PCR扩增IS6110在结核病检测和流行病学中的应用评价

276 巾国人蒜共患病学报 ChineseJournalofZoonoses 2008，24(3) 文章编号：1002—2694(2008)03—0276—02 PCR扩增IS6110在结核病检测和流行病学中的应用评价馨 赵鸯云(综述)，朱玲(审棱> 中图分类母：R52文献标识码：A 疆入露魏6110(IS6110)是绪狻分支释鏊嫠嚣缓孛懿一 个多拷贝鹃保守片段。Thierry等猩1990年蕾先报道了结 核分支杆蔚一个插入序列的核苷酸顺序，并命名为IS6110。 IS6110中禽凑I361bp的核营酸税28bp豹发悫末端重复 彦弼，宅袋予插入序搿IS3家族，并盥只存在予结孩分支耔 菌复合群(Mycobacteriatuberculosiscomplex。MTC)中n’． 该序列在大多数结核分支杆菌分离株中拷贝数较高(大约 10～25拿)，宅是一耱霹移凄豹逡褥成分，不黼亲本懿莛糠 之间的IS6110拷贝数j阳在染色俸中位置是高度变异的，假 它在基因缎内发生转位、重复和缺失机率很低，因而不会影 畹宅佟力滚符痰遗传据悫豹援篷∞。垂予其拷煲数较多，农 同一结核秆菌基因组中相对稳定，因此是分子熊物学研 究结核杆菌的首选片段。本文就该序列在结核杆菌检测中 粒应用综述之。 1 PCR誊绥扩增靶浮秘检测结核秆蔼 一般认为。靶序列拷贝数越多．PCR的敏感性越高。因 为IS6110插入序列的拷贝数约有lO一25个，熙为结核杆德 复合群爨特有，爱疆选撵该彦甍终海扩增靶澎梦|j，霹羧褥蘩 较高的敏感性和特异性，从理论上讲应该比单拷贝序列(如 MPB64，MTP40)敏感性高10多倍，这从WasiullaRaft。3的 实验孛霹敬褥赘涯鹗，嚣瑟是PCR方法捡溺缨梭舞蓥豹饕 选基因。1989年HanceAJ等“3酋先将PCR技术应用予结 核分支杆菌检测。从而开辟了以PCR为代的分子生物学 技术检测、研究结核分支释莹的阶段，接着众多学者依擐 IS6110謦列设计了许多实验方案袋检溅结核杼菌。虽然该 序列在基因组中拷贝数较高。但是文献报道睁们PCR方法对 结核分技桦菌检出的敏感性和特异性有较大差异，这些差异 圭要是麦予PCR捡溺穷法豹敏惑豫秘耩凳毪爨受零|耪静设 计、实验条件的设置、标本的来源不同和处理方法不同、实验 室交叉污染等多种因素影响协113。随着PCR技术的不断发 展，获善遴PCR发爱戮巢式PCR，笈鼹PCR方法扩瓒 IS6110检测结核杆菌的敏感性和特异性越来越高．由于巢 式PCR反应进行两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位 赢的可能搜(因先与弱寮弓l貉都蔓补黪雩l物很少)增加了捻 灏翦敏感惶；又有两对粥R弓|物与梭溅的配对。增热了 检测的可靠性。nPCR较一般PCR敏感，可将同一组标本 的敏感性从76．65％撼蒜到93．04％l1996年以来在常规 KR基疆上运趸荧光煞爨传递(fluorescenceresonanceener- gYtransfer，FRET)技术，加入荧光标记探针，巧妙地把核酸 扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧 光售号来授溪PCR产狻，实瑷了对模叛透爨臻稳定量，戎隽 临床快速诊断的重要方法。目前临床上最常使用的检测试 剂盒基本上以IS6110作为靶序列的荧光定量梭测试剂盒。 除了七述壹接捡溅扩增产耪驻终，还有pe辩现lSA，金标洼 等延伸技术检测绪核杆菌。 2 PCR+RFLP用午细菌分型和流行病学调查 基予基嚣缰中IS6110撬入痔歹蚝的数藤程位置豹慧勇霹 以区分不弱豹萤撩，并且已被谎明有较高豹分辨率稻较好的 重复性。因此IS6110一RFLP分型技术被用作结核分枝杆菌 基因溅分型的金橼准。限制性片段长度多态性(IS6110- RFLP)分辑是近◆余年来分予流行病学孛斑弱最广豹MTB 基因分型方法。IS6110在大多数MTB菌株中有0—25个 拷贝。为了在不同国家的实骏室之间比较分离株，研究国际 闼疾瘸祷攘，1992年裁订了IS6110-RFLP戆嚣嚣拣壤搡俸 方案“∞。1996华攀传友n郎等在国内首次建立了结核杆菌 DNA指纹技术的方法学．他们根据不同来源的结核菌株染 色体DNA中序列IS6110位鬟和数量斡攀弱，以摄入痔残 IS6110为基础并选取其中一部分片段进行扩增，采潮增强 化学发光标记技术对插入序列IS6110中的PCR扩增产物 进行橼记，与结核麟染色体DN酶切、电泳朔转移后鲍产褥 进行杂交、检灞，然瑶缀据杂交磊魏DNA酶切蚕谱鄂DNA 指纹图谱的不同进行株水平的鉴定。从1iii可以分析不同地 理区域流行的结核分支杆菌的特点，了解菌种的进化，证实 霉疑瓣传接嚣节，滚踪撬橡闼瓣传搔，嚣分复发痰秘擎戆羚 源性稀感染。进行的质嫩控制等。慕于MTB插入序 列IS6110的限制性片段长度多态性(1S61102RFLP)分析 方法建立了一今罄际RFLP数撂疼o”，撵燹数多戆蘩探在 确定流行病学链系时较为为W靠，使得在不同国家。不弼地 区，甚至不同时间的研究结果舆有了可比性；同时结核瘸流 行病学的研究颁域逐步扩展。为研究晷家内、晷际间以至垒 球结梭瘸懿发生发浸提供了掰姥。由于祗拷多l菌株静条带 位置多态性较少，加之计算相似性时条带数少，区分力举够， IS6110一RFLP分析对流行病学调查并不充分，所以MTB分 褰撩会褰IS6110掺炙数在5令浚下蜀嚣耀勇羚煞基嚣努登 方法n”。另外IS6110—RFLP需要大量商质量的基因组 DNA(大约5～10pg)，需要几周时间培养结核杆菌，准备工 箨≤≥鬻繁璞，势萎IS6110戆鏊鞭分型方法戆复杂缝，获缮数 据所需的长期性和高额的费糟。使该方法搬流行病学暴发调 查中不方便使用；另一缺点是指纹结果是自然的条带。而非 数字续璐。因焉大毅数据库的建立纛实验蹙之阕结果的毙较 受到一定鹃限制“”。 *卫生部科学研究基盎～福建省m生教育联合攻关计戈哇项目。No． WKJ2005-2007 通讯髂毒：来玲，Email,zhlin962@pub6。色毒．cn 作者单位：福建医科太学基础免疫系及神经生物学研究中心，福州 350004 万方数据 2008，24(3) 中国人兽共患病学报 ChineseJournalofZoonoses 277 3 lS6110在缩核杆菌中的疑失 最然IS6110在结核杆黼的检测和流行病学调蠢方法得 到了广泛的应用，但是在应朋过程中也发现有一些菌株中少 或凳魏疆入穿罗lj。有些墓魏．尤其是委濒瑰莲滚每豹部分结 核分枝杆菌含有较少的is6110拷贝，甚纛不含is6110拷贝， 根据研究发现零拷贝的出现与老龄和豫裔有关。Das等n” 在零窜度熬捻套骞40弼莹撩豹IS6110弱灌仅有1个拷贝， 泰圜1997年检蠢为29％菌株禽1个捧爱，越南为20％菌株 含i个拷贝。裴秀英n”IS6110一RFLPDNA指纹分型的技术 方法鞠荧光标记探针杂交体系探讨了各她理区域IS6110指 纹稻谱懿特点，繁次在鋈内发凌了IS6110单拷爱鞍零拷煲 株，并首次在国内进行了较犬样本的分予流行病学溺查，建 立并分析了贫困山区的DNA指纹图谱。IS6110由予其拷 灵数较多、著置受结孩释蕊爱会嚣爱特穗。戆穗是捡溪结孩 杆菌的首选片断，但是有的黧株中缺乏此序歹硅，会造成假阴 性结果。 4 IS6{10秘其熊序列豹联会应用 为了IS6llO缺失造成的假阴性，一些学者设诗7在一 个PCR反应体系中。根据IS6110和和其他序列(如16Srna， MPB64，MTP40，DNAJ等)设计两对或者多对引物一起扩 增，这样产生不隧特异瞧轻嚣缄跨段，经凝胶毫泳鬣寨各特 异扩增片段，可以用于签定分枝杆菌至属种的水平。Thier- ry设计了扩增IS6110序列片段(325bp)及65kD蛋白瑟因片 段(383bp)莠对扩增产物遴褥分辑，取褥了较好豹络果。 SinghHBc黝等采用is6110稀mpb64分剐以及联合稔测结 核性淋巴结炎，问时做抗酸染色和普通培养作对照，结果看 教染色阳性率13．6％。培养阳性率28．4％。单独使用 is6110辩毪率6§。19％。擎狻使用mpb6莲粥往率48。2％，联 合使用阳性率77．8％，结果表明联合使用可以降低由于 IS6110无或者低拷贝引起的假阴性，并鼠可以提高检测的 蒋舅毪，降羝羧骥缝戆产生。嚣戴改遘鬓骞戆试裁盒势在必 行。以为临床提供更加全面、准确的诊断结果。 其它；在结核分枝杆菌旗因组中．部分插入序列表现为 基瓣惩擂入或者褒嚣编码送，鬻靠近tRNA基霆处，阻止基 因灭活。Sampson8”等研究谖实。在结核分枝释菌巾，60％ 的1S6110插入发生在编码聪域内。由于对基因的干扰而有 可能对菌株表型产生影响，IS6110可能具有驱动基因组进 纯戆能力，逶过磷究该于我税翻霉鹱会获攀争零乎揭汞络核分 技杆菌的进化，从而为结核杆菌的进化改变提供了非常有价 值的检测措施。 5蒺鏊 结核病已成为一个El益严重的公共卫生阕题。据 WHO估计，未来10年全球将有3000多万人死于结核病， 曩藏我国约有5．5亿人曾感染结核分枝姆菌(Mycobacteri- umtuberculosis，M．tb)。45I7i多久患游结核。其孛196万 多人具有传染性．每年死于此病者高达13万之多．蠢疑给结 核瘸实验诊断和分子流行病学研究提出了更高的要求。进 髫缨孩瘾懿诊酝纛滚爨瘸满豢露，滋较会毽豹秀式IS6110 ‘与16Srna。MPB64．MTP40。DNAJ等联含应用．深入研究结 核分枝杆菌基因检测和分型技术．以便及时采取措施控制结 孩癃疫情，以裳获褥更为瀵意的缝暴从薅更努鹩势入类 服务。 参考文献： C13DominiqueThierryA，etaLCharacterizationofaMycobacteri— umtuberculosisinsertionsequence，IS6110．anditsapplicationin diagnosisCJ)．JclinMicrobiol，1990，2812668—2673， C23张敦熔。瑗代结菝病学(M3。就黎t人民军医漱驻社，2000； 121—128． [3)WasiullaRaft．Rapiddiagnosisoftuberculousmeningitis：Atom— parativeevaluationofin—housePeRassaysinvolvingthreemyco- bacterial移NAsequences，lS6110，MPB-64and65kDaantigen [J)．JournaloftheNeurologicalSciences，2007，252{163—168． C43HanceAJ，GrandChampB，Lecy-frebauhV，eta1．Detectionand indentificationofmycobacteriabyamplificationofmycobacterial DNA[J]．MolMicrobiot，1989，31843—846． C53BalamuruganR．PCRamplificationoftheIS6110insertionele- mentofMycobacteriumtuberculosisinfecalsamplesfrompa， tientswithintestinaltuberculosis[J)。JC1inMicrobiol，2006 May；44(5)：1884-188。 (6)DaillouxM。LaurainC。Valueofnucleicacidamplificationmeth- odsAmplicor(Roche)andAmplifiedMTD(Gen-Probe)forthe rapiddiagnosisoftuberculosis[J)。AnnBiolCtinParis，1996，54； 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中国人兽共患病学报 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES 年，卷(期)： 2008，24(3) 引用次数： 0次 参考文献(19条) 1.Dominique Thierry A Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence,IS6110,and its application in diagnosis 1990 2.张敦熔 现代结核病学 2000 3.Wasiulla Rafi Rapid diagnosis of tuberculous meningitis:A comparative evaluation of in-house PCR assays involving three mycobacterial DNA sequences,IS6110,MPB-64 and 65 kDa antigen 2007 4.Hance AJ.Grand Champ B.Lecy-frebault V Detection and indentification of mycobacteria by amplification of mycobacterial DNA 1989 5.BalamuruganR PCR amplificationof the IS6110 insertion element of Mycobacterium tuberculosis in fecal samples from patients with intestinal tuberculosis 2006(5) 6.Dailloux M.Laurain C Value of nucleic acid amplification methods Amplicor (Roche) and Amplified MTD(Gen-Probe) for the rapid diagnosis of tuberculosis 1996 7.Gamboa F.Dominguez J.Padilla E Rapid diagnosis of ext rapulmonary tuberculosis by ligase chain reaction amplification 1998(5) 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