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BA46基因转染树突状细胞治疗乳腺癌的研究

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BA46基因转染树突状细胞治疗乳腺癌的研究 #肿瘤免疫学# BA 46基因转染树突状细胞治疗 乳腺癌的研究 尤长宣 罗荣城 苏瑾 张军一 廖旺军 郑航 Yong Liu Paul L Hermonat = 摘要 > 目的 探讨以乳腺癌特异抗原 BA46 基因转导树突状细胞( DC)治疗乳腺癌的可行性。 方法 取健康人外周血,采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞 ( DC 前体细胞) , 以 AIM-V 培养基于 6孔板培养, 贴壁 5 h, 轻轻洗去悬浮细胞( T细胞, 冻存备用) ,取贴壁细胞, 将细胞分为基因 转染组及对照组,基因转染组...
BA46基因转染树突状细胞治疗乳腺癌的研究
#肿瘤免疫学# BA 46基因转染树突状细胞治疗 乳腺癌的研究 尤长宣 罗荣城 苏瑾 张军一 廖旺军 郑航 Yong Liu Paul L Hermonat = 摘要 > 目的 探讨以乳腺癌特异抗原 BA46 基因转导树突状细胞( DC)治疗乳腺癌的可行性。 方法 取健康人外周血,采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞 ( DC 前体细胞) , 以 AIM-V 培养基于 6孔板培养, 贴壁 5 h, 轻轻洗去悬浮细胞( T细胞, 冻存备用) ,取贴壁细胞, 将细胞分为基因 转染组及对照组,基因转染组感染携带 BA46 基因的重组腺相关病毒 rAAVPBA46PNeo ,对照组以 293细 胞冻融液刺激,两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( GM-CSF)、白细胞介素 4( IL-4)、 肿瘤坏死因子-A(TNF-A)诱导 DC前体细胞成熟。第 7 天, 收集悬浮细胞( DC) ,显微镜观察细胞形态, 流式细胞仪分析 DC 的面标志 CD80、CD86、CD40 的表达情况;另取该 DC 与 T 细胞按 1B20 比例混 合,含 5%人血清蛋白的AIM-V为培养基,同时加入 IL-2 与 GM-CSF, 共育 7 d, 诱导获得细胞毒性T 淋 巴细胞( CTL) ,取 BA46 阳性的乳腺癌细胞株 Hs578T 为靶细胞,采用51Cr释放法测量杀伤效率, 同时以 流式细胞仪检测 CTL 群体中 CD8PCD4 和 CD8PCD56 的比值。结果 BA46 基因转导的 DC 表面标志 CD80、CD86、CD40 的表达均明显高于对照组 DC, 所激活的 T 细胞对 BA46 阳性的乳腺癌细胞株 Hs578T 有很好的杀伤效果,此杀伤具有抗原特异性和MHC 限制性, 且该 T 细胞中 CD8PCD4 和 CD8P CD56的比值均明显高于对照组(细胞裂解物冲击 DC 所激活的 T 细胞)。结论 BA46 基因转染成功 制备 DC,并诱导特异的 CTL ,为乳腺癌的 DC基因转染疗法打下基础。 = 关键词 > 树突状细胞; BA46; 基因转染; 乳腺癌 Experiment on BA46 gene transferring dendritic cells and application in the treatment of breast cancer YOU Chang-xuan* , LUO Rong-cheng , SU Jin, ZHANG Jun-yi , LIAO Wang-jun, ZHENG Hang, Yong Liu, Paul L Hermonat. *Department of Oncology , Nanf ang Hospital , the Southern Medical University , Guangzhou 510515 , China Corresponding author: L UO Rong-cheng , Email : Center@ nfhoc. com = Abstract> Objective To study the feasbility of BA46 gene transferring dendritic cells used in therapy of breast cancer. Methods Drew the peripheral blood from the healthy donor, isolated the mononuclear cells( DC precursor) with density gradient centrifugation, cultured with AIM-V medium, washed out the suspending cells af- ter 5 hours. The adherent cells were divided into 2 groups, one is gene transfer group, another is control group. To observed the morphologic features of DC with light microscope, analyzed the surface marker CD80, CD86, CD40 with flow cytometry . Mixed the DCs and T cells at ratio of 1 to 20, cultured in AIM-V medium contain 5% human plasma, induced by IL-2 and GM-CSF, finally got cytotoxicT lymphocyte( CTL) after 7 days. Test the cytotoxicity of the CTL by 51Cr releasing with BA46 positive breast cancer cell lineHs578T as the target and to analyze the ratio of CD8PCD4 and CD8PCD56 in CTL population with flow cytometry. Results The DCs transfected with BA46 gene expressed the higher level of surface marker CD80, CD86, CD40 than that of control group. The CTL in- duced by the gene transferring DCs obtained high cytotoxicity activity to the BA46 positive breast cancer cell line Hs578T which is BA46 antigen specificity and MHC limited. The CTL population also got much higher ratio of CD8PCD4 and CD8PCD56 than that of the control group( the lysate group) . Conclusion The success of BA46 gene transducing DCs and inducing CTL set up a base for breast cancer immunotherapy with DC gene transfer. = Key words > Dendritic cells; BA46; Gene transfer; Breast cancer 基金项目:中美合作研究基金资助项目(编号AN20020621) 作者单位: 510515广州南方医科大学附属南方医院肿瘤科(尤长 宣,罗荣城,张军一,廖旺军,郑航) ,呼吸科(苏瑾 ) ;美国阿肯色大学 医学院基因治疗中心( Yong Liu, Paul L Hermonat) 通讯作者:罗荣城, Email: Center @ nfhoc. com,电话: 020-61641651- 801 树突状细胞( DC)是人体内功能最强大的抗原 提呈细胞, 在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作 用,采用体外培养DC, 特异肿瘤抗原刺激制成 DC瘤 苗, 免疫机体从而激发特异的细胞免疫有望成为一 种理想的肿瘤治疗手段11, 22。此疗法的关键是获得 特异的肿瘤抗原,并将该抗原转导 DC。乳腺癌是女 #574# 中华微生物学和免疫学杂志 2005年 7月第 25卷第 7期 Chin J Microbiol Immunol, July 2005, Vol 25, No. 7 性发病率最高的恶性肿瘤, BA46几乎在所有的乳腺 癌细胞高表达, 在正常乳腺有表达, 而在乳腺以外的 正常组织内不表达13-62 , 以其抗原肽免疫转基因鼠, 可在其身上诱导出特异的细胞免疫172。虽然正常乳 腺也有表达 BA46, 但乳腺并不是人体的重要器官, 因此它可作为乳腺癌 DC治疗非常理想的肿瘤抗原。 本研究以腺相关病毒 ( AAV)为载体, 成功制备高滴 度的携带 BA46基因的重组腺相关病毒( rAAVPBA46P Neo 病毒)182。在此基础上,取人外周血单个核细胞 (DC前体细胞) , 体外培养, 以 rAAVPBA46PNeo 病毒 转染 DC 前体细胞, GM-CSF、IL-4和 TNF-A诱导 DC 成熟,加入T 细胞,GM-CSF 和 IL-2诱导, 最终获得针 对 BA46的细胞毒性 T 淋巴细胞( CTL) , 并检测该 CTL 对 BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T 的杀伤效 果及CTL 内CD8PCD4和CD8PCD56的情况,探讨此基 因转染法制备DC,诱导CTL用于治疗乳腺癌的可行性。 材料和方法 病毒:重组乳腺癌 BA46基因腺相关病毒( rAAVP BA46PNeo)由作者于阿肯色大学医学院基因治疗中 心制备,病毒滴度为 1010个病毒颗粒Pml142。 主要试剂: AIM-V培养基购自 Gibco Invitrogen公 司; Ficoll 淋巴细胞分离液购自 Sigma 公司; AIM-V (R)无血清淋巴细胞培养基购自 Gibco Invitrogen 公 司; GM-CSF 购自 Immunex 公司; IL-4购自 R&D SYS- TEMS公司; FITC标记的 ant-i CD40抗体购自 Immuno- tech公司; FITC 标记的 ant-i CD80 购自 Becton-Dickin- son公司; FITC 标记的 ant-i CD86、FITC 标记的 ant-i CD4、PE标记的 ant-i CD8、FITC标记的 ant-i CD56均购 自Pharmingen公司。 主要仪器: 流式细胞仪为美国 Becton Dickinson 公司产品;液闪计数仪为美国 Backman公司产品。 人外周血 DC的培养: 取健康人外周血 50 ml, Ficoll分离, 收集淋巴细胞,以 AIM-V为培养基,调节 细胞浓度为 109Pml, 培养于 6孔板, 每孔 2. 5 ml, 在 37 e , 5%CO2 孵箱中培养贴壁 5 h, 轻轻洗去悬浮的 淋巴细胞, 取贴壁的单个核细胞, 每孔加 2. 5 ml含 GM-CSF(终浓度为 800 UPml)的 AIM-V培养基,将细 胞分为基因转染组和对照组(未感染病毒组) , 基因 转染组每孔加 rAAVPBA46PNeo 病毒液 0. 5 ml,感染 5 h后换液为每孔3 ml含 GM-CSF(终浓度为800UPml) 的AIM-V培养基, 对照组每孔只加 293细胞冻融液 0. 5 ml。第 2天半量换液, 于第 3天全量换液为含 GM-CSF(终浓度分别为 1000 UPml)和 IL-4(终浓度为 1000 UPml)的AIM-V培养基。而后隔天半量换液,培 养基均为含GM-CSF(终浓度分别为 800UPml)和 IL-4 (终浓度为 1000 UPml)的 AIM-V, 第 5 天, 除了 GM- CSF 和 IL-4外,还加入TNF-A(终浓度为 20 ngPml) ,第 7天,收集细胞,计数,光学显微镜下观察 DC形态。 CTL的诱导: 在 6 孔板内, 以含 5% 人血清的 AIM-V为培养基, 按 DCBT 细胞= 1B20 的比例混合 DC和T 细胞, 同时加入 GM-CSF(终浓度分别为 800 UPml)和 IL-2(终浓度为 20UPml)和 IL-2(终浓度为 20 ngPml) ,共培养 7 d, 期间每隔 1 d均半量换液。 FACS( fluorescent antibody cell sorting)分析所 制备的 DC的表面标志和 CTL亚群比例: 分别取细 胞数为106P管的基因转染组DC和对照组 DC置于流 式细胞仪专用试管中,每组取 4管, PBS洗涤 2遍后, 100 Ll重悬细胞,分别加入下列 FITC标记的鼠源性 单抗: 对照 isotype、ant-i CD40、ant-i CD80、ant-i CD86, 避 光反应 45 min, PBS洗涤 2遍后,流式细胞仪检测其 细胞表面标志表达情况。以同样的方法处理 CTL, 加入对照 isotype 和 FITC 标记的鼠源性单抗 ant-i CD4、ant-i CD56以及对照 isotype 和 PE 标记的鼠源性 单抗 ant-i CD8,流式细胞仪检测其细胞表面标志表达 情况并计算CD8PCD4和 CD8PCD56的比值。 51 Cr释放法测量 DC激活的 T细胞对 BA46阳 性细胞株的杀伤效率152:分别以 BA46 基因转染组 DC激活的T 细胞和对照组 DC激活的T 细胞为效应 细胞,收获对数生长期的 BA46阳性的乳腺癌细胞株 Hs578T 为靶细胞,调整细胞浓度为 2 @ 106Pml,取 0. 5 ml细胞悬液,加入3700 kBq( 100 LCi) Na2 51CrO4 , 37 e 共育 2 h。洗涤后稀释至 106Pml, 在 U 形板中加入 100 Ll细胞悬液,按照 20B1的效靶比加入 CTL 细胞。 37 e 共育 6 h。收获 100 Ll上清,C计数仪计算, 同时 设51Cr自发释放组及完全释放组。按下列公式计算 杀伤率( cpm为每分钟计数值) : 细胞毒活性( %) = 试验组 cpm 值- 自发释放 cpm值最大释放 cpm 值- 自发释放 cpm值 @ 100% 同时取 K562细胞为靶细胞进行同样的细胞毒 试验以研究 T 细胞的非特异杀伤情况。同时在基因 转染组 CTL 杀伤 Hs578T 的细胞毒试验中增加一组 实验, 在靶细胞与 Na2 51 CrO4 共育并洗涤后, 加入 HLA Ñ类抗体W6P32(终浓度为50 LgPml)共育 1 h,使 其MHC受到封闭后, 再进行细胞毒试验, 研究 T 细 胞杀伤的MHC限制性。 结 果 11携带有 BA46 基因的重组 rAAVPBA46PNeo #575#中华微生物学和免疫学杂志 2005年 7月第 25卷第 7期 Chin J Microbiol Immunol , July 2005, Vol 25, No. 7 病毒结构示意图: AAV 的 rep 及 cap 基因被BA46和 Neo 基因取代, 保留两端的反向末端重复序列 ( ITR) , BA 46 基因采用 P5 启动子, Neo 基因采用 SV40启动子(图 1)。 图 1 携带有 BA46 基因的重组 rAAVPBA46PNeo 病毒 结构图 Fig 1. The structure map of rAAVPBA46PNeo 21基因转染组成熟 DC形态:见图 2。第 7天, 光镜下观察基因转染组 DC, 可见 DC (图中箭头所 示)明显比T 淋巴细胞大, 外形不规则,细胞表面有 大量长短不一的突触, 呈现典型的 DC 形态。BA 46 基因成功转染 DC并表达见相关文章172。 图 2 基因转染组成熟 DC形态( @ 200) Fig 2. The morphologic features of mature DC in gene transfer group( @ 200) 31 FACS 分析两组 DC 表面标志表达情况: FACS结果显示(图 3) , 基因转染组 DC 共刺激因子 CD80( B7-1)、CD86( B7-2)以及 CD40的表达比例分别 为78%、83%、79% ,均明显高于对照组 DC 的 15%、 64%、53%。 图 3 FACS分析 DC表面标志表达情况 Fig 3. The analysis of cell surface marker of DC with FACS 41 FACS 分析两组 DC激活的 T细胞中 CD8P CD4和 CD8PCD56情况:FACS分析两组DC激活的T 细胞亚群中,基因转染组的CD8PCD4和 CD8PCD56分 别为 3. 24 和 5. 54, 均明显高于对照组 DC 激活的 T 细胞的1. 12和 0. 78(图 4)。 51 51 Cr释放法测量 DC激活的 T细胞的杀伤效 率:DC激活的 T 细胞的细胞毒试验结果: 由表 1可 知, 基因转染组 T 细胞对 BA46 阳性的靶细胞 Hs578T 有明显的杀伤( 48. 5% ) , 而对照组 T 细胞无 明显杀伤( 7. 8% ) ,两者比较差异有统计学意义。而 且,当加入MHC Ñ类抗体W6P32时,基因转染组T 细 胞对Hs578T 的杀伤率明显下降, 仅为 12. 3%, 说明 此杀伤具有MHC限制性; 当靶细胞是 K562时,该 T 细胞对其杀伤也较少, 仅为 8. 2% , 说明了此基因转 染组T 细胞Hs578T 的杀伤是特异的。 表 1 DC激活的 T细胞的杀伤效率 Table 1. Cytotoxicity of DC-activated T cells T cells Cytotoxicity( % ) Hs578T Hs578T+ ant-i MHCÑ K562 Gene transfec- t ion group 48. 5 ? 6. 5 * 12. 3? 5. 8 8. 2? 6. 1 Control group 7. 8 ? 4. 7 6. 5? 3. 4 8. 6? 4. 3 * P< 0. 001, compared with control group 讨 论 乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤, DC瘤苗 有望成为该病一种全新的治疗手段,已有采用 DC瘤 苗治疗乳腺癌的临床试验正在进行之中192。制备 DC瘤苗的常用方法有抗原肽直接冲击和抗原基因 转染等方法,而抗原肽直接冲击法存在一定的不足: ( 1)抗原肽有一定的半衰期[比如 t1P2 ( Her-2Pneu) [ 30 min] ,不利于多次刺激; ( 2)目前使用的抗原肽大多 来源于细菌表达的基因工程产品, 此类蛋白缺少真 核细胞对蛋白翻译后的进一步修饰。而采用抗原基 因转染制备DC瘤苗有望克服上述不足。 在基因转染载体的选择上, 除了要求抗原基因 能成功转移外, 还要能长期稳定表达,所以本研究选 择腺相关病毒 ( AAV)为载体, AAV 可成功转导 DC, 并特异整合于人 19号染色体上, 从而实现转移基因 的长期稳定表达1102 ,我们的前期研究结果充分说明 了 BA46基因能成功转移 DC,并有明确的表达172。 采用基因转染制备 DC,除了保证抗原基因的成 功转移和表达外,还要考虑基因转染后对DC成熟及 功能的影响。本研究发现,以 AAV为载体转移抗原 基因 BA46至 DC前体细胞后,不影响 DC的成熟,在 #576# 中华微生物学和免疫学杂志 2005年 7月第 25卷第 7期 Chin J Microbiol Immunol, July 2005, Vol 25, No. 7 图 4 FACS分析 DCs激活的 T细胞亚群中的 CD8PCD4和 CD8PCD56 Fig 4. The analysis of CD8PCD4 and CD8PCD56 in the T cells which is induced by DC with FACS 常规外源性细胞因子 GM-CSF 和 IL-4的作用下, 第7 天的 DC即呈现典型的 DC形态, 外形不规则, 细胞 表面有大量长短不一的突触。在功能方面, 共刺激 因子CD80、CD86、CD40是DC功能的重要标志,而基 因转染组 DC在这三组细胞表面标志均有很高比例 的表达,且明显高于对照组(采用细胞裂解物冲击制 备)的 DC。 DC功能最重要的体现是诱导 T 细胞,本研究采 用基因转染制备的 DC 所诱导的 CD8+ T 细胞比例 明显高于对照组,这可能与抗原提呈途径有关,采用 基因转染制备 DC 的方法, 由于抗原基因已整合于 细胞的染色体内,抗原的提呈途径主要是采用内源 途径,因此主要诱导 CD8+ 的 T 细胞。转染后 DC 所 诱导的T 细胞对抗原阳性的靶细胞的杀伤明显高于 对照组T 细胞,而且此杀伤有 MHC限制性和明显的 抗原特异性。 采用基因转染的方法, 成功制备的表达乳腺癌 抗原 BA46的DC疫苗能诱导具有强大特异杀伤功 能的T 细胞,本研究表明, 该疫苗为以 BA46为靶抗 原的乳腺癌DC疗法奠定了实验室基础。 参 考 文 献 1 E Claire D, Karen PM, Jennifer JK, et al. Dendritic cells can be rapidly expanded ex vivo and safely administered in patientsw ith metastatic breast cancer. Immunology, 2004, 53( 9) : 777-781. 2 Bancherea J, Beatrice S-T, Karolina Palucka A, et al. Dendritic cells as vectors for therapy. Cell, 2001, 106: 271-274. 3 Giuffrida MG, Cavalet to M , Giunta C, et al. Isolation and characteriza- tion of full and t runcated forms of human breast carcinoma protein BA46 from human milk fat globule membranes. J Pro Chem, 1998, 17 ( 2 ) : 143-148. 4 Larocca D, Peterson JA, Urrea R, et al. A M r 46, 000 human milk fat globule protein that is highly expressed in human breast tumors contains factor Ø-like domains. Cancer Research, 1991, 51( 18) : 4994-4998. 5 Couto JR, Taylor MR, Godwin SG, et al. Cloning and sequence analysis of human breast epithelial antigen BA46 reveals an RGD cell adhesion se- quence presented on an epidermal growth factor-like domain. DNA Cell Biol , 1996, 15( 4) : 281-286. 6 Taylor MR, Couto JR, Scallan CD, et al. Lactadherin ( formerly BA46) , a membrane-associated glycoprotein expressed in human milk and breast carcinomas, promotes Arg-Gly-Asp ( RGD)-dependent cell adhesion. DNA Cell Biol, 1997, 16( 7) : 861-869. 7 Carmon L, Bobiler-Priel I, Brenner B, et al . Characterizat ion of novel breast carcinoma-associated BA46-derived pept ides in HLA-A2. 1PD ( 6) beta 2m transgenic mice. J Clin Inves, 2002, 110 ( 4) : 453-462. 8 尤长宣, 罗荣城, 苏瑾, 等. 腺相关病毒载体介导乳腺癌 BA46 基因转染的实验研究. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004, 24 ( 9) : 724-727. 9 Inge Marie S, Anders EP, Hans EJ, et al . Vaccination w ith p53-pep- tide-pulsed dendrit ic cells, of patients w ith advanced breast cancer: re- port from a phase Ñ study. Cancer Immunology, 2004, 53( 7) : 633- 638. 10 Liu Y, Chiriva-Internat M, Hermonat PL, et al. Rapid induct ion of cy- totoxic T-cell response against cervical cancer cells by human papilloma- virus type 16 E6 antigen gene delivery into human dendrit ic cells by an adeno-associated virus vector. Cancer Gene Therapy, 2001, 8 ( 12 ) : 948-957. (收稿日期: 2004-11-29) #577#中华微生物学和免疫学杂志 2005年 7月第 25卷第 7期 Chin J Microbiol Immunol , July 2005, Vol 25, No. 7
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