雨生红球藻3个株系的生长及对光盐反应初探

雨生红球藻3个株系的生长及对光盐反应初探 () 应用与环境生物学报 2001 ,7 1:33,36 2001202225 Chi n J Appl Environ Biol = ISSN 1006 - 687X 3 雨生红球藻 3 个株系的生长及对光盐反应初探 叶 勇 应巧兰 ( )宁波大学海洋生物工程重点实验室 宁波 315211 () 摘 要 对雨生红球藻 3 个株系 No . 3 、No . 712 和 No . 797的生长 、对诱导虾青素形成的光盐因子的反应进行了比较 , - 1 - 1 - 1 - 1 () 结果表明 :No . 3 、No . 712 和 No . 797 的生长速率分别为 0. 128 d ,0. 137 d 和 0. 144 d ;外加盐的量较大 4 g L 时导 - 1 () 致雨生红球藻细胞数的减少 ,而外加盐浓度较低 2 g L 时 ,细胞数的反应因株系和光照的不同而有所差异 ; 盐和强 光照均导致静细胞比例显著增加 ;盐的加入仅在弱光照下诱导雨生红球藻 3 个株系的虾青素累积 ,在强光照下却导致3 个株系虾青素含量的下降 ,强光照下不外加盐时 No . 3 、No . 712 和 No . 797 藻液的虾青素含量无显著差异 ,分别为 2. - 1 15 、2. 77 和 2. 45 mg L . 图 1 表 2 参 12 关键词 雨生红球藻 ; 株系 ; 生长 ; 虾青素诱导 ; 光照 ; 盐 CL C Q949 . 212 STUDY O N D IFFERENCES IN GROWTH AND RESPO NSES TO ILL UMINATIO N AND SAL T OF THREE HA EMA TO CO CCUS PL UVIAL IS STRAINS YE Yong & YING Qiaolan ( )Marine Biotechnology Key L ab , Ningbo University , Ningbo 315211 , China Abstract Growth and responses to two astaxanthin2inducing factors , illumination and salt , were compared among ( ) three strains of Haematococcus pluvialis strains No . 3 , No . 712 and No . 797. The growth rates of strains No . 3 , - 1 - 1 - 1 No . 712 and No . 797 were 0 . 128 d , 0 . 137 d and 0 . 144 d , respectively. The additional high salt concen2 - 1 tration of 4 g L resulted in the decrease in cell numbers of the three strains , while different responses of cell - 1 numbers to low salt concentration of 2 g L were observed different in different strains and under different illumi2 nation levels. The ratios of static cell significantly increased with addition of salt and under high illumination level ( ) E = 12 000 lx. Salt induced the astaxanthin accumulation in the three strains only under low illumination level ( ) E = 1 200 lx. On the contrary , salt decreased the astaxanthin accumulation in the three strains under high illu2 ( ) mination level E = 12 000 lx. Without exogenous salt and under high illumination level , astraxanthin concen2 trations of strains No . 3 , No . 712 and No . 797 were not significantly different , and were 2 . 15 , 2 . 77 and 2 . 45 mg - 1 L , respectively. Fig 1 , Tab 2 , Ref 12 Key words Haematococcus pluvialis ; strain ; growth ; astaxanthin induction ; illumination ; salt CL C Q949 . 212 ( 近年来淡水微藻雨生红球藻 Haematococcus plu2 ,如大多数研究者认为营养盐缺乏和盐 矛盾的观点 3 , 4 ( β) βvialis Flot . et Will产生虾青素 3 ,3′2二羟基2,′胡 萝的加入将促进雨生红球藻的虾青素累积, 但庄 ) 卜素2 4 ,4′2二酮的现象日益受到研究者的重视 , 其惠如等认为在氮 、磷饥饿下和外加盐的状况下雨生 原因是虾青素是很好的着色剂并具有较高的商业 红球藻的虾青素积累并无显著提高 ,而只有高光强 1 , 25 . 不过 ,无论是雨生红球藻的生长还是其虾 利润才诱导虾青素的累积. 普遍认为雨生红球藻的生 6 - 1 ( 青素累积诱导的非生物因素 强光照 、营养盐缺乏 、长较慢,但庄惠如等却得出了高达 7 . 23 d 的生 5 ) 盐 和亚铁化合物方面均存在不同的认识甚至相互长速率. 这些差异可能是由于不同研究者所用的 株系不同导致的 ,因为有研究指出 ,雨生红球藻的不 7 收稿日期 : 2000208214 接受日期 : 2000211220 同株系对光照有不同的生长反应,不同株系累积 ()3 宁波市博士基金资助项目 No :0011012 8 虾青素的量有所不同. 然而 ,不同株系对外加盐的数据处理1 . 5 ) (反应如何 ? 外加盐是否会促进强光照下不同雨生红 用 22way ANOVA 双因素方差分析分析光照和 球藻株系的虾青素积累 ? 这些问题还是不明确的. 盐对总细胞数 、静细胞比例和虾青素含量的影响及 本研究同时对雨生红球藻 3 个株系的生长 、虾青素其相 互 作 用 . 帄 均 值 差 异 水 帄 以 Student2Newman2 的光盐诱导进行了比较 ,为进一步认识和利用该藻 Keuls 法判定. 提供一些科学依据. 2 结果与讨论 1 材料与 2 . 1 三个株系的生长差异 1 . 1 实验藻株与基本培养条件雨生红球藻 No . 3 株 、No . 712 株和 No . 797 株细 雨生红球藻 No . 3 、No . 712 和 No . 797 三个株系 (1 . 由对数生长期 0,18 胞数随培养时间的变化见图 的藻种均由中国科学院水生生物研究所典型培养物 ) ( ) ( ) d细胞数 n 与培养天数 t 所得的指数拟合方程 保藏委员会淡水藻种库提供. 所有培养均以 BBM 为为 : 0. 128 t 基本培养基 ,日光灯连续光照 ,25 . 0 ?1 . 0 ?下三角 ( )n = er = 0 . 918 No . 3 : 0. 137 t 瓶静置培养.( )No . 712 : n = er = 0 . 956 0. 144 t 1 . 2 生长实验( )No . 797 : n = er = 0 . 951 在 250 mL 三角瓶中接种处于对数生长期的培 即 No . 3 株的生长速率最慢 ,No . 712 株其次 ,No . 797 - 1 - 1 养物 ,加培养基至 150 mL 并使得藻液起始浓度 n0株最快 ,其值分别为 0 . 128 d , 0 . 137 d 和 0 . 144 4 - 1 - 1 () ( cell= 1 . 0 ×10mL . 室 内 培 养 , 光 照 度 illumi2 d . 然而 ,这些株系与其他一些雨生红球藻的研究 ) nanceE = 1 200 lx ,每次取样 5 mL 进行细胞计数测 相比 ,生长速率较慢 , 如 金 传 荫 等 得 出 红 球 藻 水 生定生长速率. 每个株系设置 3 个重复. - 1 10 748 株在 BBM 培养基中的生长速率为 0 . 77 d , 1 . 3 对色素诱导因子反应的实验庄惠如等得出雨生红球藻在完全 BBM 培养基中的 将 1 . 2 中处于生长停滞期的同一株系 3 个瓶的 - 1 5 分裂速率为 7 . 23 d . 藻液混合摇匀 ,取 10 mL 测定总细胞数 、静细胞数和 虾青素含量作为初始值 ,余液分装于 18 个 50 mL 三 角瓶 ,每瓶 20 mL 藻液 ,进行光强和盐对雨生红球藻 ( 影响的实验. 光强因子设置 2 个水帄 ,强光照 E = 12 ) ( ) ρ 000 lx和弱光照 E = 1 200 lx; 盐处理设置 3 个 - 1 - 1- 1 () NaCl水帄 :0 g L , 2 g L 和 4 g L . 各处理设置 3 个重复 ,1 d 和 7 d 后各取 5 mL 藻液测定总细胞 数 、静细胞数和虾青素含量. 1 . 4 测定方法 在生长实验中游动细胞所占比例较大 , 经罗戈 图 1 雨生红球藻 3 个株系生长速率的比较 Fig. 1 Comparison of the growth rates of three Haematococcus pluvialis strains 氏液固定后用血球计数板进行总细胞数的测定 ,由 ( ) ( ) 对数生长期细胞数 n与培养天数 t得指数拟合方 2 . 2 三个株系对色素诱导因子强光照和加盐的反 bt ( ) μ 程 n = ae,则生长速率 = d ln n / d t = b. 在对色 应 素诱导因子反应的实验中 ,由于大多数为静细胞 ,未将生长停滞期藻液经不同光照和不同加盐浓度 经固定而直接计数 ,同时动细胞数和静细胞数 ,处理 1 d 与 7 d 后取样分析总细胞数 、静细胞比例和 二者总和为总细胞数.虾青素含量的结果列于表 1 ,其光照与加盐对这些参 按 Lichtenthaler 的方法进行色素提取和总胡萝 数影响的相互作用统计结果见表 2 . 9 ( 卜素含量测定. 由于虾 青 素 仅 在 厚 壁 孢 子 静 细 处理 1 d 后 ,3 个株系的总细胞数在光照与加盐 ) 胞中累积 , 且在厚壁孢子中占总胡萝 卜 素 含 量 的浓度间均无相互作用 ,即在 2 种光照水帄下总细胞 8 80 %,因而藻液中虾青素的含量由下式估算 : 虾青 数对 3 种盐浓度处理的反应相同. 但处理 7 d 后 ,3 素含量 = 总胡萝卜素含量 ×静细胞比例 ×80 %. 个株系的总细胞数在光照与盐浓度间均有显著相互 1 期 叶 勇等 : 雨生红球藻 3 个株系的生长及对光盐反应初探 35 3表 1 不同光照与加盐处理条件下雨生红球藻 3 个株系的细胞状态和虾青素累积 Table 1 Cell status and astaxanthin accumulation of three Haematococcus pluvialis strains under different illumination and salt treatments 总细胞数 Total 虾青素含量 Astaxathin 静细胞比例 ρ() NaCl/ 4 - 1 - 1 ( ) () Static cell ratio % ()cell number 10content mg L mL t/ d E/ lx - 1 g L No . 3 No . 712 No . 797 No . 3 No . 712 No . 797 No . 3 No . 712 No . 797 12000 0 5 . 5 8 . 7 8. 8 85 74 20 0 . 38 1. 86 0 . 14 2 5 . 6 8 . 6 7. 4 91 91 18 0 . 12 0. 62 0 . 13 1 4 6 . 6 8 . 5 7. 0 96 100 87 0 . 06 0. 17 0 . 70 1200 0 9 . 0 9 . 4 14 . 3 39 13 7 0 . 06 0. 03 0 . 01 2 7 . 2 5 . 8 13 . 5 98 54 20 0 . 08 0. 22 0 . 05 4 5 . 1 5 . 2 6 . 3 100 95 60 0 . 07 0 . 01 0 . 42 12000 0 11. 2 24. 2 11 . 7 100 100 100 2 . 15 2. 77 2 . 45 2 12. 0 7 . 1 6. 2 100 100 100 1 . 13 0. 80 1 . 49 4 6 . 0 6 . 7 5. 9 100 100 100 1 . 20 0. 81 0 . 46 7 1200 0 13. 5 18. 9 26 . 3 100 89 19 0 . 02 0. 22 0 . 09 2 5 . 8 13. 5 20 . 9 100 98 87 0 . 15 0. 45 0 . 22 4 5 . 9 13. 5 4. 5 100 100 100 0 . 12 0. 46 0 . 34 4 - 1 3 n/ 10mL : No . 3,6 . 5 ; No . 712,8 . 9 ; No . 797,10 . 4 0( ) 静细胞比 Static cell ratior/ % : No . 3,31 ; No . 712,16 ; No . 797,4 0- 1 ρ() Astaxathin/ mg L : No . 3,0 . 02 ; No . 712,0 . 02 ; No . 797,0 . 01 0 作用 ,即盐加入量的不同会影响藻液细胞浓度对光照 ,但光照与盐处理间存在显著相互作用 ,即 显著增加 - 1 - 1 不同外加盐水帄下静细胞比例对光照的反应不同 : 3 的反应 :当外加盐浓度为 0 g L 和 4 g L 时 ,No . 3 ( ( ) 株系总细胞数在强光照 E = 12 000 lx与弱光照 E个株系强光照导致的静细胞比例的增加均为无外加 - 1 ) = 1 200 lx间无显著变化 , 而外加盐浓度为 2 g L 盐时最明显 , 而在有外加盐尤其是外加盐浓度为 4 - 1时 ,强光照导致总细胞数的显著提高 ; 强光照处理仅 g L 时光照水帄对静细胞比例的影响不显著. 处理 7 - 1() 在不外加盐 0 g L 时导致 No . 712 株系总细胞数的 d 后 ,强光照下 3 个株系的细胞均全为静止状态 ; 弱- 1 - 1 ( ) 显著增加 ,而在两种外加盐处理 2 g L 和 4 g L 光照下 No . 3 株系亦全为静止细胞 ,No . 712 和 No . 797 - 1 下强光照均导致总细胞数的明显减少 ;在外加盐浓度 株系则仅在外加盐浓度为 4 g L 时全为静止细胞 , - 1- 1- 1 为 0 g L 和 2 g L 时 ,强光照均使 No . 797 株系总细 而在无外加盐和外加盐浓度为 2 g L 时均有一定数 - 1 - 1胞数减少 ,而外加盐浓度为 4 g L 时 ,两种光照处理 量的游动细胞 . Cordero 等也观察到 4 g L 的外加 Na2 对总细胞数的影响无显著差异. 处理 7 d 后 ,在 2 种 Cl 浓度 会 促 进 雨 生 红 球 藻 厚 壁 孢 子 即 静 细 胞 的 形光照水帄下总细胞数对 3 种盐浓度处理的反应也有 ( 4) 明显差异 : No . 3 株系强光照 E = 12 000 lx时总细胞 成. - 1 ( 数在 4 g L 盐浓度下明显减少 , 弱光照 E = 1 200 - 1 ) ( lx时在 2 g L 盐浓度下即显著减少 ; 强光照 E = 表 2 光照与盐处理对雨生红球藻 3 个株系总细胞数 ) 12 000 lx时盐 的加入导致 No . 712 株系总细胞数的 静细胞比例和虾青素含量影响的双因素方差分析 ( ) 显著减少 ,而弱光照 E = 1 200 lx时 3 种盐浓度处理 Table 2 Results of 2 way ANOVA for the effects of illumination and salt on total cell number , static cell ( 间的总细胞数无显著差异 ;No . 797 株系强光照 E =ratio and astaxathin content of three - 1 ) 12 000 lx时总细胞数在 2 g L 盐浓度下即明显减 Haematococcus pl uvi alis strains - 1 ( ) 少 ,弱光照 E = 1 200 lx时在 4 g L 盐浓度下才显 交互作用显著水帄 参数 处理时间 parameter Time No . 3 No . 712 No . 797 著减少. 由此可见 ,外加盐的量较大时导致雨生红球 总细胞数 1 d NS NS NS 藻细胞数的减少 ,我们在显微镜下观察到当外加盐浓 3 3 3 3 3 3 Total cell number 7 d - 13 3 3 3 3 3 1 d 静细胞比例度为 4 g L 时 ,3 个株系 2 种光照下藻液细胞残体均 Static cell ratio 7 d NS 3 3 3 3 3 3 - 1 增多 ,而外加盐浓度为 2 g L 时 ,细胞数的反应因株 3 3 3 虾青素含量1 d 3 3 系和光照的不同而有所差异. Borowitzka 等观察到外 Astaxathin content 7 d 3 3 3 3 3 3 3 3 - 1 11 加 NaCl 浓 度 为 8 g L 时 导 致 大 量 细 胞 死 亡; NS : P > 0. 05 ; 3 :0. 01 < P < 0. 05 ; 3 3 : 0. 05 < P < 0. 01 ; 3 3 3 : P < 0. 005 - 1 Cordero 等得出外加 NaCl 浓度为 4 g L 时灰份含量 4 增加即藻液细胞残体增多的结论. 处理 7 d 后 ,雨生红球藻 3 个株系的虾青素含量 均在强光照下有较大幅度的提高. 光照强度增加时植 处理 1 d 后 ,外加盐和强光照均导致静细胞比例 12 物体内会累积活性氧而导致对植物的伤害, 雨生 红球藻累积的虾青素具有较强的抗氧化能力 ,在一定 ) () () (Wu SG吴松刚, Chen YX陈跃兴, Chen J 陈健. The ef2 程度上抵抗强光照的伤害 . 盐与光照在对 3 个株系虾 fect of nutritional stresses on accumulation of astaxanthin in 青素含量的影响方面存在极其显著的相互作用 :盐的 ( Haematococcus pluvialis . Acta Hydrobiologica Sinica 水 生 生 物 加入仅在弱光照下诱导雨生红球藻 3 个株系的虾青 ) () 学报. 2000 ,24 3:208,213 素累积 ,在强光照下却导致 3 个株系虾青素含量的下 Zhang DH , Lee YK. Enhanced accumulation of secondary 6 降 . 另一值得注意的是弱光照下盐的加入所导致的虾 carotenoids in a mutant of green alga , Chlorococcum sp . J ournal 青素含量的增幅比光照强度提高导致的增幅小得多 , of Applied Phycology . 1997 ,9 :459,463 因而在实际生产中 ,采用提高光照强度而不是增加盐 7 Harker M , Tsavalos AJ , Young AJ . Factors responsible for astax2 anthin formation in the chlorophyte Haematococcus pluvialis . 浓度是提高虾青素产量的有效方法 ,在强光照下外加 () Bioresource Technology . 1996 ,55 3:207,214盐只能适得其反. 强光照下不外加盐时 No . 3 、No . 712 8 Harker M , Tsavalos AJ , Young AJ . Autotrophic growth and 和 No . 797 株系藻液的虾青素含量无显著差异 ,分别 carotenoid production of Haematococcus pluvialis in a 30 liter air2 - 1 为 2 . 15 、2 . 77 和 2 . 45 mg L .lift photobioreactor. J ournal of Fermentation and Bioengineering . 参考文献 () 1996 ,82 2:113,118 Lichtenthaler HK , Wellburn AR. Determinations of total 9 Johnson EA , Villa TG , Lewis MJ . Phaffia rhodozyma as an astax2 1 carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different anthin source in salmonoids diets. Aquaculture. 1980 ,20 : 123, solvents. Transactions Biochemical Society . 1983 ,11 :591,592 134 () () () 10 Pulz O , Scheibenbogen K. Photobioreactors : design and perfor2 Jin CY金传荫, Song LR 宋立荣, Liu YD 刘永定, Gan 2 () mance with respect to light energy input . 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Biotechnology Letters . 1996 ,18 2:213,218 5 ( ) ( ) ( ) Molecular Biology . 1992 ,43 :83,116 Zhuang HR 庄惠 如, Shi QQ 施 巧 琴, Lu HS 卢 海 声, ?GB 和 SI 关系问题 作者 : 编辑先生 ,你们要求作者在文稿中用中国法定计量“GB”,但又常常要求用“SI”,两者是什么 关系 ? )( 编者 : 国家法定计量单位 GB 3100,3102293 1993212227 发部 ,1994207201 实施《量和单位》() ) (以下简称 GB明确规定 : SI 国际单位制是“我国法定计量的基础”,一切 SI 单位都是我国的法定计量 单位. 因此 ,凡是 SI 单位 ,都属我国 GB . 此外 , GB 中还公布了 16 个可与 SI 单位并用的我国法定计量单 2 () 位 ,即 min , h , d , ?, ′, ″, L 1, t , u , r/ min , n mile , kn , eV , dB , tex 和 hm,除 dB 外 ,这些非 SI 单位均 () 与 SI 单位有倍数或分数关系 见 GB 第 4 页表 5.