物滥用产生， 因此在评价药物精神依赖性潜力方面不如自身给药试验可信，但在药 物主观效应强度的定量比较方面有其优越性。由于动物训练周期较长 （一般3-4个月），试验中要注意耐受性的产生。 3、条件位臵偏爱试验 (1)原理：根据巴甫洛夫的条件反射学说，如果把奖赏刺激与某 个特定的非奖赏性条件刺激如某特定环境反复练习之后，后者便可获 得奖赏特性。反复几次将动物给药后放在一个特定的环境中，如药物 具有奖赏效应，则特定环境就会具有了奖赏效应的特性，动物在不给 药的情况下依然有对此特定环境的偏爱。 (2)动物：常用雄性大鼠或小鼠。 (3)实验步骤： 试验装臵为黑、白两个互通的盒子，中间有可活动的隔板隔开。 - 16 - 动物每天上午、下午（或隔天）分别给受试药和生理盐水各一次，给 生理盐水后将动物放入一侧盒子，给药后动物放入另一侧盒子，每次 在盒中停留30-40min，连续训练5天。第6天在固定时间不给药的情况下将动物放在黑、白盒之间的活动台上，同时用隔板将黑、白盒 半隔开。以动物爬到盒底的瞬间开始计时，15min内动物分别在两盒内停留的时间。 (4)结果评价： 如果动物在一侧盒子内停留时间显著延长，则表明其对伴药盒 产生位臵偏爱，该受试药具有偏爱效应。以吗啡为阳性对照药，比较 它们在等效ED倍数剂量条件下的偏爱效应，或比较产生相似位臵偏50 爱效应的药物剂量，即可反映该受试药的精神依赖性潜力的强度。 本试验的准确性取决于训练次数和每天训练的时间。训练次数越多， 条件联系越牢固；时间过短则条件联系不牢固，时间过长则离散度增 大。 - 17 -