线粒体分裂、融合与细胞凋亡

生物物理学报 第二十三卷 ACTA BIOPHYSICA SINICA 第四期 二oo七年八月 Vo1．23 No．4 Aug．2007 线粒体分裂、融合与细胞凋亡 蒋春笋 1,2， 肖伟明 ，¨ 陈 俭 (1．中国科学院动物研究所，北京 100080；2．江汉大学医学与生命科学学院，武汉 430050 3．北京大学生命科学院，北京 100871) 摘要：线粒体是高度动态变化的细胞器，其在细胞内不断分裂、融合并形成网状结构。线粒体的分裂和融合 是由多种蛋 白质精确调控完成的。r~pl／nnmlp，Fisl／Fislp，Caf4p和 Mdvlp参与线粒体分裂的调控； Mfia1／2／Fzo1p控制线粒体外膜的融合，而Mgmlp／OPA1则参与线粒体内膜的融合。在细胞凋亡过程中线粒体片 段化，网状结构被破坏，线粒体嵴发生重构，抑制这一过程可以部分抑制细胞 色素 c的释放和细胞凋亡。线粒体 形态对于细胞维持正常生理代谢和机体发育起着重要的作用，一旦出现障碍会导致严重的疾病。 关键词：线粒体；分裂；融合；细胞凋亡 中图分类号：Q2 0 引 言 线粒体是真核细胞的一种重要的细胞器，在细 胞代谢和生理过程中发挥着重要的作用。一方面它 们是细胞的能量工厂，其通过氧化磷酸化产生能 量，为大量重要的代谢反应供能；另一方面，它们 也是细胞内信号传导中心。线粒体通过影响细胞内 钙信号和活性氧产生，与细胞核进行信号交流，调 控细胞生长活动。更重要的是，在细胞凋亡过程 中，线粒体释放促凋亡因子，对细胞内凋亡信号进 行整合和放大。线粒体在细胞生长、凋亡和衰老等 生理、病理过程中扮演着重要的角色[1]。近年来， 随着荧光成像技术和三维成像技术的发展，人们对 线粒体形态的认识也发生了很大的改变。线粒体在 大多数细胞类型中形成一个网状组织 (mitochon— drial reticulum)【2】。线粒体网状组织是一个高度动 态的结构，该结构通过持续的、相互对立的融合和 分裂事件的平衡来维持【3I4J。越来越多的证据证明线 粒体形态的动态变化 (dynamics)对细胞功能的多 种方面具有非常重要的意义。 1 线粒体分裂的分子机制 近年来，参与线粒体分裂的一些蛋白逐步被鉴 定 出来 。参 与线粒 体外 膜 分裂 的蛋 白包 括 ： Drpl／Dnmlp、Fisl／Fislp、Caf4p和 Mdv1p，前 两 个在多种生物中存在并比较保守，后两种蛋白目前 仅在酵母中发现。 Drpl／Dnmlp蛋白是 Dynamin超家族的成员之 一 ， 它的氨基酸序列与 Dynamin具有很高的同源 性，有多个保守结构域 ，都有 GTPase结构域 (Dynamin domain)、中间区 (middle domain， Dynamin 2 domain)和介导 自组装的羧基末端的 GTPase效应 结 构 域 (GTPase effector domain， GED)嘲 (见图 1)。尽管 Drpl的脯氨酸富集区 (proline—rich domain，PRD)与 Dynamin的PRD都 具有与 Src Homolog 3 (SH3)结合的位点，但两 者不仅位置不同，序列也不相同，因此 Drpl可能 具有特殊的与 Dynamin不同的调控功能。此外 Drpl缺 少 Dynamin独 有 的 pleckstrin homology (PH)结构域，而此结构域具有膜定位的功能，说 明Drpl可能需要其他的蛋白辅助定位至线粒体【6】。 Drpl／Dnmlp在膜重构的过程中能形成同源多 聚体。免疫共沉淀和酵母双杂交实验结果显示， DrLm1p蛋白之间存在相互作用[71。纯化的Drpl能 够在体外组装成环形或螺旋形结构【8】，而不能水解 GTP的Drpl突变体则引起线粒体的过度网络化 (tubulation)，同时 Drpl在线粒体周围呈条纹状排 列【9】，这提示 Dnmlp／Drpl家族蛋白可能类似于 dynamin，能在线粒体膜上形成环状结构，并通过 水解 GTP产生能量，促进环收缩，从而推动膜分 裂。然而也有观点认为 Dr01与小分子 GTPase一 样，可以作为信号分子将其他活性组分募集到分裂 收稿 日期：2007—07—30 通讯作者：陈俭，电话：(010)64807321， E-mail：chenq@ioz．ac．cn 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 258 生 物 物 理 学 报 2007笠 GTPase结构域、几个 coiled．coil结构域和一个跨 膜区 (见图 1)。蛋白的氨基端是 GTPase，和其它 GTPase一样也有 4个保守的区域——G1一G4，这 是结合和水解 GTP所必需的[加】。这一区域相当保 守，其中的关键氨基酸一旦突变会使蛋白彻底丧失 功能。在 Fzo家族蛋白的羧基端有一个跨膜区，该 区域富含疏水氨基酸，并包含有线粒体定位序 ~lJ[191，通过蛋白酶保护实验证实该区域两次穿膜， 从而使 Fzo蛋白的 N端与 C端均位于胞浆中B721】， 这一结构类似于一个钩子挂在线粒体外膜上。Fzo 蛋白含有多个 coiled—coil结构域，在酵母、果蝇 Fzo的N端均有，而哺乳动物则没有，而所有 Fzo 蛋白在 C端以及跨膜区前各有一个 coiled—coil结构 域。已有的研究显示，coiled．coil所形成的 螺旋 区可能介导 Fzo蛋白之间的相互作用，或单个 Fzo 蛋白内部、或 Fzol和不同的融合蛋白之间的相互 作用，而且 C端的 螺旋对于 Fzo家族蛋白在线 粒体上的定位至关重要 。Koshiba等 】贝U发现 Mfnl／2的C端 Or．螺旋在线粒体聚集过程中起着重 要的作用，它们能形成同源 ／异源二聚体，从而使 两个线粒体相互靠近，进而融合。 线粒体内膜的融合是 由 Dynamin家族蛋 白 Mgmlp／OPA1介导的。很早以前人们就已经发现， Mgrnlp是出芽酵母维持线粒体基因组稳定[24】和正常 的线粒体形态 所必需的。Wong等人【26】建立了温 度敏感型 mgml突变体酵母株，发现当转换到抑制 Mgmlp表达的温度下，线粒体迅速发生片段化， 而且在交配过程中，mgml突变体的线粒体融合被 阻断，说明Mgmlp是线粒体融合必需的。Mgmlp 在哺乳动物中的同源物是 OPAl(optic a~ophy， OPA1)[2728]。Mgmlp／OPA1蛋白包括氨基端的线 粒体信号肽，两个疏水区，一个 GTPase结构域， 一 个中间区和羧基末端的 GED结构域 (见图 1)。 对 Mgmlp的 GTPase酶结构域中的保守位点进行 突变，发现 GTP结合和 ／或水解是融合所必须的， 影响GTP酶结构域的突变会减弱或消除Mgmlp促 进线粒体融合的能力[29,3o]。在一些情况下，过表达 Mgmlp的 GTP酶结构域突变体会导致相反的效 果，提示 Mgmlp与其他 dynamin蛋白一样，是一 种自组装 (assembling)的GTPase，可能可以形成 同源多聚物[30,3”。相应的，其 GED结构域可能和其 自组装有关，该区域的突变会抑制 Mgmlp介导的 线粒体融合 。Mgmlp／OPAl蛋白家族均定位于 线粒体膜间隙，近来的研究发现 Mgmlp以两种蛋 白形式存在，一种分子量较大 (1一Mgmlp)，一种 分子量较小 (s．Mgmlp)，s—Mgmlp是由线粒体膜 间隙 的丝氨 酸 蛋 Et酶 Rbdlp (rhomboid)切 割 l-Mgmlp形成的[32,33]。缺乏 Pcplp的酵母线粒体会 片段化，这一现象可以通过敲除分裂相关蛋 白 Dnmlp使线粒体恢复正常形态[341。但 Pcplp缺失 并 不 抑 制 线 粒 体 的 融 合 ， 这 提 示 Pep1p和 s—Mgmlp并不是线粒体融合所必需的，而可能是提 高融合的效率，或是参与维持线粒体的网状结 构 。将 人 的 Pcplp的 同源 物 Parl(presenilin— associated rhomboid—like)转入缺失该基因的酵母 中，可以重新产生 s-Mgmlp，说明 Pcplp在进化 中相当保守[33】。近期 的研究发现在人的同源物 OPAl中也存在着这种切割，但是关于切割 OPA1 的酶 目前有不 同报道，Cipolat等嘲通过对 Parl√． 鼠的研究发现 Parl对于 OPA1的切割和内膜的重 构起重要的作用，Ishihara等嘲则认为只有 L型的 OPAl在线粒体融合中起作用，而线粒体基质中的 m—AAA蛋白酶 paraplegin可以切割 I-OPAl，从而 导致线粒体片段化。 3 线粒体形态变化与细胞凋亡 对细胞凋亡的研究发现，线粒体在凋亡发生过 程中起着重要的作用【蚓，主要表现在：第一，在凋 亡发生以前，膜的完整性受到破坏，由于内膜对氢 离子的通透性增加引起线粒体膜电位消失；第二， 在细胞凋亡过程中，有多种凋亡诱导因子从线粒体 释放 ，如 细胞 色 素 C、AIF、Smac／DIABLO 和 procaspase．2，．3，．8，．9等在凋亡发生过程中从线粒体 膜间隙被释放到细胞质中，随后引起典型的凋亡变 化；第三，有一些凋亡诱导物能够诱导线粒体上的 膜透过性转运孔开放，导致线粒体膜电位消失和释 放促凋亡蛋白；第四，对 Bc1．2家族蛋白的广泛研 究表明，它们主要通过调节线粒体的功能来调控细 胞的凋亡。 在多种凋亡模型中都发现了线粒体的片段化。 在 使用 酪氨酸 激 酶抑制 剂 Herbimycin A诱 导 Colo-205细胞凋亡时，超微结构分析发现，线粒 体片段化 ，数量显著增加，同时凋亡小体形成， TUNEL阳性的细胞增加 ，caspase的底物 PARP [Poly(ADP ribose)polymerase，PARP)被切割 。 还不清楚在 Herbimycin处理的细胞中发现的线粒 体片段化是一个非特异性的现象，还是它直接参与 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 线粒体分裂、融合与细胞凋亡 259 了凋亡信号的传导。Frank等人首先发现了线粒体 分裂相关蛋白Drpl对细胞凋亡的调控作用，他们 用荧光探针对线粒体进行染色，再用共聚焦显微镜 观察其形态，发现细胞在凋亡刺激下，线粒体总是 从网状结构转变为分散的线粒体。在细胞凋亡的早 期阶段，线粒体形态变化的同时线粒体数量显著增 加，说明线粒体分裂参与了这一过程。caspase抑 制剂可以抑制凋亡的发生但不影响线粒体的片段 化，而 D11)1 不仅能够抑制凋亡线粒体的片段 化，还可以抑制或延迟细胞色素 C的释放、线粒体 膜电位的下降和核 DNA的片段化等凋亡表现[49】。 在线虫发育中凋亡的细胞也会出现线粒体的片段 化，这一过程是由线虫 Bzl一2家族中仅有 BH3结 构域的 EGL一1引起的，这一现象的发生依赖于线 虫的 Drp一1但不依赖于 CED一3／caspase的激活，过 表达抑制凋亡的 Bcl一2／CED9可以抑制线粒体的片 段化，这一结果提示 Bcl一2家组蛋白可能参与了线 粒体形态的调控 。 凋亡过程中的线粒体分裂是如何被诱导的?已 有的研究提示 Bax／Bak可能起着重要的作用。在 staurosporine(STS)处理下，Bax迁移到线粒体表 面上，与介导线粒体分裂蛋 白Orpl定位在一起， 可能帮助募集更大量的 Drpl到线粒体表面以加强 分裂活性 。甚至在 Drpl sA抑制了凋亡的时候， Bax也定位到 Drpl在线粒体分布的点上 ，提示 nrpl对凋亡 的控制是 Bax重分布 下游 的事件 。 Wasiak等⋯通过荧光漂白技术发现，Bax／Bak激活 可以促进 Drpl定位并锚定于线粒体外膜上，这一 过程依赖于Bax／Bak而不是 Fisl。最新的一些研究 发现，Bax和 Bak在维持细胞线粒体形态上起着重 要的作用。Bax可以通过激活 Mfn2的组装，改变 其在线粒体膜的分布，促进线粒体的融合[42】。Bak 可以与 Mfial和Mfn2相互作用，在发生细胞凋亡 时，Bal(与 Mfn2分离，但其和 Mfnl的相互作用 加强从而促进线粒体的片段化，Bak的 BH3结构 域的突变可以抑制凋亡刺激时 Bak与 Mfn2的解 离，从而抑制线粒体的片段化[431。在凋亡过程中线 粒体融合有助于抑制线粒体片段化，通过 RNAi下 调 Mfial或 Mfn2的表达，均可以增强细胞对凋亡 信号的敏感性 。然而也有研究表明，抑制线粒体 分裂并不能抑制 Bax／Bak引起的细胞凋亡，仅仅是 减慢了细胞色素 C的释放，提示线粒体形态的改变 可能并不是细胞凋亡的必须条件 。 内质网 (ER)的Ca2+释放可能也是引起凋亡 细胞线粒体片段化的一个重要原因，Breckenridge 等[舶]发现 ER整合蛋白BAP31的caspase 8切割产 物 P20可以引起 ER释放 Caz+，从而促进线粒体 Ca2+吸收和 Drpl的募集，引起线粒体片段化，抑 制 ER释放 Ca2+或是转染 Drpl 距，对线粒体片段 化和 p20诱导的凋亡有抑制作用，这说明线粒体片 段化是 P20引起细胞凋亡的一个必要过程，过表 达 Dl1)1 距足以抑制线粒体通透性、细胞色素c释 放和 caspase的活化。在 Bik通过 ER引起的凋亡 过程中，Drpl也有类似的作用[47,48]。然而也有相反 的证据表 明 Drpl可 以抑制 Ca2+引起 的细胞凋 亡 ，因此 Drpl在内质网途径细胞凋亡中的作用 尚有待于进一步验证。过表达分裂蛋白hFisl可以 导致线粒体片段化、细胞色素 c释放和后续的凋亡 事件[12】，而对 Fisl与细胞凋亡关系的进一步研究 发现 Fisl并不能激活 Bak／Bak，而是依赖于内质网 Caz+释放引起线粒体功能障碍从而诱导细胞凋 亡 。 线粒体内膜的重构在细胞凋亡过程中对于细胞 色素 C的释放起着重要的作用，一系列的研究表明 OPAl是内膜重构的决定因子之一。在 Hela细胞 中，利用 RNAi下调 OPAl的表达，可以导致异常 的内膜结构、线粒体片段化以及凋亡的发生，并主 要表现为膜电位降低、细胞色素 C释放和凋亡性核 形态变化[5】】。而在这种情况下过量表达抗凋亡的 Bcl一2家族蛋白都可以抑制细胞死亡，但是不抑制 线粒体片段化 ”。Frezza等【删发现 OPAl的 L型 和 S型可以形成多聚体，从而控制线粒体嵴的形 态，Bid可以加宽线粒体嵴连接，破坏 OPAl寡聚 体，促进细胞色素 C释放，诱导细胞凋亡，过表达 OPAl则可以稳定嵴结构，延缓这一进程；线粒体 内的蛋白酶 Parl对于 OPAl的寡聚化形成以及线 粒体嵴结构的维持起着重要作用，Parl缺失对线粒 体形态并无显著影响，但在促凋亡刺激下更容易释 放细胞色素 C，且过表达 OPAl不能延缓这一进 程，提示 Pad是通过 OPAl在细胞凋亡中起作 用【碉。 对酵母细胞凋亡的研究显示，线粒体分裂相关 蛋白Dnmlp、Mdvlp、Fislp均在凋亡过程中起作 用 ，但他们 的作用并不完全一致[52】，Dnmlp和 Mdvlp可以促进酵母细胞的凋亡，这种作用可以 被人的抑凋亡蛋白Bcl2、Bcl—xL所抑制；而 Fislp 则可以抑制酵母细胞的凋亡，而不是和其在人的同 源物 hFisl那样，有促进凋亡的作用[12】。 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 线粒体分裂、融合与细胞凋亡 261 体融合；然而，这个区域的特点是在相邻的线粒体 之间存在一些连接 (stud—like bridging elements)， 看起来允许线粒体基质之间进行交换 。对 Mm 的敲除可使胚胎致死，提示哺乳动物的Mfns可能 对胚胎的正常发育有重要的意义[铜。 近年的研究表明线粒体分裂融合与多种疾病密 切相关。Verstreken等人对果蝇神经细胞的研究提 示线粒体分裂在神经信号传递过程中发挥着重要的 作用，Drpl突变的果蝇在突触处缺少线粒体，尽 管其神经信号的传递与突触囊泡的释放与融合在突 变体中不受影响，但在同样的信号刺激下，突变体 不能进行正常的神经肌肉接头信号传递；进一步分 析显示，主要是囊泡池 (reserve poo1)囊泡受到 影响，不能保持稳定，而外加 ATP可以得到部分 恢复，提示 Drpl突变影响了线粒体分布，从而导 致突触线粒体缺乏，能量合成障碍[561。最近在新英 格兰医学杂志报道了首例 Drpl突变的病例，该突 变位于 Drpl中间区，可以引起线粒体和过氧化物 酶体形态改变，并引起出生后大脑发育障碍、视神 经萎缩、高乳酸血症、血长链脂肪酸浓度升高等一 系列严重的并发症，为致死突变 。 线粒体融合相关基因的突变和神经疾病关系密 切 ， OPAl在常染色体遗传性 视神经萎缩 症 (autosomal dominant optic a~ophy，ADOA)患者 中是突变的[27,28]。虽然这个基因在多种类型的细胞 中都表达，但病人只是在眼睛中显示出症状，并由 于视网膜胶质 (ganglion)细胞的退化而视力受损。 发病原因可能是由于 ADOA病人的线粒体形态发 生缺陷，导致了一定的线粒体呼吸障碍，造成供能 不足，而视网膜 ganglion细胞对此异常敏感，从而 引起视神经萎缩症。最近发现在 CMT2A神经疾病 ( Charcot—Marie—Tooth neuropathy type 2A， CMT2A)患者中存在Mfn2的突变[58,591。CMT是一 种常见的外周神经疾病，主要表现为远端肌肉无力 并萎缩、踺反射减弱或消失、足畸形等临床症状， 其已知的病因主要是突变基因损伤了非线粒体的膜 泡运输 ，Mfn2突变尚是首次发现。CMT2A中 Mfn2的突变主要集中在 GTPase结构域和两个 coiled-coil区[58,59]，而这两个区域的突变可能影响了 GTPase的活性和 Mfn2在线粒体外膜的定位，进 而影响到线粒体融合。Mfn2与 CMT2A的病理联 系目前尚不清楚，一个可能的原因是 Mfn2突变影 响了线粒体分布和 ATP合成，从而损伤了线粒体 运输导致疾病【6l】。 5 总结与展望 线粒体是高度动态变化的细胞器，其在细胞内 不断分裂、融合、运动并形成网状结构，抑制线粒 体融合和促进线粒体分裂导致线粒体片段化，反 之，抑制线粒体分裂和促进线粒体融合导致线粒体 在细胞内融合程度增加，形成分支化和高度融合的 线粒体。线粒体分裂和融合的异常不仅导致线粒体 形态和功能的变化，同时对细胞功能的多种方面具 有非常重要的意义，并和疾病的发生密切相关。 近年来，对于线粒体形态的研究尽管取得了一 定的进展，但仍然有大量的问题需要解决。从理论 上，线粒体必需根据细胞的状态和需要通过融合与 分裂改变其形状，但这一过程是如何被精确地调控 的，线粒体形态变化又是如何和细胞生理状态耦联 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