蛋白激酶B对小鼠1_细胞期受精卵卵裂的影响

蛋白激酶B对小鼠1_细胞期受精卵卵裂的影响 h t t p : / / w ww . R a n d C . c n第27卷第10期Vol.27,No.10生 殖 与 避 孕 年10月Oct.20072007 r a nd c @ s i p p r . s tc . s h . c nReproduction & Contraception 蛋白激酶B 酶小鼠1- 酶胞期受精卵卵裂的影响 1211111晨雁哲酶王宿文酶酶徐小燕宗志酶于秉治 (中科大国医学 1. 基酶院生物化分子生物室医学学与学教研2. 酶酶技酶中心三部, 沈阳, 110001)【摘要】 目的: 究蛋白激酶研B(PKB)的活性酶化酶小鼠受精卵早期酶育的影响。: 野生型、将 持酶激活型和激酶失活型 PKB 克隆至 pBluescript II/SK 酶酶中达体～外酶酶成体 mRNA～酶微注 射到1-酶胞期受精卵中～酶察受精卵分裂情况。酶果: 1-酶胞期受精卵注射野生型或持酶激活型 PKB 的 mRNA 后～卵裂率均增加～而持酶激活型 PKB 的促酶作用更酶酶著～相反注射激酶失活型 PKB 的 mRNA 后～卵裂率明酶降低。酶酶: PKB 能促酶小鼠 1- 酶胞期受精卵的酶育～其活化酶于 小鼠受精卵的酶育是必需的。 酶酶酶: 小鼠受精卵; 蛋白激酶B(PKB); 定点突酶 中酶分酶号: Q132.7文酶酶酶献: A文章酶号: 0253-357X(2007)10-0633-06蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)酶酶于1991本酶酶在前期工作的基酶上～酶于 PKB 在小 年～酶属 / 酶酸蛋白激酶氨～包含 PH 域和酶上 构与鼠受精卵早期酶育酶程中的影作酶一步的究～响研 蛋白激酶 A(PKA)和蛋白激酶 C(PKC)相似的蛋白 通酶建野生型构、持酶激活型和激酶失活型 PKB 的激酶区, 于属PKA和PKC相酶激酶(related the A and C 表酶～利用酶酶上酶有达体体的 T7 酶子启～不同将 kinase, RACK)家族。同酶, PKB 与 r-akt 基因酶 酶形式的 PKB 外酶酶体成 mRNA ～酶微注射入小的 AKT 蛋白同源, 又被称酶 AKT。PKB 具有酶酶 鼠体内参与运物酶代酶、葡萄糖酶、酶酶糖原合 成、1- 酶胞期受精卵～在活酶胞直接酶察不同形式 内的 促酶蛋白合成、抗酶胞凋亡等多酶作用～是 酶胞外内PKB 酶小鼠受精卵早期酶育的影～酶探酶响 PKB 的酶信息酶酶途中重要的激酶之一径, 也是机体控机制奠定基酶。 部分酶 myr 序列):5'- pBSK-myr-PKB 及 pBSK-PKB-KD AAGCT TCCATG- mRNAGGAGCAGCAAGAGCAAG-3'; 引物 d (酶划照酶酶胞在 M16 培酶液中培酶～相差部分酶酶位点): 5'-CTACTATGCCATG 察～注射 hCG 后 30 h 酶分裂酶数 2-GC GAT- 卵～数酶算卵裂率～于注并射 hCG CTCAAGAAGG-3'; 引物 e (酶部分酶突酶位点划): 后 各酶死亡酶胞～酶算死亡率。数'-1.2.6PKB活性酶定根据酶酶需要,CCTTCTTGAGGATCG C CATGGCATAGTA.2.3酶粒构建 野生型PKB表酶的酶建达体构: 以克 在酶粒 pCIS2-Akt1/PKB 上的 PKB cDNA 酶取出10受精卵个, 收集液(1 g/L 聚乙酶模EDTA, 10 mmol/L 原酶酸酶, 10 mmol/～用基因特性引异物 a 、b 酶引物～酶增野生 酸酶酶冲液, pH7.4)中洗清3次, 同5 PKBa～酶酶酶增片段 1 450 bp 左右～5' 端引 移入0.5 ml的Eppendor管中～立放即Hind ?酶切位点～3' 引入 BamHI 酶切位点～ 酶 中速酶保存待酶活性。用 Hind ?和 BamHI 酶切～同酶酶切的双与双 洗膜2次, 每次2 min, 酶酶将置于含10 ml 蒸酶水的 液酶瓶内, 用 Beckman 液酶酶酶酶定数 cpm 酶。 1.3 酶酶酶学理 - 每酶酶酶重酶 2-4 次～据以数 x? s 表示～酶 酶 2 ,酶果酶用 SPSS 13.0 酶酶酶件酶行 t 酶酶和 酶 酶 P<0.05 酶酶差有酶酶异学意酶。 2酶果 2.1 重酶酶粒 将小鼠 PKB-WT～myr-PKB 及 PKB- K179A 分 酶建构到pBlurscript ?-SK酶中体～目的 片段均引 入 Hind ?和 BamHI 酶切位点～酶切酶到30 h非注射和注射TE酶液酶照酶分酶冲有63.43%定～酶果 如酶 1。均可酶酶 3 000 bp 的酶酶及相酶体及 62.64% 的酶胞分裂到 2- 酶胞期(酶 3B); PKB-目的 酶～符合酶期大小～酶明建成构功。重酶酶粒均 WT 酶注 hCG 后 26 h 仍酶于 1- 酶胞期～27 h 左酶酶序酶定～基因入插确正。右酶始 出酶 2- 酶胞期受精卵, 到 30 h有 75.21% 的 酶胞分 裂到2-酶胞期(酶3C); myr-PKB酶注hCG后25 h酶 于1-酶胞期, 26.5 h就酶始出酶2-酶胞期受精卵, 到 30 h 有91.26% 的酶胞分裂到2- 酶胞期(酶3D); 而 PKB-KD 酶注 hCG 后 26 h 酶于 1- 酶胞期, 到 30 h 只 有12.84%的酶胞分裂到2-酶胞期(酶3E), 到35 h, 才有48.00,分裂到2-酶胞期。酶照酶相与比, 3酶 PKB重酶体mRNA注射后均影卵裂响(P<0.05)(表1), 少数酶胞有不酶酶分裂(酶 3F)。 2.4PKB-WT～myr-PKB 及 PKB-KD 注射酶 和酶 照酶小鼠受精卵死亡率的比酶 注射 hCG 后 35 h～酶酶非注射和注射 TE 酶 冲液的酶照酶死亡率分酶酶26.11,和27.47,～而 PKB-WT 和 myr-PKB 酶的死亡率均低于酶照酶～M1: 100 bp ladder DNA marker 1: PKB-WT 2: PKB-K179A 3: myr-PKB M2: DL15000 DNA 分 酶酶 15.39,和 10.32,; 相反～PKB-KD 酶的死marker亡 率酶 29.36%～酶照酶与异比无差(表 2)。酶 1 重酶酶粒的酶切酶定酶果双 Figure1 Doubleenzymeincubationresultsofvariousrecombinant plasmids with Hind? and BamHI 、B: 酶照酶受精卵在注射 hCG 后 27 h、30 h 形酶 fertilized eggs photographed at 27 h and 30 h after adding hCG mouse in control group 、E: 分酶酶 PKB-WT、myr-PKB 及 PKB-KD mRNA 注射酶小鼠受精卵在 hCG 后 30 h 形酶、D fertilized eggs, 30 h after hCG in PKB-WT、myr-PKB and PKB-KD mRNA microinjection group, respe:PKB-KD mRNA 酶受精卵在注射 hCG 后 30 h 酶生的异常分裂 irregular division in PKB-KD mRNA microinjection group, about 30 h after hCG 酶 3 PKB-WT、myr-PKB 及 PKB-KD 的 mRNA 注射酶小鼠受精卵酶育的影响Figure 3 Effect of microinjection of PKB-WT, myr-PKB and PKB-KD mRNA on early development of mouse fert 本究以小研鼠1-酶胞期受精卵酶酶象～通酶构不能正常酶酶其蛋白激酶的作用～酶激酶失活即 [7,16]建 PKB 突酶的方式体～表不同形将达式 PKB 。激酶失活当型 PKB 的 mRNA 注射型 PKB 的入 1- 酶胞期受精卵后, 注射 hCG 30 h 的卵裂率mRNA 注射入小鼠 1- 酶胞期受精卵～使酶胞呈酶酶 明酶降 表的酶达状～酶 PKB 在 1- 酶胞期受精卵酶育酶程胞期受精卵的酶育是必需的～其活性酶失酶～当 中的作用酶行了初步的探酶。酶果酶示1-酶胞期受受精卵的早期酶育受到明酶的抑制。但是酶得注精卵注射酶酶 PKB-WT 的 mRNA 后～卵裂率意的是～酶酶酶酶酶胞 35 h 的死亡率有明酶 并没下降 而且当酶察酶酶延酶酶～酶有 48% 的酶胞 分裂到 2- 酶增加 (75.21,); 注射hCG后35 h～受精卵的死亡胞期～酶明酶存在其他的酶酶途引 径起了受精卵的分率也有裂。在小鼠卵母酶胞中～酶用 LY294002 抑制 所降低(15.39,)。酶了使受精卵中的PKB始酶酶于PI3K/PKB 途径～可以阻止生酶泡 破裂(GVBD)的活化酶状～我酶酶酶用了持酶激活型的 PKB 突酶 。体酶生; 但是酶酶阻断作用是酶酶的, 当延酶培酶酶酶有近 50% 卵母酶胞又可以酶生 GVBD～酶明 PKB 目前酶酶～PKB 的活化有 2 途条径: 依酶 PI3K [13]途其途一径与它径参与起了小鼠 卵母酶胞分减数的活化途和径非依酶 PI3K 的活化途径其中～。[10] 裂恢酶的酶酶。因此我酶酶 酶～在小鼠受精卵的酶依酶 PI3K 的活化途是径 PKB 活性酶酶的主要方式～ 育酶程中～PKB 不是并唯 一的促酶因子～必定酶也是 PKB 激活的酶典途。酶胞接受外径当界刺激引有其他的酶酶途其径与共 同酶酶作用～在 PKB 活性 /PIP与起 PI3K 活化后酶生的 PIP PKB 的 PH 区32 酶失的情况下～起到了 一定的代酶作用。域酶 合～使 PKB 酶定于酶胞膜～酶并构致其象酶生当前～受精卵早期酶育机制的究研学仍是酶 改界的酶点酶酶。1995 年有人提出受精卵酶育的酶酶～其激酶的酸化酶酶位点区磷并磷暴露被酸化～ 酶而胞周期酶酶机酶～学酶酶酶胞分裂的酶力所在是 成熟/M活化。在整个活化酶程中～PKB 的膜定位是 一个期促酶因子(maturation/M-phase promoting factor, 必需的前提件条, 也可以酶酶是PKB活化的一个MPF)～而受精卵早期酶育也同酶受MPF控[14][19]酶志。在 PKB 蛋白的 N 端融合 Lck/Src 蛋白制。本酶酶室前期酶酶也酶酶, 小鼠受精卵早期 酶育受 的豆 酶酶化信序列～号可以模酶和加速 PKB 的膜定MPF 酶控, 酶期 MPF 活性低, 注射 hCG 后[15]位 即活化酶程, 据此而建立起来的myr-PKB重酶体 也被 [7,16-18]广泛地酶用于 PKB 的究研中。我酶所酶用的 [20]持酶激活型的 PKB 突酶～体就是在 PKB 的 N 端28-29 h 酶入 M 期～MPF 活性升高可以酶～。融 合了来源于 pp60src 蛋白的、由 14 基酸个氨MPF 是酶酶受精卵分裂的核心因子。酶多蛋白激残基酶酶～例如 PKA 、PKC 、酶裂原活化蛋白激酶 成的豆酶酶化序列～其中的第 2 位甘氨酸可以酶合 豆(mitogen-activated protein kinase, MAPK)等～都是酶酸。豆酶酸可以通酶疏水的相互作用和 / 或同 一酶通酶酶酶 MPF 的活性酶酶酶酶受精卵早期酶育状来参与 胞酶膜蛋白酶合的方式使得 PKB 定位于酶膜的酶控。本酶酶酶察到, PKB 可以促酶小鼠 1- 酶上～起到持酶膜定位和激活的作用。通酶酶定 PKB Effect of Protein Kinase B on Cleavage of Mouse Fertilized E 121Chen FENG, Yan WANG, Wen-hui SU, Zhe 1ZHANG, 11Xiao-yan XU, Zhi-hong ZONG, Bing-zhi 1YU ABSTRACT】 Objective: To investigate the effect of protein kinase B(PKB) on the regulation ombryo development. Methods: Wild type, constitutively active and kinase dead PKB(PKB-KD) we