大黄鱼CXCL13型趋化因子的鉴定及免疫球蛋白M重链和轻链的分子特征的研究（可编辑）

大黄鱼CXCL13型趋化因子的鉴定及免疫球蛋白M重链和轻链的分子特征的研究（可编辑） 大黄鱼CXCL13型趋化因子的鉴定及免疫球蛋白M重链 和轻链的分子特征的研究 国家海洋局第三海洋研究所 硕士学位论文 大黄鱼CXCL13型趋化因子的鉴定及免疫球蛋白M重链和轻链的分 子特征研究 姓名:田琛 申请学位级别:硕士 专业:海洋生物学 指导教师:陈新华 20090601国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 摘要 大黄鱼 是我国特有的经济鱼种,但随着养殖规模的扩大及养 殖环境的恶化,病害问题日益严重,己成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展 的主要因 素。因此,开展大黄鱼免疫的分子基础研究,明确重要免疫相关基因的分子特 征及功 能,不仅可以深化对以鱼类为代表的低等脊椎动物免疫系统的认识,也为大 黄鱼病害 防治提供重要的理论依据。 在前期研究中,通过对大黄鱼脾组织文库的表达序列标签 ,分析,发现了一个与鱼类及哺乳动物型趋化因子有同源性 的克隆。本研究通过该克隆的双向测序获得了大黄鱼型趋化因子 长个核苷酸,编码由个氨 基因全长序列, 基酸组成的蛋白,分子量为.,包含一个个氨基酸的信号肽和个氨基酸的成 熟肽。成熟的蛋白有个保守的半胱氨酸残基在第,,和位, 前两个半胱氨酸被一个精氨酸分开。推断的蛋白和其他已知的鱼类趋化因子 有%%的同源性,和其他脊椎动物有%%的同源性。进化分析显示 和与鱼类形成独立一支,和亚族的关系最近。我们用大 肠杆菌表达系统表达了重组的,其对大黄鱼显示 出了明显的趋化活性。组织表达分布研究显示基因在所检测的个组织中 有表达,包括鳃、心、肌、脾、肝、血和肾,除了肠未检测到表达。经:和三 联灭活细菌疫苗诱导小时后,基因在鳃、肝、肾和脾中表达明显上调, 在多数组织中三联疫苗刺激引起的表达上调比:要强。荧光定量 结果显示:在三联灭活细菌疫苗或:作为刺激物进行诱导后,基因在 肾和脾中的表达量都有不同程度的上升。经:激后在脾脏和肾脏中小时达 到最高;经三联灭活细菌疫苗刺激后在肾脏中小时达到最高,在脾脏中小时 达 到最高。以上结果说明可能在炎症反应有重要作用。 免疫球蛋白,是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中,由 淋巴细胞产生的一类能与相应抗原特异性结合并激发免疫反应的蛋白,是鱼 类特异性 体液免疫应答中最主要的效应分子。本文采用 技术克隆了大黄鱼免疫球蛋 白重链基因全长,长个核苷酸,编码一个个氨基酸 的蛋白。它与其他鱼类有着...%的序列一致性。组织表达分布研究显示国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 基因在所检测的个组织中有表达,包括鳃、肠、心、肌、脾、肝、血和肾, 属于组成型表达。:或三联菌苗诱导后,基因在肾和脾中的转录产物均 有不同程度的上调。在:诱导下,基因转录量在脾和肾中均在诱导后 达到最高,诱导后在脾和肾中的最高表达量是正常组织的.倍和.倍,在诱导后 小时恢复到下常水平;三联菌苗诱导下,基因转录水平在这两种组织中也出 现上调,在脾中在达到最高,最高表达量是正常组织的.倍;在肾中在 达到最高,最高表达量是正常组织的.倍。大黄鱼的表达量在:或 三联疫苗注射小时之内就显著上升,揭示了鱼类免疫球蛋白可能参与天然免疫反应。 进一步模拟了大黄鱼免疫球蛋白重链的空间蛋白结构,与人类的个不同, 以二个的形式存在并实现功能,为进一步研究鱼类结构与功能的关 系奠定基础。 通过对大黄鱼文库分析,还发现了一个与鱼类及哺乳动物免疫球蛋白 轻链有同源性的克隆,进一步通过 技术获得了条大黄鱼免疫球蛋 白轻链全长,根据结构特征将它们分成了三类,即、和 。组织表达分布研究显示和基因在所检测的个组织中有表 达,包括鳃、肠、心、肌、脾、肝、血和肾,只有第三类在心脏中未检测到表 达。荧光定量结果显示:在三联灭活细菌疫苗或:作为刺激物进行,, ,,诱导后,三类基因在肾和脾中的表达量都有不同程度的上升, 在不同时段达到峰值,只是在三联菌苗刺激下在脾脏中先有略微的下调又在 恢复正常并开始上调,推测在脾脏中可能先出现一个不应期,在识别之后 即展开免疫应答。大黄鱼三类在细菌或:刺激下的表达上调,说明它们均 参与了大黄鱼的免疫应答,并在刺激初期就有效果,且在肾和脾这两种组织 中的感染 机制也可能有所不同。三类在:或三联菌苗刺激下表达调控模式上的差 别表明它们在大黄鱼免疫应答中可能具有不同的作用。同时也模拟了大黄鱼 免疫球蛋 白三类轻链的空间蛋白结构,显示它们三者没有明显的区别,除了在恒定区 缺少了一个.螺旋。与人类的一致均以二个的形式存在并实现功能,为进 一步研究鱼类结构与功能的关系奠定基础。 关键词:大黄鱼;趋化因子;;免疫球蛋白重链;免疫球蛋白轻链 ????????????????』塑塑壁旦兰三塑堂堡窒堑堡圭堂篁笙壅 , . . ., ,,., ,. 髓/、咖,. . 一. , , ,。 ?%.%锄 ,. .. . ,,, ,.: , ? ,. :. .: , 。:.,. . ,, ,.,. 。...% .,. ,, , . :, . .. ,.... .,. . :. :.., . . . ? ,, ,,,, ,.: , ?, . ? . ..?:, . ,:. ., . .:;; ; ;国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其 他 个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人 和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由 本 人承担。 学位论文作者签名: 闲撵 蹴咖肿日国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文著作权使用授权 本学位论文作者完全了解国家海洋局第三海洋研究所有关保留、使用学 位论文的规定,同意本所保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电 子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权国家海洋局第三海洋研究所可以将 本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印 或 扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于: 年解密后适用本授权书。 保密口,在 不保密囹。 请在以上方框内打“/’’ 论文作者签名: 指导老师签名:国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 . 刖青 .大黄鱼简介 大黄鱼 ,属鲈形目,石首鱼科,黄鱼属,俗名黄 瓜鱼、黄花鱼,为广温广盐性集群洄游鱼类,是中国特有的地方性鱼种,广泛分布于 北起黄海南部,经东海、台湾海峡,南至南海雷州半岛以东。由于大黄鱼肉质细嫩、味 道鲜美,营养丰富和极高的药用价值倍受消费者的欢迎,是我国最重要的海水经济鱼 类之一。近十多年来,在科技工作者的不断努力和探索下,先后成功突破了大黄鱼人 工繁育、网箱养殖等难关,使大黄鱼人工养殖得到迅速发展,养殖生产规模不断扩大, 大黄鱼已成为我国海水网箱养殖数量最大的鱼种。然而随着大黄鱼养殖规模的扩大、 养殖密度的提高、养殖环境的污染以及养殖管理相对滞后,病害问题也就相继出现, 已成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展的主要因素。每年由各类病害造成的经济损失 达数亿元人民币。到目前为止,养殖大黄鱼的主要疾病有寄生虫病、细菌病和病毒病。 对于病害的防治目前主要使用抗生素。大量、盲目使用抗生素造成了药物残 留、耐药 性增加、污染环境等一系列不良后果【,】。所以从大黄鱼自身的抗病能力入手,通过提 高鱼体的自身免疫力来抵御病原微生物的侵袭是一个很好的途径。鱼类的免疫系统分 为特异性免疫和非特异性免疫。鱼类特异性免疫系统的激发需要较长的时间左 右,并且温度对它也有一定的影响,在这期间毒力较强的病原体足以将鱼致死。而天 然免疫是非特异性的,反应速度快,一般. 即有反应,并且温度对它影响不大匕 目前认为鱼类天然免疫在抵抗病原体的侵袭中发挥更重要的作用。因此,开展大黄鱼 免疫的分子基础研究,揭示其免疫或抗病的分子机制,不仅可以深化对以鱼类为代表 的低等脊椎动物免疫系统的认识,也为大黄鱼病害的免疫防治和抗病优良品种的培育 提供理论依据。 鱼类免疫系统 同其他脊椎动物一样,鱼类也是通过免疫系统来抵御外来病原生物的侵害,通过 非特异性和特异性免疫防御机制来维持机体的正常功能与自身内环境的稳 定。免疫系 统是生物抵御异物入侵的防御机构,由具有免疫功能的器官、组织、细胞、免疫效应 因子和有关的基因组成,保护机体免受病原体和有害异物的侵害。鱼类免疫系统是鱼 体执行免疫防御功能的机构,包括免疫组织、免疫细胞和体液免疫因子三大类【。其中 免疫组织和免疫细胞是鱼类防御系统的基础,为鱼体防止病原侵人提供了最初的防线, 而体液免疫因子则作为免疫应答的效应分子对病原具有直接的防御作用。国家海洋局第三海洋研究所硕上学位论文 .. 鱼类免疫系统的组织和器官 免疫组织是细胞发生、分化、成熟、定居和增殖以及产生免疫应答的场所。鱼类的 免疫器官与组织主要包括:胸腺、肾、脾脏、粘膜相关淋巴组织,它与哺乳动物在免疫 器官组成上的主要区别在于没有骨髓和淋巴结。 ...胸腺 鱼类胸腺起源于胚胎发育的咽囊,一般认为是鱼类的中枢免疫器官。胸腺是鱼类淋 巴细胞增殖分化的主要场所,并向血液和外周淋巴器官输送淋巴细胞。目前, 基本上认 为胸腺是细胞的发源地,主要承担细胞免疫的功能【】。另外,鱼类胸腺随着性成熟和年 龄的增长或在外环境的胁迫下会发生退化【】。 ...肾脏 肾脏是成鱼最重要的淋巴组织,可分为头肾、中肾和后肾 。在肾脏的发育过程中,头肾失去排泄功能,保留了造血和内分泌的功能, 而成为造血器官和免疫器官【】。鱼类头肾是继胸腺之后第个发育的免疫器官,不依赖抗 原刺激可以产生红细胞和淋巴细胞等,相当于哺乳动物的骨髓;另一方面,受抗原刺激, 头肾和中肾细胞会出现增生,利用溶血空斑和免疫酶技术已经证实头肾和中肾都存在 抗体产生细胞,表明肾脏又是硬骨鱼类重要的抗体产生器官,相当于哺乳动物中的淋巴 结。因此可说,硬骨鱼类的肾脏有哺乳动物中枢免疫器官及外周免疫器官的双重功能。 . ...脾脏 脾脏是鱼类红细胞、中性血细胞和粒性白细胞生产、贮存和成熟的主要场所,是形 态结构比较固定的淋巴样组织,位于胃大弯或在肠曲附近,通常为一个,但在 某些鱼 类可分裂为两个或两个以上的小脾。有颌鱼类才出现真下的脾脏。软骨鱼类的脾脏较 大,内含椭圆体,主要是一个造血器官,分化为红髓和白髓。硬骨鱼类脾脏没有分化 为明显的红髓和白髓,但同时具有造血和免疫功能。硬骨鱼类受到免疫接种后,其脾、 肾和肝等器官中的黑色素巨噬细胞增多,并与淋巴细胞和抗体生成细胞聚集在一起形成 黑色素巨噬细胞中心,其作用是【:参与体液免疫和炎症反应;对内源或外源异物 进行贮存、破坏或脱毒;作为记忆细胞的原始生发中心;保护组织免除自由基损 伤。这与高等脊椎动物脾脏中的生发中心在组织与功能上相似【】。 .。.粘膜相关淋巴组织 , 鱼类除了有以上重要的免疫器官外,还有分散的淋巴细胞生发中心,它们存在于粘 液组织,如皮肤、鳃和消化道等,但不具备完整的淋巴结构,被称之为粘膜相关淋巴组织 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 ,包括淋巴细胞、巨噬细胞和各类粒细胞等【】。当鱼体受到抗原刺激时,巨噬细 胞可以对抗原进行处理和呈递,抗体分泌细胞会分泌特异性抗体,与粘液中溶菌酶、抗 蛋白酶、转移因子、补体、几丁质酶等物质一起组成抵御病原微生物的有效防线。 ..免疫细胞 凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞均称为免疫细胞。免疫细胞分为两大类: 一类是淋巴细胞,主要参与特异性免疫反应,在免疫应答中起核心作用;另一类是吞噬 细胞。鱼类免疫细胞主要存在于免疫器官和组织以及血液和淋巴液中。 ..淋巴细胞 细胞和细胞是两种淋巴细胞亚群。细胞具有直接杀伤细胞的作用以及通过分 泌细胞因子调节免疫反应的作用;细胞分泌抗体且在细胞表面有抗体存在。发现鱼类 具有这两种淋巴细胞的功能已有多年,然而只是近几年来才利用抗单克隆抗体明确 地证明硬骨鱼类具有独立的淋巴细胞种群】。 ...吞噬细胞 鱼类吞噬细胞除作为辅佐细胞具有特异性免疫功能外,也是组成非特异性防御系统 的关键成分,在抵御微生物感染的各个阶段发挥重要作用。鱼类的吞噬细胞主要有单核 细胞、巨噬细胞和各种粒细胞【】。 ..体液免疫因子 同其他脊椎动物一样,有颌鱼类的免疫系统包括先天性的或非特异性的防御系统, 以及获得性的或特异性的防御系统。 ... 非特异性体液因子 当遇病原后,首先并迅速起防卫作用的免疫应答称为固有性免疫应答。在体内执行 固有性免疫应答的有吞噬细胞,自然杀伤细胞及血液和体液中存在的抗菌分子,在鱼类 防止感染中扮演重要角色。一般分为道防线,存在于粘膜分泌物中蛋白酶、溶菌酶、 凝集素、补体、转移因子等非特异性抵抗作用的分子是第一道防线,粘液细胞是第二道 防线,血细胞特别是颗粒细胞和单核细胞能够破坏存在于循环系统中的微生物充当第 三道防线,最后是存在于器官和组织中的具吞噬作用的细胞,如内皮细胞、巨噬细胞、 颗粒细胞等】。这四道防线虽对外源微生物、病菌和抗原没有特异性,但能有效地清除、 降解病原微生物及其他有害物质。在鱼类的体液、组织和卵中存在多种非免 疫球蛋白 的蛋白质或糖蛋白分子,它们在鱼类非特异性防御机制中发挥着重要作用『引。根据它们 对入侵病原微生物的效应可以将这些免疫因子分为以下几类。 国家海洋局第三海洋研究所硕上学位论文 .... 微生物生长抑制物能够夺取微生物生长所 微生物生长抑制物 需的基本养分,或在细胞内阻断其代谢路径,从而可以干扰病原微生物的代谢作用。鱼 类中微生物生长抑制物包括转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、金属硫蛋白和干扰素等】。 转铁蛋白是由单一多肽链组成的糖蛋白,分子量约。铁是微生物代谢和繁殖所 必需的基本元素。转铁蛋白具有很高的铁结合能力,因此当它存在时,微生物的生长和 繁殖便会受到抑制【】。 血浆铜蓝蛋白是由单一多肽链组成的蓝蛋白,可以螯合铜和其它的二价阳离子。血 浆铜蓝蛋白又称为亚铁氧化酶。因为它可以将亚铁离子氧化为高铁离子, 后者将结合到转铁蛋白上;在此过程中,血浆铜蓝蛋白可以加速周围铁的转运,从而降 低微生物获取的机会【。 金属硫蛋白是一种低分子量、热稳定的蛋白质,含有丰富的半胱氨酸用以结合铜、 锌、镉和汞等金属离子和机体炎症反应中,金属硫蛋白含量增加,能够特异性结合到巨 和信号传递,其结果是巨噬细 噬细胞膜上,并引起巨噬细胞呼吸爆发 胞释放活化产物以杀灭细胞外环境中的细菌或寄生蠕虫【。 干扰素能够抑制病毒的复制,是鱼类重要的抗病毒感染防御因子,分子量约。 包括型仅.或.干扰素和型丫.干扰素。型干扰素是由白细胞和成纤维细胞产 生;型干扰素可以在细胞分裂素刺激下由淋巴细胞产生,除了抗病毒作用外,还可以 激活巨噬细胞,是一种重要的巨噬细胞活化因子【 ....酶齐 在鱼类血清中存在多种酶抑 齐 ,主要为蛋白酶抑制剂,包括 丝氨酸蛋白酶抑齐 、半胱氨酸蛋白酶抑齐 、金属蛋白酶抑齐 、巨球蛋 兰一,【.。酶抑制剂的基本功能是维持机体血液和其它体液的内环境 稳定,还可以调节补体系统。它们能够抑制许多病原微生物胞外酶的活性,能够调节抗 原呈递作用,从而参与特异性免疫【引。 ....细胞溶素 鱼类的细胞溶素有水解酶、蛋白酶和一些非特异性溶素。鱼类组织和分泌物中具 有三类水解酶,分别是溶菌酶、壳多糖酶和壳二糖酶】。它们作用于微生物表面的糖苷 部分。溶菌酶可以破坏细菌细胞壁并对真菌细胞壁和昆虫的外骨骼进行有限的水解。 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 壳多糖酶和壳二糖酶可以破坏外膜具有壳多糖的微生物或寄生虫。 ....凝集素和沉淀素 同其它脊椎动物一样,鱼类也具有相对非特异性自发产生的固有凝集素 。它们属于蛋白质或糖蛋白,在理化、生物学和抗原特性方面均不同于抗原 刺激产生的免疫球蛋白【。凝集素能够与碳水化合物和糖蛋白结合,从而使异源细胞或 微生物发生凝集,或使各种可溶性糖结合物发生沉淀,被认为是机体自然防御机制中原 始的识别分子和免疫监督分子。 沉淀素包括一反应蛋白? ,、血清淀粉样成分和沉淀素?作为调理素,能够单独或通过 经典途径激活补体系统来影响吞噬细胞的迁移、吞噬和呼吸爆发,能够辅助补体依赖性 溶解作用并对自体衰老细胞的组分尤其是染色质进行清除【】。仅.沉淀素的 防御功能 可能表现在它们包括种蛋白成分能够与真菌等微生物表面的糖和糖蛋白发生反 应。 ....补体 补体系统是脊椎动物抵抗微生物感染的重要成分,由存在于体液中的数十种具有 酶活性的球蛋白组成。在哺乳动物中补体系统拥有三条激活途径:经典途径、替代途 径和凝集素途径【。抗原抗体复合体能够激活补体经典途径,当的部分与补体组 分复合体的组分相互作用时,补体经典途径被激活,最后形成膜攻击复合体来 溶解病原微生物。旁路途径为天然活化,能够共价结合于微生物表面,从 而能与因子相互作用,存在于膜上的因子能将因子断裂成和两部分,导致了 转化酶的形成,从而诱导膜攻击复合体的形成。凝集素途径由细菌多 糖起始,经由 途径激活结合的丝氨酸蛋白酶 . ,,它与和同源,并且能够断裂和, 从而形成与经典途径一样的转化酶来启动膜攻击复合体的形成【】。 随着有颌鱼类的进化和免疫球蛋白的出现,补体激活通过经典途径得以实现。与高 等脊椎动物相同,有颌鱼类补体的生物学活性主要显示于以下两个方面:由 替代抗 体非依赖性途径或经典抗体依赖性途径激活的细胞溶解作用;由被激活的补体 组分释放的片段所行使的调理作用【】。 ’ 。..特异性体液因子 抗体是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中,由淋巴细胞产生的一类能与相应抗 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白【。年世界卫生组织决定将具有抗体活性 或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白。抗体主要以分泌形式存在于 血液和其它体液中介导体液免疫,还可作为抗原受体结合于淋巴细胞膜上,即膜表面 免疫球蛋白。目前人们已从许多鱼类中分离得到免疫球蛋白。无颌鱼类免疫球蛋白表 达量很少,有关其特性目前尚有争议【。有颌鱼类血清中主要免疫球蛋白类似于哺乳动 物的,在血液中的相对水平较哺乳动物的高,是由等量的重链链,分子量约 和轻链链,分子量约组成。其结构基本重复单元为,即 单体形式,包含个抗原结合位点【引。 .鱼类趋化因子的研究进展 细胞因子作为鱼类机体免疫系统实现免疫应答的一部分,在行使非特异性和特异 性免疫防御,在维持机体内环境的稳定方面都发挥着重要作用。趋化因子是细胞因子 的一种,作为被激活的嗜菌细胞释放而最先到达炎症位点的先驱者,是控制和调节天 然免疫和获得性免疫的桥梁。它是由多种细胞在细菌、病毒、寄生虫等致病因子刺激 ,通常~个氨基酸, 活化后分泌的一类低分子量的相关蛋白分子量约、 都具有诱导白细胞的趋化性【 。趋化因子诱导白细胞主要是依靠存在于白细胞膜表面 的受体,它们往往出现在炎症的初期,因此又被称为炎症早期分子【。趋化因子的功 能多样,诱导白细胞的迁移、影响血管生成、肿瘤生成和转移、抗肿瘤反应、胶原产 生、胚胎发生、淋巴组织生成、造血干细胞的增殖、神经调制、抗原的呈递、组织损 伤修复、动脉硬化、风湿性关节炎、变态反应等,甚至还与的感染有关【】。因此, 趋化因子的研究有重要的理论和临床意义。 .趋化因子的分类 从结构上,趋化因子根据前两个半胱氨酸的位置排列可分为四类图.:前两 个半胱氨酸相邻的为型或型;被一个氨基酸隔开的为型或型;第三种类 型是前两个半胱氨酸被三个氨基酸隔开,为型或型;第四种类型为型或 型,其氨基端只有一个保守的半胱氨酸。趋化因子的主要类型为型和型, 型和型的数量较少,只有少数几个成员【】。 从功能上,趋化因子又可分为两种类型【】:第一类趋化因子可诱导嗜中性粒细胞、 单核细胞、活化的细胞等进入发炎的组织,它们能被炎症刺激剂如诱导,这一 类型中经典的趋化因子有.和.,这些因子在结合受体时一个因子可结合多个 受体,二个受体也可有多个趋化因子的配体。在哺乳动物中,编码这种类型趋化因子 国家海洋局第三海洋研究所硕上学位论文 的基因串连的排列在一条染色体上,如人的型趋化因子在号染色体、而型 趋化因子在号染色体。第二类趋化因子对机体起着免疫监控和维持机体动态平衡的 作用,这类趋化因子涉及到细胞的发育、抗原的呈递等,它们通常作用于白细胞和树 突状细胞。和前者相比,它们和受体的结合是受严格限制的,而且往往有数个染色体 上的基因编码,较少成簇存在晔。 表趋化因子的分类辑咖.:? ‘拗?却?科 ’‘量抖咐譬 螂擅,,翻瞄‘气 /. 哇艇敏《’一 /, 蕊.伐咫凤盼 , ‘;..;/. .;“ ‘ .. 张‘ 麟” ’’ 二,, .. 蹦 名 删 ‘。戗雌 张戡 ?妇矬“曲自馨 冀 卫膏 趣 《黛姥 , 一 ?? 旺:般, :‘: 嚣 . ‘:版盔‘冀, : 铡懈 / ?“:, ’ ‘: 争 . 。班删艟 /墟 嘲融 冀‘ 《鼍《 毋 ’?矗?” 黛, 【: ,《睁 甜嗒? 毛 : 眨 ,,脚 曩 、. :’ 在.馋曩 性‘?露 . 【‘ 臼相 置: 置 球 置醛 ?盥,置 故: 瞒 栅肚 牡‘ / 《“》 .乞 :. 《童 一 争 . 心,繁 ?舭。眺 .. 《净鳞 “ “:建 饭: 舳? ‘譬鼬 咚 《:动 , 娌: 《挚 ‘拈嚣铂嘲黻 . 罐 :. :。 瓤: 鑫,膳 艘 舷玉, 仪:“‘惟 ?矗 氍::?掣叫: 晦 訾: , :四 ” :窑 :胜睫《瓢 瞪时旭嫱‘, ?: 咐??“:,,池?, ‘置:鑫 “好 耐味‘:,队《 雌, 舻耐,‰ ? :盯 《? 髂:,包“挎:, 只曲?‘董 :: 蠹:矗 ,舶址: 掣 【: 掰’ :格’ : ,董搬蚺啦 誓:, ’/阿矗瓤 ‘蔓 ,々 :豫 : 俐: : 盛。岫棘 夏:磊 ? 文燃,比妇 瞳 ‘/ 越船峨触 “蝣 :嚣 ’稿《;。, 二 幻矬巾轴嘲矗穗证, 岭煳神曲妇峨,【:刮『等 叠蝴到九。 摊警蝴嫩: 亡兰舳苇,,:?? .. 资料来源:,.,.., 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 .趋化因子的结构 尽管趋化因子的氨基酸序列保守性较差,但它们在三维结构上有相似性,都有四 个保守的半胱氨酸残基【】。如上所述,两个半胱氨酸残基位于氨基端,另两个分别在 第和氨基酸附近,第一和第三、第二和第四个半胱氨酸形成两个二硫键。氨基 端第一个保守的半胱氨酸残基前有一较短的、杂乱的片断。中间区域包含三个折叠, 有四个保守的半胱氨酸形成的两个二硫键,起稳定构象的作用。羧基端包含一个约~ 个氨基酸残基形成的螺旋,一般认为,它能和受体细胞外基质作用,可延长趋化 因子的作用时间【】。 图趋化因子的分类与结构 ” 贮 簿 ??????????.?????/强甄晒晒劂 多 黟 秘争, 姆 ??一一???????叫?/霖嘲硒孵’” 陋 ? 趵 .,,,。 ; ,,一,。’ ,一一一一 一, 一,, ?舟邑?卜一 ?扣枷扣鬈?卜:??廿一辆唰均垂 轴置 资料来源: .:,, , ,: 一,.、 、 ~ 十’ 一 . .国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 .鱼类的趋化因子 近些年来,对鱼类的趋化因子进行了大量的研究,主要集中在型和型两 类。 .. 型 型趋化因子最初被认为是嗜中性粒细胞的潜在诱导者,但现在己知它们 也同样作用于淋巴细胞和单核细胞渊。型趋化因子根据它们有无谷氨酸, 亮氨酸,精氨酸,可分为两种亚型。家族的趋化因子包括、、、 、、、和。它们特异性的诱导嗜中性粒细胞, 在刺激剂,尤其是炎症早期细胞因子如和的作用下,在多种细胞中均可表达 、、、 。无家族的趋化因子、、、 和。它们主要是吸引淋巴细胞和单核细胞,对嗜中性粒细胞的作用 较小例。 首先报道的鱼类趋化因子属于型,它是由一种无颌鱼一七鳃鳗 编码的类多肽。这个趋化因子为个氨基酸,和鸡的有 %同原性,和人的有~%的同原性。它前两个保守的半胱氨酸被一个谷 氨酸残基分开。有趣的是,具有诱导嗜中性粒细胞的结构域尽管存在于人和 鸡的 中,但这个分子中却不含有结构域即。 七鳃鳗的几.发现以后,在硬骨鱼中也发现了类似的因子。比目鱼的几.基因 编码 个氨基酸,和人的几.有%的同原源性,和七鳃鳗在蛋白结构上仅有%的 同源性。它也缺失结构域‘。它似乎是受细菌机制的调节,因为它的转录组 只有 在用诱导的比目鱼的主要免疫器官脾脏和头肾中有检测到。鲶鱼的 编码 两种可变的剪切转录体,长的编码个氨基酸的多肽,短的为个氨基酸。它和哺 乳动物的有%的同源性。在虹鳟的文库中也发现了一个的..基因编 码个氨基酸,和比目鱼有%的同源性,和哺乳动物,鸡和七鳃鳗分别有似, 和%的同源性。尽管属于有类型的趋化因子,但到目前为止,在发现的鱼 类一中均无结构域‘。虹鳟同样也缺失结构,但是它在相同部位有非常相似 的结构。在人类的几中,如果突变为,它对嗜中性粒细胞依然有趋化活 性,只是在一个比较低的水平。推测虹鳟同样也会有哺乳动物几一一样的趋化活性。进 一步的研究表明,感染多子小瓜虫后,缸鳟的几.的表达有显著的增加。组织学上,在 感染多子小瓜虫后,第天头肾和脾中的表达明显上调,原因可能是受感染的鱼在 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 第天死亡前的征兆【。接下来发现了一个和,和更为相近的 趋化因子【。它包含个氨基酸,同样也无结构,但是有跟受体结合 的典型配体。这个趋化因子已经被命名为就是,一诱导蛋白。 在鲤鱼中首先鉴定出来的趋化因子是型的,它的基因有三个外显子和两个内 含子开放性阅读框有个碱基,共编码个氨基酸,前个氨基酸为信号肽,氨 基端两个保守的半胱氨酸被一个苯丙氨酸分开。通过同源性和进化分析,发现这个趋 化因子和人的.最接近,和七鳃鳗、比目鱼、缸鳟、斑马鱼的型趋化因子均较 远【。斑马鱼中被鉴定出来的两种趋化因子分别和和最为相近。 最近 等从河鲶中鉴定了三个组成型表达的型趋化因子,进 化分析表明了也和哺乳动物的和有很高的同源性【引。 最近在日本比目鱼中鉴定的一个新的趋化因子和哺乳动物的最相近。。又叫 一或者? ,是组成型表达的一类具有白细胞趋化活性的趋化因子。它特异性 的和次跨膜的蛋白耦联蛋白受体结合实现功能【,,。具有趋化 因子在功能上两方面的特性,既是由二级淋巴组织和器官中的淋巴细胞和小囊树状 细胞表达的】,可参与细胞的趋化活性【,,,也可以诱导炎症反应。它还可 以诱导对淋巴细胞的趋化活一生】。 .. 型 型趋化因子家族前两个保守的半胱氨酸残基是相邻的,主要是诱导单核细胞, 但也有些对淋巴细胞和嗜酸性粒细胞有特异性作用【】。一是第一个在硬骨鱼中进行 序列报道的型趋化因子。基因存在于已经检测到的所有鲑类鱼中,它的外显 子序列高度保守。.和哺乳动物的型与型趋化因子均有一些共同的特征, 这表明鲑类鱼的.保留了一些、曾经存在于原始趋化因子基因中的特性,而现代哺 乳动物的趋化因子基因就是从这些基因进化来的。缸鳟的.能特征性的诱导外周血 液中的白细胞,.的组织分布表明它在舡鳟的肝和肠中是组成型表达的【】。通过腹 腔注射,可诱导外周血液中白细胞和头肾表达.。.氨基酸序列和哺乳动 物的的同原性最高,同时基因的结构和表达方式也相似【。第二个从缸鳟中鉴 定出来的型趋化因子是。它的为个碱基,编码个氨基酸,氨 基端个氨基酸为信号肽序列。氨基端氨基酸和缸鳟.的同原性仅有 %【】。 等在 等报道了鲤鱼的一个的型趋化因子【。 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 鲷鱼中发现了七个、在鲨鱼中发现了一个型趋化因子,所有这些因子均有四个保 守的半胱氨酸结构域。这些因子为个氨基酸残基,在氨基端有个氨基 酸残基形成的信号肽【。 等克隆了日本比目鱼一个型趋化因子的 。进行重组表达后,对日本比目鱼的外周血液中自细胞具有诱导活性【。 等通过河鲶和蓝鲶的个进行分析,鉴定了个型趋化因子【。 趋化因子在诱导白细胞到炎症部位中起着关键性的作用。近些年来,从鱼类中已 经鉴定出来了多种趋化因子,对功能做了一定的研究,主要集中对白细胞的诱导活性 方面,显然低等脊椎动物的趋化因子和哺乳动物的在结构和功能上有相同之处。但和 哺乳动物趋化因子的研究相比,还相距甚远。以后研究的重点,不仅是鉴定鱼类中的 趋化因子,更重要的是研究趋化因子的功能、趋化因子与受体的相互作用及趋化因子 的作用机制。 .趋化因子的作用机制 趋化因子的作用是通过趋化因子受体起作用的。趋化因子受体是个跨膜区的蛋 白耦联受体. ,超家族,在结构上有一定的相似性‘,,。 胞内区与蛋白耦联,末端区域是决定与配体结合的关键部位,但其选择性结合的分子 机制尚不清楚。末端含丝氨基酸/苏氨基酸,可以通过磷酸化,参与信号传导。根据 相应趋化因子亚族的分类,其相应受体分别命名为、、、口表 。一种趋化因子能结合多种受体,一种受体又能结合多种配体,可与受体 和结合,但一般不跨越亚族范围,而有配体/ /、/ 。多种多样的趋化性细胞因子及其受体的存在,使趋 化系统能对多种免疫细胞的迁徙进行。 当趋化因子结合到受体后,引起受体二聚化或多聚化,激活趋化因子受体,导致 .蛋白亚基的被取代,蛋白分解成两部分,即和阿。其中携 带的【亚基沿膜移动直至遇到腺苷酸环化酶,与腺苷酸环化酶结合并将其激 活。活化后的腺苷酸环化酶产生大量环腺苷酸分散到细胞内,传达信息。 最终,水解成,蛋白重新组装,恢复非活性状态【。目前已经有证据 证明通过的信号传递是十分复杂的,涉及了酪氨酸磷酸化信号途径等【】。 然后,激活、、、.信号传递途径【?,导致细胞骨架重组、 形态改变、细胞趋化、及细胞生长、分化、细胞因子产生、凋亡等现象图。 信 号传递途径的最大优点是使信号加强。与信号传递链中的酶如腺苷酸环化酶 目穿洋目?海研究所日?学垃论女 结合后,细胞外微弱的信号在胞内被转换成强信号。 图趋化因子作用机制示意图 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 表趋化因子受体的分类. ;。她 ;。吣咖饵鲥胂口鹏.“蛐哪 资料来源:,.. ...。:?. .鱼类免疫球蛋白的研究进展 抗体是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中,由淋巴细胞产生的一类能与相 应抗 原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。是由淋巴细胞介导的。免疫球蛋白 ,具有高特异性和高亲和性的特点,是鱼类特异性体液免疫应答中 最主要的介质。目前人们已从许多鱼类中分离得到免疫球蛋白。 .鱼类免疫球蛋白的基因结构 鱼类免疫球蛋白的结构不仅在不同的鱼类,甚至在同一鱼类的不同部位都有 所差 异‘。因此,研究鱼类免疫球蛋白的遗传控制及其生物合成机制,对于深人了解鱼类 免疫系统的进化具有重要意义。 ..重链基因座 ... 酬重链瞄基因座国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 免疫球蛋白重链和轻链是由不同染色体上的多基因座编码的,在鱼类的不同分类 单元中具有不同的基因组织方式。真骨鱼类体内主要的免疫球蛋白种类为四聚体的 ,以可溶型和膜结合型两种形式存在,可溶型由细胞分泌,出现于血液和其他 体液,作为免疫效应分子存在;膜结合型分子则嵌人细胞膜,作为抗原受体而存在, 它和辅助分子结合成细胞受体复合物。分泌型和膜结合型取决于重链基因的 初级转录产物在加工中的选择模式。 重链瞄基因座的组织形式与两栖动物和哺乳动物的一样,即数百个可变 区基因区段 ,位于多变区基因区段聚簇 ,的上游,紧接着是连接区基因区段 ,,而在’端是 个恒定区基因区段 ,肛和个跨膜区基因区段 ,?。总的来说,、和区段的拷贝数多于,区段。这种基因组织形式 称为“易位子’’排列‘】。可变区基因具有较高的保守性,而恒定区 在进化上变化较快。 是所有脊椎动物不包括无领类鱼中一类保守的,然而重链闪基因在脊 椎动物进化中高度保守,啭录物加工的选择模式具有明显的多样性;特别是,真 骨鱼可通过剪接途径产生膜屿奎,该途径不同于其他脊椎动物,导致产生缺乏心 区域的膜。 ... 重链链基因座 长期以来,人们以为鱼类仅有一类免疫球蛋白,臣。但是最近的工作表明鱼类 也有两种以上的和极其复杂的免疫系统【】.真骨鱼类如斑点叉尾鲴 【、鲑 哗和大西洋鳕 【】中也先后发现 有一种类似于哺乳类重链链的嵌合基因。被认为是最近才进化的一种 ,以前只是在灵长类和啮齿类动物中发现。真骨鱼类中发现的事实表明应该 是出现于脊椎动物进化早期的一类古老免疫球蛋白。但是鱼类和哺乳类的链基因在 结构上有很大差别,而不同鱼类的链基因组织也明显不同。 其恒定区 基因在基因座中都是直接位于堪因的下游,都是通过 前体的可变剪接而非类别转换来表达。斑点叉尾鲴和鲑链基因都有个恒定区 卜而无铰链区;而且,鱼类 基因是与“显子嵌合在一起转录表达的, 其中肛区用于同链结合‘。斑点叉尾鲴链具有可变的分泌或膜结合形式的 末端,在某些细胞中能够与完整的“链共表达【】。大西洋鳕链基因仅有与斑点叉尾 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 鲴和鲑 , 和 同源的个恒定区而缺失了 ?区,具有包括 和 外显子下游 的串联重复区,两个重复区被一个短的外显子 隔开,在 存在一个截短的 斟。鲑和大西洋鳕中仅检测到膜结合形式链的转录物【。 进 一步研究发现,在大西洋鳕中主要在细胞表面表达,同哺乳类一样,其主要功 能可能是细胞受体,但是其表达量很低,在鱼类免疫应答中的重要性目前还 不清裂。 ..轻链基因座 免疫球蛋白轻链基因的结构相应比较简单,主要表现在三个方面:不必编码 跨膜区用于膜结合免疫球蛋白的表达;仅含一个恒定区外显子;可变区只由 矛区段不含区段。硬骨鱼类的轻链具有“聚簇”结构】,形 成聚簇【。与“易位子相比,“聚簇”的基因结构大大限制了抗体多样性 产生的可能,这类物种的基因片段重排发生在聚簇的内部。且硬骨鱼类轻链 片段的 功能区的? 转录方向和儿、片段相反,进一步限制了抗体多样性的产生。 矛以及区端大部分都是由链基因座中区段编码的,区端剩余部 分和整个区则是区段编码【。 在哺乳动物中分为和入两类,在两栖动物类被分为,,三类‘】,在 鸟类中只有一类。在硬骨鱼中,先前被定义为三类, ,近期第四类 又被发现【】。 .鱼类免疫球蛋白多样性产生的遗传机制 抗体是由细胞合成的,在其发育和分化过程中,基因座发生一系列复杂的重组 事件,使得不同的区段结合在一起形成编码链和链的成熟基因,从而产生抗体 的组织特异性表达,每一个细胞克隆都具有其自身的特异性【。鱼类同其他变温动物 一样,也以类似于恒温动物的分子机制来产生抗体的多样性,但其抗体亲和性和多样 性的水平一般较低见表【。基因重组是由非常保守的重组信号序列 ,调节的,包括一个七聚体和一个九聚体 ,它们间隔,位于每一个区段下游;其反向互补序列间隔,位 于每一个区段上游;而在每个区段两端也各有一个七聚体一九聚体序列【】。含 间隔区的信号序列只能与含间隔区的信号序列结合,这样保证了、和区段的正 确组合。除此之外还有启动细胞基因表达的特异性聚体序列,能导致和 的发生二次重组的信号,疏水前导序列与编码序列之间也有一内含子将 其隔开。国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 鱼类抗体可以识别外界为数众多的抗原,其多样性主要是由以下遗传机制产生的: 种系区编码区段的多样性、区段组合的多样性、基因重组的不精确性、基因 转换、体细胞突变以及和链的随机组合等。 表鱼类抗体多样性产生的遗传机制 篼明 曼 一?嚼 韩系“ 、,区段序别的多样性,匿 基因多样性 段编鹳抗体’区的大郝分 、、,基因区段亟缎时随机选择,在 组会多群性 多簇排列豹塾网腹中受别限制 、、,区段的不辅硗煎绲,及箕各区 连接多样性 段交界处豹娥毖插入或缺失 从,:游假嫠阏痒中不可逆地转移序列, 纂因转换 功能摊的区得到多样化 抗原刺激后,特异住细胞中功能性的 体细胞突变 、、区段内弓入点突变 在?‘个细臆内。随机选择其有:同矿链缎合 链表达 区的肇拿磐翻 资料来源: ..,。:. ..种系区编码区段的多样性 鱼类种系免疫球蛋白基因的结构是产生其多样性的最根本的基础,它们代表了所能够 产生的抗体种类的最少数量。免疫球蛋白可变区结构域的前两个互补决定区,全部是由区基因编 码的,硬骨鱼类由区基因和部分区基因编码,不同区段间的变异性将提高 区的变异性,尤其当两个区段或其中任何一个用于基因重组时【 。真骨鱼类链是 以易位子的方式组织的,这意味着和区段的变异对于的变异性是很重要的。因 此,在同一物种当中,不同的、、片段的数目尤其是片段的数目决定了抗体多 样性产生的可能性。另外,区的可变性主要局限在其区,尽管区也存在较低程 度的多样性【】。一个物种的基因家族越大,则表明其基因的多样性可能越大。 来自于不同家族的区段可能具有一个或两个相同的区段,而同一家族中的区段同 样可能具有不同的编码区【。 国家海洋局第三海洋研究所硕二匕学位论文 .. 、、区段组合的多样性 真骨鱼类在细胞分化的过程中,一个基因区段首先与一个区段重组,接着一 个区段与.重组,其中每一个不同的区段都能够以随机的方式互相组合,因此, 这三种基因区段的组合构成链多样性的第二种机制。真骨鱼类链基因座是以 多簇方式组织的,而且每一个区段同本簇中的区段重组,?这并不能增力链的多 样性。但事实上,链基因也是“随机”选择和儿区段来实现重组的,因为其基因 簇之间是紧密连接.的,加之区段与儿.区段转录方向相反,这完全有 理由让人怀疑其基因簇之间的重组是通过倒位产生的,因此也增大链的潜在可变 性【】。 ..基因重组的不精确性 、、区段的重组并非十分精确,在.、.和.儿相接处经常有一些 核苷酸缺失或是插入,这种不精确性增加了区的多样性。碱基缺失被认为是外切 核酸酶作用的结果,碱基插入被称为区或核苷酸。区是在末端脱氧核苷酸转移酶 ,的作用下添加的一段短的核苷酸优先加入 和。区仅发现于链的基因,因为在细胞分化过程中链基因重排时的 表达通常被减量调节。核苷酸是编码的插入,一般与最后编码的核苷酸呈回文对 称结构。这种基因重组的不精确性又称为连接多样性是产生链多样性的 第三种机制。 ..基因转换 基因转换作为产生抗体库的主要机制首先在鸡中发现【,这是产生抗体多样性的第 四种机制。因为鸟类和链都只有一个功能性的区段,基因重排后,通过从上游 假基因库的基因区段中转移序列,功能性的区才得以多样化。这种机制在某些哺乳动 物中也有报道【】。在辐鳍鱼类,不仅链而且链基因簇之间很有可能也是以这 种方式来改变抗体的特异性从而使抗体多样化【。 ..体细胞突变 在哺乳动物免疫应答的过程中,未成熟细胞分化成抗体产生细胞之前,先通过体 细胞突变,对特异抗原的亲和性骤增,使抗体在免疫应答中达到亲和力成熟。这种突 变一般发生在基因中编码区的部分,并且构成抗体多样化的第五种机制。对东太 虎鲨和非洲爪蟾的研究发现在功能性的重排区,体细胞突变同样以很高的水 平发生,表明这种机制在变温脊椎动物中也可能有助于形成抗体多样性‘。】。然而,国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 类似于哺乳动物中的亲和力成熟并未在变温脊椎动物中发现【。 .. 链和链的随机组合 抗体中抗原结合位点是通过和链中功能区的组合形成的。在两个细胞克隆 中,产生具有相同区的链的同时产生相同的链,这样的可能性微乎其微。因此, 不同链和链的组合将会增加抗体的多样性,这是脊椎动物丰富抗体多样性的第六种 机铝。 ..鱼类抗体有限的亲和性与多样性 鱼类基因的某些特性可能且并显著地体现在其编码的抗体的质量上。比如,虽 然基因簇的数目可能很大,但是在多簇构型中基因座的排列被认为将大大限制抗体 的多样性,这可能是板鳃亚纲鱼类抗体应答十分有限的一个原因。很有可能是某种原 因造成了鱼类和其它变温脊椎动物抗体缺乏类似于哺乳动物中的亲和力成熟。比如可 能是在低等脊椎动物淋巴组织中缺乏生发中心【】,因为在哺乳动物脾和淋巴结中的生 发中心是抗原驱动性的高亲和性抗体选择位点【州。 .本论文的研究对象和目的 .本课题的研究对象 大黄鱼 属鲈形目石首鱼科黄鱼属,是我国特有 的地方性种群,广泛分布于北起黄海南部,经东海、台湾海峡,南至南海雷洲半岛以 东。该鱼属暖温性集群汹游鱼类,常栖息于水深米以内的近海中下层。大黄鱼生殖 季节有春、秋两季,生殖期时,鱼群分批从外海越冬区向近海作生殖洄游。产卵后幼 鱼在近海长大,分散索饵。随着水温下降,部分鱼群游向米等深线暖水处越冬。 大黄鱼原是我国传统的四大经济鱼类之一,其肉质鲜嫩,是我国人民喜食的海产 鱼。除供鲜食外还可加工制成风味和特色的水产品。此外,大黄鱼还具有药用价值, 其耳石具清热作用,鳔有润肺健脾、补气活血之功能。后因过度捕捞,资源破坏严重。 经多年研究,年开始批量育苗,商品鱼养殖从年开始不断扩大规模,产量逐 年增加。以福建省为例,年海区网箱养殖大黄鱼达万箱以上【 。养殖省份从 福建开始,并向浙江、广东,海南等省辐射。养殖方式从网箱养殖向池塘养殖拓展【引。 ’’ 。 .本课题的研究目的 随着大黄鱼养殖规模的扩大、养殖密度的提高、养殖环境的污染以及养殖管理相国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 对滞后,病害问题也就相继出现,已成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展的主要因素。 每年由各类病害造成的经济损失达数亿元人民币。到目前为止,养殖大黄鱼的主要疾 病有寄生虫病、细菌病和病毒病。要实现对病害的有效防治,必须研究免疫相关功能 基因分子特征及功能,了解大黄鱼免疫的分子机理。利用大黄鱼本身的抗病因子加强 抗病力,取代或减少药物使用是当务之急。因此,开展大黄鱼抗病相关基因分子特征 及功能的研究,不仅有助于对大黄鱼免疫系统的了解,且对于大黄鱼病害防治也具有 重要的现实意义。 .细胞因子作为鱼类机体免疫系统实现免疫应答的一部分,在行使非特异性和特异性 免疫防御,在维持机体内坏境的稳定方面都发挥着重要作用。本论文克隆了大黄鱼个 技术 新的全长趋化因子基因,分析了基因阅读框的结构,利用 研究了它们在大黄鱼体内的转录表达。研究发现,这个基因在:、细菌三联菌苗 刺激的大黄鱼肾脏和脾脏中均有上调表达。采用大肠肝菌表达系统,表达和 纯化 了蛋白,并对它们的趋化活性进行了研究。 .免疫球蛋白是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中,由淋巴细胞产生的一类能与相 应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白,是鱼类特异性体液免疫应答中最主要的 介质。在本研究中我们克隆分析了多条大黄鱼免疫球蛋白重链和轻链基因,尤其是利 用.技术从大黄鱼文库和转录组中得到了十条完整的轻链序列并对其分 子特征进行了研究,根据它们的氨基酸序列的不同特征分成了三类,并进行了结构模 拟。在:、细菌三联菌苗刺激的大黄鱼肾脏和脾脏中免疫球蛋白重链和轻链均有 上调表达。这个结果也进一步确定了免疫球蛋白参与了大黄鱼的免疫应答过程。 国家海洋局第三海洋研究所硕士学位论文 第一章大黄鱼型趋化因子基因的克隆表达和功能鉴定 .实验材料 .大黄鱼、载体和 ; 大黄鱼:购自福建连江市下屿村渔排;:为产品。 .菌株和质粒 溶藻弧菌矿、副溶血弧菌矿 、嗜水气单胞菌似. 、. 和. 为本试 均为本实验室保藏菌种。. 验室保存。一 购自公司图.。载体由本实 验室保藏。 图. ?载体示意图 . 一 .载体如图.所示是一种高效克隆产物 的专用载 体,购自大连宝生物公司,大小为.,带有便于蓝白筛选的.半乳糖苷 酶基因和氨苄霉素抗性筛选标记,具有多个酶切位点可供选择。 和 该载体的多克隆位点处的 识别位点之间插入了识别位点,.用 进行酶切反应后,再在两侧的’端添加“”而成。因大部分耐热。生聚合酶 进行 反应时都有在产物的’未端添加一个“”的特性,所以使用这个载体可以大 大 可以在极短时间内约 提高产物的连接、克隆效率,并且使高效连接液 分钟完成连接反应,且此连接液可以直接用于细菌转化,是本实验常用的克 隆和亚 克隆载体。国家海洋