干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来

CRTER P.O.Box1200,Shenyang 110004 kf23385083@ sina.com www.zglckf.com 0 引言 Ⅰ型糖尿病患者胰岛 β细胞胰岛素分泌 缺陷,需要终生依赖胰岛素,一些Ⅱ型糖尿病 患者在服用降糖药物无法控制血糖的情况下 也需要依赖于胰岛素。目前采用的胰岛移植由 于免疫排斥反应和供体缺乏, 限制了其应用。 鉴于上述原因,干细胞移植成为目前研究者们 关注的重点,干细胞极强的自我更新能力和多 向分化潜能为糖尿病细胞治疗开辟了新的途 径,按其发育阶段的不同可以将干细胞分为胚 胎干细胞和胰腺干细胞、造血干细胞、神经干 细胞、骨髓基质干细胞等成体干细胞,现就干 细胞治疗糖尿病的研究进展进行综述。 1 胚胎干细胞 胚胎干细胞是源于哺乳动物早期胚胎内 细胞团中的一种二倍体细胞,一般可从植入子 宫内膜前的囊胚等早期胚胎中获得,这种细胞 具有长期的未分化增殖能力,从体外长期培养 哈尔滨医科大学组 织学与胚胎学教研 室,黑龙江省哈尔滨 市 150086 秦逸人☆,男,1979 年生,甘肃省永昌县 人,汉族,哈尔滨医 科大学在读博士,主 要从事胚胎干细胞 与治疗性克隆方面 的研究。 tolishizhen@ 126.com 通讯作者: 刘慧雯, 博士,教授,博士生 导师,哈尔滨医科大 学组织学与胚胎学 教研室,黑龙江省哈 尔滨市 150086 liuhw_11@ yahoo.com 黑龙江省 211 基金资助项目(哈医 大 006)* 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:1673-8225 (2007)24-04802-04 收稿日期:2007-02-03 修回日期:2007-03-30 (07-50-2-765/GW·Y) 干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来*☆ 秦逸人,刘慧雯,王锦绣,纪 红 Progressin stem celltherapy fordiabetesm ellitus Abstract OBJECTIVE: To com prehensively analyze the presentstatus and developing direction ofstem celltherapy fordiabetes m ellitus. DATA SOURCES: W ith the key words of"diabetes m ellitus and stem cellnotreview", we searched the Pubm ed database forthe articles on the stem celltherapy fordiabetes m ellitus published between January 2000 and Novem ber 2006 in English. STUDY SELECTION: The retrieved articles aboutthe stem celltherapy fordiabetes m ellitus were organized, and the focused literatures were selected. The papers with the sam e contentpublished recently orin authorized journals were preferred. DATA EXTRACTION:Am ong 359 related literatures,50 articles were referred to em bryonic stem cell,pancreatic stem cell,hem opoietic stem cell,neuralstem celland bone m arrow stem cellin the treatm entofdiabetes m ellitus,29 ofthem were accorded with the criteria. DATA SYNTHESIS:Due to the self-renewalability and m ulti-differentialpotential,stem celltransplantation is a new way in the treatm entofdiabetes m ellitus.According to the developm entstage,stem cellcan be divided into em bryonic stem celland pancreatic stem cell,hem opoietic stem cell,neuralstem celland bone m arrow stem cell,etc.Before generating insulin-secreting cells, the stem cells m ustgo through three stages: celldifferentiation, cellselection and cellm ature. Stem cellresearch has m ade som e progresses in treating diabetes, the diabetic hyperglycem ia has been corrected in som e anim als experim ents. CONCLUSION: The oriented differentiation ofstem cellinto beta cellofislethas shown the potentialvalue in the treatm entofdiabetes,inevitably itwillbe the optim alseed cellfortreating the diabetes. Qin YR, Liu HW , W ang JX, JiH.Progress in stem celltherapy fordiabetes m ellitus.Zhongguo ZuzhiGongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(24):4802-4805(China) [www.zglckf.com /zglckf/ejournal/upfiles/07-24/24k-4802(ps).pdf] 摘要 目的:综述干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来发展。 资料来源: 应用计算机检索Pubm ed 2000-01 /2006-11有关干细胞治疗糖尿病方面文献,检索词 “diabetes m ellitus and stem cellnotreview”,限定文章语言种类为English。 资料选择:对检索到的干细胞治疗糖尿病相关文献进行整理,选取针对性强文章。同一领域文献则选择近期发或权威杂志文 章。 资料提炼:共检索到359篇相关文献,有关胚胎干细胞、胰腺干细胞、造血干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞在糖尿病方面 研究文章50篇,其中29篇符合。 资料综合:干细胞极强的自我更新能力和多向分化潜能为糖尿病的细胞治疗开辟了新途径,按其发育阶段不同可以将干细胞 分为胚胎干细胞和胰腺干细胞、造血干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞等成体干细胞。干细胞移植是治疗糖尿病的一条新 途径。干细胞生成胰岛素分泌细胞前需要经过诱导分化、细胞选择和细胞成熟 3个阶段。干细胞治疗糖尿病研究已取得一定进 展,部分实验已纠正糖尿病动物的高血糖状态。 结论:干细胞定向分化为胰岛β细胞研究为糖尿病患者点燃了新希望,其勿庸置疑的成为治疗糖尿病的最佳种子细胞。 关键词:干细胞;糖尿病;综述文献 秦逸人,刘慧雯,王锦绣,纪红.干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(24):4802-4805 [www.zglckf.com /zglckf/ejournal/upfiles/07-24/24k-4802(ps).pdf] 综述 Departm ent of Histology and Em bryology, Harbin M edical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China Qin Yi-ren☆,Studying for doctorate, Departm ent of Histology and Em bryology, Harbin M edical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China tolishizhen@ 126.com Correspondence to: Liu Hui-wen, Doctor, Professor, Tutor of doctor,Departm entof Histology and Em bryology, Harbin M edical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China liuhw_11@ yahoo.com Supported by:the 211 ProjectofHeilongjiang Province, No. HM U006* Received:2007-02-03 Accepted:2007-03-30 中国组织工程研究与临床康复 第 11卷 第 24期 2007-06-17出版 JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch June 17,2007 Vol.11,No.24 4802 CRTER 沈阳1200邮政信箱 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 秦逸人,等.干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来 ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 后,仍然具有稳定发育成个(各)胚层的潜能。通过添加 特异的诱导因子或去除饲养层及抑制分化的因子或通 过转基因,可将胚胎干细胞诱导分化成各种不同类型 的细胞,其全能性为人们研究糖尿病细胞治疗开辟了 新的途径。 1.1 基因插入的研究 Soria等[1]将人胰岛素基因插入 小鼠胚胎干细胞,筛选出阳性细胞后,将其移植到小鼠 糖尿病模型脾下,移植1周后,血糖水平恢复正常,4 周后体质量恢复正常。Leon-Quinto等[2]将含有新霉素 抗性基因标记的 Nkx6.1启动基因质粒转染小鼠胚胎 干细胞,筛选 Nkx6.1阳性细胞,有 20%的细胞表达胰 岛素和 Pdx-1,将其移植入糖尿病模型小鼠中,其血糖 水平恢复正常。Shiroi等[3]将 Nkx2.2基因转入小鼠胚 胎干细胞诱导出的 DTZ染色阳性细胞不仅比未经转 染细胞的诱导率高 10倍,而且诱导时间也提前近 2 周,这说明基因工程化的胚胎干细胞可以是胰岛素细 胞有效的来源。Blyszczuk等[4]将参与胰岛β细胞分化 的转录因子 Pax4及Pax1分别转染给鼠 R1细胞系, 发现Pax4(+)转基因细胞系胰腺基因表达模式被激 活,产生胰岛素的细胞数量增加。 1.2 自发诱导的研究 Assady等[5]通过实验证实,人胚 胎干细胞在体外贴壁培养和悬浮培养时都能自发分化 为表达胰岛素阳性的细胞,其它多种胰岛β细胞标志 (如GLUT2)均为阳性。这些细胞在葡萄糖存在的情况 下,可向培养基分泌胰岛素,但这样直接分化的效率 低,约有60%～70%的拟胚体自发分化,而在分化的拟 胚体中只有1%～3%的细胞表达胰岛素,而且混有大量 其它类型的细胞,不适合作为胰岛移植物。Shiroi等[6] 将胚胎干细胞悬滴培养 5d形成拟胚体,让其自然分 化生长,然后用 DTZ溶液孵育 15min,通过免疫组 化、RT-PCR、酶联免疫吸附法的检测,显示拟胚体大 约 16d出现 DTZ染色阳性细胞群,23d后阳性细胞 数明显增加,并表达胰十二指肠同源框、前胰岛素1、前 胰岛素 2、高血糖素、胰多肽、葡萄糖转换子 2和胰岛 特异性催化亚基相关蛋白和6-磷酸葡萄糖酶 mRNA, 说明胚胎干细胞来源的 DTZ阳性细胞群有胰岛内分 泌细胞的特点,并能分泌胰岛素。Kim等将[7]胚胎干细 胞体外诱导分化为胰岛样细胞,通过 RT-PCR、免疫组 化、电子显微镜的检测,结果分化的细胞强烈的表达内 分泌胰岛基因,说明这些分化细胞不仅生长成熟,并在 胞质和发育良好的粗面内质网内有一些成熟的胰岛素 分泌颗粒,体外研究显示了分化的细胞保留了有效的 对葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答功能,把其移植到糖 尿病模型鼠下,可以降低高血糖水平,并且没有形成畸 胎瘤,这说明胚胎干细胞可以分化为有功能的和可供 移植的成熟胰岛样细胞,这为将来的临床研究提供了 理论基础。Xu等[8]证明人胚胎干细胞能够自然分化为 内胚层和胰腺祖细胞标志Foxa2、Sox17、和 Pdx1,并 且有胰岛内分泌激素的分泌。 1.3 化学诱导的研究 Lumelsky等[9]用复杂的“五步 法”将小鼠的胚胎干细胞诱导分化为能分泌胰岛素的 类似胰岛的结构,经诱导的细胞群含神经元和α、β等 多种胰岛内分泌细胞,这些细胞表达鼠胰岛素Ⅰ和胰 岛素Ⅱ,葡萄糖刺激时其胰岛素含量可增加40倍,但 其胰岛素分泌量仅为正常胰岛细胞的1/50,这些细胞 还表达胰岛淀粉多肽、葡萄糖转运子2等胰岛细胞标 志物。这些细胞在植入糖尿病小鼠的皮下后,仍能分泌 胰岛素,维持小鼠正常体质量,其存活时间明显延长, 植入 12d后发生血管化,但未能纠正高血糖症,其原 因可能是细胞分泌的胰岛素不足,移植数量(1～2)×107 不足,移植部位不理想,对血糖反应不敏感等。 Hori等[10]用 3-磷酸肌醇激酶抑制剂处理小鼠胚 胎干细胞,产生的分化细胞类似胰岛β细胞,这些细胞 聚集在一起,在结构上类似,并能产生更多胰岛素,显 示葡萄糖依赖的胰岛素体外释放,并促进循环胰岛素 水平的增加,阻止糖尿病模型鼠体质量的减轻,改善血 糖,可以完全治愈糖尿病模型小鼠,而移植细胞的去除 会导致糖尿病鼠病情快速加重甚至死亡,对移植细胞 的研究分析并没有发现肿瘤,这些动物实验说明了胚 胎干细胞可以作为产生胰岛素的资源来治疗糖尿病。 Sipione等[11]通过免疫组化,RT-PCR及其功能分 析了胚胎干细胞来源的胰岛素样细胞,将其移植到链 唑霉素处理的重度联合免疫缺陷的小鼠体内,3周后检 测血糖浓度,结果胚胎干细胞分化的胰岛素染色细胞 并没有典型的β细胞颗粒,几乎没有和C肽产生免疫 反应,且大部分凋亡了,在培养基中释放的胰岛素并不 是葡萄糖依赖性的,将其移植入糖尿病小鼠体内形成 了畸胎瘤,且没有逆转高血糖状态。 Shi等[12]用苯丙酸诺龙、全反式维甲酸及其他的成 熟因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为产生胰岛素的细 胞,而这些诱导细胞胰岛素的释放通过葡萄糖的浓度 来调控,通过提高胰岛素的绿色荧光蛋白汇报系统排 出了胰岛素内在吸收的可能性,而诱导的胰岛素阳性 细胞可以纠正血糖水平,从而能治疗模型小鼠糖尿病。 Baharvand等[13]用生长因子将人胚胎干细胞诱导 分化,获得的细胞呈 DTZ染色阳性,对胰岛素、高血糖 素、C肽抗体成免疫阳性反应,用半定量RT-PCR检测 了前胰岛素和胰岛B细胞其他相关基因,然而在人ES 细胞的分化细胞中高血糖素、生长激素抑制素、ATP通 道基因KIR6.2、SUR1、胰岛淀粉样多肽 PC1/3的表达 随着其分化呈阶段相关性,在细胞培养基中加入葡萄 糖,检测到了分泌颗粒,但是通过投射显微镜显示B细 4803 CRTER P.O.Box1200,Shenyang 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com 胞颗粒不典型,这些实验结果说明人胚胎干细胞有能 力转录并产生胰岛素。 Segev等[14]将人胚胎干细胞直接放入 N2、B27、 碱性成纤维生长因子培养基中生长,之后撤出碱性成 纤维生长因子并降低培养基中的葡萄糖浓度并加入烟 碱,RT-PCR和原位杂交均提示诱导的细胞表达胰岛 素基因。有研究使用细胞外基质和粘附分子等,将胚胎 干细胞诱导分化产生胰岛素分泌细胞将这些细胞移植 到 STZ诱导的模型鼠体内,1周内就能逆转高血糖状 态,在 4周人体体质量仍然维持稳定,但糖耐量低,餐 后血糖正常。Vaca等[15]通过对比研究发现烟碱在诱导 鼠胚胎干细胞增殖和分化反面起到协调的作用。 虽然胚胎干细胞被认为是研究胰腺疾病强有力 的工具和非常有潜力的治疗糖尿病的细胞资源,但拟 胚体细胞分化来源的胰岛样细胞的可行性依旧有争 议[16]。 2 成体干细胞 2.1 胰腺干细胞 人们对胰腺干细胞的了解并不多, Zuiewske等[17]证明了在人和大鼠的胰管及胰岛组织 存在胰腺干细胞,这些细胞表达巢蛋白-神经干细胞 特征性标志,不表达胰管上皮或胰岛细胞的标志,事实 上胰腺干细胞的“身份”并不明确。Pamiya等[18]将消化 的胰腺组织制成单细胞悬液,用添加正常小鼠血清的 低糖培养基对其进行培养,生长出单层上皮样细胞,这 些细胞具有很强的自我更新能力和分化潜能,并能诱 导分化为含有α、β和δ胰岛细胞,将其移入糖尿病模 型鼠后,能够逆转胰岛素依赖性糖尿病病情,从而为治 疗Ⅰ型糖尿病的提供了新的胰岛资源。 Weir等[19]分离人胰管细胞培养,成功分离出了胰 腺干细胞,并将其分化为既含胰管细胞又含胰岛细胞 的细胞群,这些细胞群能分泌胰岛素,其分泌量随着浓 度的增高而增多,用免疫组化等证明了这些细胞 群含有胰岛的所有细胞类型。Bonner-Weir等[20]已在 体外成功地将成人胰腺导管上皮组织扩增并转分化为 胰岛样细胞集落,这些体外培养出的胰岛可分泌胰岛 素、胰高血糖素、胰多肽及生长激素和 CK19等,且在 葡萄糖刺激时分泌胰岛素。最近 Lin等[21]用添加了必 需生长因子的无血清培养基培养了 Nestin和 PDX-1 表达阳性的胰腺干细胞,结果单层纺锤状细胞长出,能 分化为胰岛素、高血糖素和生长激素抑制素阳性细胞, 同时能显示同基质干细胞相同的标记。尽管这些细胞 的作用机制还需要更进一步的研究,但是胰腺干细胞 的临床应用也是治疗糖尿病的好策略。 2.2 造血干细胞 造血干细胞是目前研究最为广泛、应 用最为成熟的成体干细胞,其可塑性比较强,在一定条 件下可以转分化为其他类型的干细胞,而其在糖尿病 中的研究也有所报道。Shah等[22]将胰岛素原基因通过 腺病毒转染造血干细胞,并将这些干细胞静脉注射到 正常大鼠和链唑霉素造模的糖尿病大鼠中,测定血糖 浓度和不同组织的胰岛素原基因的表达情况,每一个 动物大约注射 107个细胞,结果注射干细胞大鼠的血 糖水平恢复到了正常水平,约 1/3的动物出现了好转, 对照组鼠 1周后在肝、脾、胸腺、脑和心脏组织中有前 胰岛素原基因的表达,6周后前胰岛素原基因仅在胸腺 表达,糖尿病模型鼠 2周后在肝、骨髓、脾脏、胸腺、外 周血淋巴细胞有前胰岛素原基因表达,6周时在胸腺和 淋巴细胞仍有其表达,说明了注射前胰岛素原基因转 染的造血干细胞可以短期的使糖尿病病情好转。 Kang等[23]将 β半乳糖转基因小鼠的骨髓移植入 糖尿病鼠体内,通过骨髓成功的扩增,有效的阻止了糖 尿病的复发,尽管 50只鼠有造血系统的扩增,但是只 有1只鼠有胰岛依赖性,但在所有的鼠体内并没有检 测到β半乳糖阳性的胰岛细胞,为了测试是否对胰岛 依赖耐受性,从同种基因供体鼠来源的胰岛和造血细 胞注入糖尿病鼠,一半的糖尿病鼠有所好转,因此同种 骨髓移植可以治疗自身糖尿病,而这些骨髓产生细胞 能够分化为胰岛功能细胞。Beilhack等[24]将组织相容 性抗原相同的纯化的造血干细胞移植入NOD小鼠中, 可以阻止糖尿病的进一步发展,非骨髓去除性预处理 对糖尿病有保护作用,这也显示了对于非肥胖型糖尿 病的骨髓移植的去骨髓预处理包括T细胞,并不是必 需的,这说明对于MHC相同的骨髓移植的非骨髓预处 理可以成功的治疗自身免疫性糖尿病。 Chilton等[25]取 NOD小鼠造血干细胞和耐受性 的小鼠造血干细胞移植物,其特点是NOD小鼠造血干 细胞明显高于耐受性的小鼠造血干细胞,在同种基因 的受体鼠中它们并不需要另外的促进移植细胞的植 入,另外当在增加更多数量的同系基因的造血干细胞 时,这些细胞显示了明显的竞争优势,并产生了更多的 脾克隆、颗粒细胞和巨噬细胞形成集落单位,这些造血 干细胞有更好的对于间质细胞衍生因子的趋化性。 2.3 其他种子细胞 BlyszczukP[26]等进一步证实在成 体组织中存在着成体干细胞,骨髓间充质细胞、胰腺导 管细胞、肠和肝均可以提供有功能的胰腺内胚层细胞。 其中主要以神经干细胞和骨髓基质干细胞为主,通过 化学诱导和转基因的方法形成分泌胰岛素的 β细胞, 不过这方面的研究相对较少。 Burns等[27]从胎鼠脑中分离神经干细胞,其在体 外扩增并诱导分化为能够表达前胰岛素原 mRNA,分 化的细胞能够表达成熟 β细胞的转录和功能元件,这 ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com秦逸人,等.干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来 4804 CRTER 沈阳1200邮政信箱 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 秦逸人,等.干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来 ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 说明分化细胞显示了典型的胰腺β细胞的功能应答及 新陈代谢中葡萄糖依赖性的增加,这些实验说明了神 经干细胞有分化成β细胞来治疗糖尿病的潜能。 Chen等[28]将骨髓基质干细胞用尼克酰胺行先期 诱导 24h,接着用无血清的诱导液培养 10h,通过免 疫组化检测胰岛素和巢蛋白表达和放射免疫测定胰岛 素量,将分化细胞移入糖尿病模型大鼠观察其移植效 果,结果显示分化细胞有典型的胰岛样细胞,胰岛素 mRNA及其蛋白的表达呈阳性,前分化细胞中巢蛋白 能检测到,而在分化细胞中的胰岛素含量远远高于前 期分化细胞,而把分化细胞注入糖尿病大鼠后,其血糖 水平明显的降低,这些说明了骨髓基质干细胞诱导分 化的胰岛样功能细胞能够作为一种新的干细胞治疗方 法在临床上治疗糖尿病。 最近Lu等[29]将人胰岛素基因通过逆转录病毒转 染人骨髓间充质干细胞,结果显示这些体外培养的细 胞能够稳定的分泌胰岛素,并且持续3周以上。 3 存在的问题及展望 胚胎干细胞的研究大都是动物实验,对于人胚胎 干细胞研究虽有,但只能停留在体外的诱导研究,而胚 胎干细胞移植虽然成为可能,但是有很大的问题如:道 德和人类伦理问题,建立和扩增细胞株系比较困难, 在体内环境下干细胞的扩增和分化不易控制和排斥反 应等。胚胎干细胞诱导分化成胰岛素分泌细胞治疗Ⅰ 型糖尿病,畸胎瘤的形成是一大隐患;成体干细胞中胰 岛干细胞存在来源不足,其身份也不明确,移入也存在 免疫排斥等问题;造血干细胞和骨髓干细胞分化为胰 岛样细胞的量少,研究机制也不清楚,有待继续深入的 研究;其他的如神经干细胞,肝干细胞在这方面的研究 刚刚起步,还有更多的问题需要解决。干细胞定向分化 为胰岛β细胞的研究为糖尿病患者点燃了新的希望, 也为研究人员提供了新的突破口,其勿庸置疑的成为 治疗糖尿病的最佳种子细胞,虽然目前存在很多问题, 但随着干细胞生物学的发展,相信将来肯定能克服以 上困难,用细胞治疗攻克糖尿病。 4 参考文献 stem cellspromotesdifferentiationofnestin-positiveprogenitorand insulin-producingcells.ProsNatlAcadSciUSA2003;100(3):998-1003 AssadyS, MaorG, AmitM, etal. 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