真菌分生孢子抑制定量聚合酶链反应分析

真菌分生孢子抑制定量聚合酶链反应 sdgsdgs成都分行东风浩荡合法规和法规和土 壤突然图腾 真菌分生孢子抑制定量聚合酶链反应分析 发布日期:2008年1月4日 来源:本刊杂志 编译:袭莎 James J. McDevitt ，Peter S. J. Lees1，William G. Merz，Kellogg J. Schwab1 摘要:定量聚合酶链反应(qPCR)环境样品分析受到在环境中抽样选中样本中存在的抑制剂的干扰。与室内空气取样相关的抑制剂效果受控测定和内部检测抑制质控的能力是通过过滤器收集空气样本进行的，然后通过过滤器强化绿色荧光蛋白质符号的烟曲霉分生孢子。微观分生孢子计数与qPCR结果相比较，与各级颗粒物质和有生存能力在空气中传播的微生物相关。我们的数据显示出PCR可被低至50lg的颗粒物质介质抑制，抑制剂的数量与微粒介子质量(r=0.75)及非丝状微生物的数量(r=0.73)具有必然联系。内部标准DNA的使用确认抑制剂的存在，并表示需要额外的处理样本或样本结论的限定。 关键词:空气真菌、烟曲霉、分生孢子、定量聚合酶链反应、颗粒物质、样本抑制 引言 与真菌接触的主要途径是通过吸入在空气中传播具有生存性和无生存性的真菌粒子。某些具有生存性的真菌粒子具有引起侵入性感染、引起过敏性疾病、引起毒性作用的能力，并产生挥发性有机化合物(Burge，Pierson，Groves，Strawn，Mishra 2000)。照射评估专业人员经常面临艰巨的任务，在环境样本中可迅速探测到的生物数量很少，例如真菌。评估在空气中传播的真菌很难，因为不具有公认的取样标准议定书或接触准则。从历史上看，空气样本直接通过收集孢子微观检测进行分析，或者更为常见的是在适合的生长环境中在适当的培养基上收集生长的具有生存性的孢子(Burge等 2000;Griffiths，DeCosemo 1994)。防止使用这些传统技术的主要局限性包括样本大小和时间限制，独立微生物的不准确表征，收集介体的 超载，过长的分析时间(McDevitt，Lees，Merz，Schwab 2005)。最近工业卫生从业者已开始评估克服传统分析方式局限性的分子检测方式的效用。尤其PCR已表现出极大的成功希望。在过去十年中，定量PCR(qPCR)已开始代替PCR。前者分子技术的主要优势在于其具有列举靶模板的功能，因而比简单的定性是/否结论可提供更多的信息。潜在致病真菌的定量测定中qPCR的功效，比如烟曲霉，已被证明并提出(Costa等2001;Haugland，Vesper，Wymer 1999;McDevitt，Lees，Merz，Schwab 2004，2005;Roe，Haugland，Vesper，Wymer 2001;Spiess等2003;Zhou，Whong，Ong，Chen 2000)。烟曲霉和其他真菌分生孢子DNA的qPCR分析是敏感的、具体的，超过许多数量级具有定量线性特性曲线(当这些数据由指数反应转化时)，在几个小时内能够提供结论(Costa等2001;Cruz-Perez，Buttner，Stetzenbach 2001;McDevitt等2004，2005)。作为qPCR分析一部分的TaqMan探针的使用促进PCR连续检测扩增曲线，通过测量信号产生，在聚合酶延伸期间荧光标记探针靶核酸序列被分成若干部分(Livak，Flood，Marmaro，Giusti，Deetz 1995)。荧光探针在探针的两端5’和3’包括独立的特定荧石和相应的荧石骤冷。通过Taq聚合酶探针的分裂从骤冷中释放荧石，以允许荧石可被探测器检测。PCR荧光信号的相对周期是由在基线以上的指定阈值(检测阈值)转化而来被称为阈值周期(Ct)。靶模板的最初数值越大，扩增周期所需的超出阈值越小。在Ct和最初靶模板数值log10之间存在线性(负斜率)关系。因此，低Ct与高原始复制数 Ct确定可与已知数量模板核酸确定值相关，高Ct数值与低原始复制数值相关。未知样本的 的Ct数值构建的标准曲线相关。 在环境样本分析中使用qPCR遇到的主要局限性为外因物质的存在，其被称为抑制物，在环境样本中经常可以发现。这些抑制剂干扰PCR扩增反应与Ct起始值，这些并没有在样本的真实靶值浓度中显示出来(McDevitt等2004;Wilson 1997)。由于核酸的PCR分析，抑制剂的问在很多研究领域已成公认的事实(Alvarez，Buttner，Stetzenbach 1995;Wilson 1997)。抑制剂可引起PCR反应全部或部分失败。当存在的核酸未被发现时，未被发现的完全抑制可能产生假阴性结果，由于PCR信号的减弱部分抑制可能引起核酸浓度的降低(例如Ct值的增加)。抑制剂可能有很多来源，以多种方式干扰PCR反应，复杂的相互作用使抑制的鉴定成为问题。样本的来源包含多种靶微生物，例如临床、食品或环境(空气、水、土壤等)来源，将极大的影响抑制的潜在性及存在的抑制剂类型。Wilson(1997)提供了样本基板和相关抑制剂的广泛列表。在诸如空气、土壤、水、污水和沉积物的环境基质中，腐殖质的痕量、重金属、细菌细胞中的要素、蛋白水解酶和高浓度非靶DNA都与PCR抑制剂相关(Alvarez等1994，1995;Keswani，Kashon，Chen 2005;Maher，Dillon，Vermund，Unnasch 2001;Roe 等2001;Wilson 1997)。 内部标准质控的增加，例如外生DNA或相关有机体，被用来检测和确认PCR抑制剂的存在 (Courtney，Smith，Henchal 1999;McDevitt等2004;Sachadyn，Kur 1998;Schwab，Neill，Le Guyader，Estes，Atmar 2001)。内部DNA质控标准的制定可将与靶DNA相似的类型进行扩增，并且在靶DNA和内部标准DNA之间允许离散变异，这是非常独特的。理想的内部标准与靶序列具有相同的长度和碱基对含量，然而具有一种特别的引物和/或探针序列(Courtney等1999;Sachadyn，Kur 1998)。通常，在靶DNA缺失时的预期Ct值下PCR质控DNA的检测显示出扩增条件是适合的，靶DNA并不存在。同样，内部标准样本中的预期Ct值的减少或变化与内部标准DNA质控样本中的预期Ct值的减少或变化相比较指出局部抑制存在，来自于靶DNA的信号可能减弱。 以前我们曾制定使烟曲霉分生孢子环境样本最优化的qPCR方式，其将以下组合在一起:独立试管样本的制备以减少样本损失，保持轻便，避免污染;热启动扩增以减少非特异性引物/探针退火，尿嘧啶-氮-糖基防止结转污染(McDevitt等2004)。使用这一方法，我们证明在PCR主要混合中内部标准质控DNA的外加，我们能够检测由在qPCR混合反应中的抑制剂引起的烟曲霉DNA扩增抑制的完全和局部样本。进一步研究评估:使用绿色荧光蛋白(GFP)表达烟曲霉分生孢子qPCR列举与直接荧光微观滤波器计数的包含分生孢子的绿色荧光蛋白相比较(McDevitt等2005)。我们发现qPCR分析方式与外用参考显微镜方式一致(在每个滤波器加载15-30000分生孢子的过滤器上qPCR和直接微观估计的比率为1:1)，被认为在过滤器收集烟曲霉分生孢子计数中的可靠方式。 上文所述的实验在实验室烟雾测试中高度受控的环境下进行，并没有反应出与真实环境样本相关的变量。现今研究的目标是在可控情况下延伸对真菌qPCR检测的评估，增添可在空气中传播的颗粒物质(PM)环境的真实性，通过将环境样本与在过滤器上收集的自然生成的颗粒物质结合的环境样本中可发现上述物质。随后我们将绿色荧光蛋白表述烟曲霉分手孢子加入到过滤器中，以便在以前描述的直接显微镜计数中使用qPCR分析。抑制程度通过内部标准DNA的使用，光学计数分生孢子数量qPCR的估计对比进行定量分析。为分析qPCR抑制的频率、程度和原因，我们分析收集的颗粒物质的特性，评估取样阶段环境中存在的生物浮质的浓度。 方式 取样计划 取样在2003年11月间马里兰州巴尔的摩三个地点以8小时为间隔(在上午7:30至下午6:30之间)单独进行:一间办公室，一间记载室内空气质量投诉的办公室，一个家庭。样本与分析计划的图式显示在图1中。该计划的目的为提供在每个取样地点不同取样时间的不同颗粒物质数量。 颗粒物质收集 在每个取样地点，空气通过两种盒子表面开放的地磁等年变线过滤器的3种装置使用3种高容积取样泵以大约101每分的流速(lpm)提取(直径:25mm;气孔大小:0.8lm;微孔过滤器，贝德福德，马萨诸塞州)。每个取样泵通过星形接法与两个过滤器连接(图2)。精密旋转流量计安放在每个星形臂状物上以控制和调整每个过滤器盒的流动。旋转流量计的校准(在取样状态中)对照Dry Cal DC-2流量定标器(生物国际性组织，巴特勒，纽约州)。所有的过滤器相互间距离一致(图2)。所有的高容积泵同时开启。泵1在120分钟后关闭，泵2在240分钟后关闭，泵3在运行480分钟后关闭。 重量分析 自从在过滤器上收集的颗粒物质的数量与样本抑制相关，过滤器在取样前后进行称重以确定在取样期间颗粒物质的数量，如上所述。在称重之前，有限的过滤器盒(无塞子)在干燥器上放置48小时。然后过滤器从盒子上移走，在控制室环境下连续两次称重(21?3?，相对湿度40?5%)，使用Mettler MT5微量天平(Mettler，托莱多，俄亥俄州)，过滤器的数量与质量记录下来。在取样后，每个过滤器干燥48小时，连续两次重新称重，再次记录过滤器的数量与质量。 生存性样本 一个N-6生存性影响因素独立阶段(Thermo电子，切斯威克，宾夕法尼亚州)在实地取样期间用来直接在繁殖盘上收集生存性生物浮质样本。重复抽样样本在任意100mm陪替式培养皿上收集(Fisher科技，Norcross，乔治亚州)包含39ml沙氏葡萄糖琼脂(Becton，Dickson and Company，斯帕克斯，马里兰州)。取样前防止交叉污染，N-6取样器用70%乙醇擦洗，然后将泵打开60秒使乙醇蒸发。生存性样本根据过滤器取样按照以下时间收集:0分钟， +120分钟，+240分钟，+480分钟。每个样本在流速为28.3lpm下以4分钟为节点收集。每个地点使用旋转流量计取样前后对流速进行核对，其校准对照Dry Cal DC-2流量定标器。托盘在每个取样间隔中在4?下储存。每天最后一个样本收集完毕后，托盘在25?下培养。托盘每24小时检查一次其生长，丝状与非丝状群落构成单位(CFU)记录下来。为辨认与真菌中烟曲霉类一致的总体形状任一群落，其转化为马铃薯葡萄糖琼脂平碟，以群落和微生形态特征为基础。 实时粒子浓度监测 在实地取样期间实时监控气溶胶浓度，使用MIE独立数据随机存取存储器模型数据处理速率-100AN(Thermo Andersen，士麦那，乔治亚州)。数据处理速率-100AN，其按被动取样器运行，为制定定标，在定标之前归零，设定60秒为记录间隔。在完整的8小时取样周期监控中进行使用数据处理速率-100AN。在取样完成后，使用MEI程序包将存储的数据下载到计算机中。 过滤器中GFP分生孢子的种植与分析 以下环境样本，包含烟曲霉分生孢子的GFP(Wasylnka，Moore 2002)，直径为2-3lm，在过滤器的子集上进行培养，被用来收集颗粒物质(在颗粒物质收集部分中描述)。使用Collison喷雾器使GFP烟曲霉悬浮呈烟雾状散开(BGI，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)，装备混合鼓风机将其引入聚碳酸酯盒，如上所述(McDevitt等2005)。简而言之，室内空气通过外部开放过滤器盒5分钟每分钟3.1提取。在烟雾盒中样本收集后，每个过滤器以对比方式减半。一半由qPCR分析(如上所述)，另一半使用在过滤器具有代表性区域的400×总动力荧光显微镜方式直接通过分生孢子计数列举，如上所述(McDevitt等2005)。qPCR分析包括将半数培养过滤器放入包含150μl溶细胞酶缓冲溶液(200U溶细胞酶，1.6mM Tris，0.03μM 乙二胺四乙酸，pH7.5)的1.5ml离心分离机试管中，在5000rpm下将试管在小型珠磨式组织研磨器(无珠子)上摇动30秒。在摇动后，过滤器在23000g转动干燥5分钟，将内部物质去除丢弃;分生孢子的浸渍在25?下培养60分钟，在小型珠磨式组织研磨器上以5000rpm搅动30秒，直到进行qPCR分析在4?下储存。 TaqMan qPCR使用正向引物(AF7)5’-GAA AGG TCA GGT GTT CGA GTC A-3’,反向引物(AF8)5’ -CAT CAT GAG TGG TCC GCT TTA C-3’和探针(AF9)5’-FAM-ATC CCT AAA CCC GCA ACC AAA GGC-BHQ-1-3’，所有这些都适用于9-10烟曲霉线粒体基因碎片的扩增(Costa等2001)。引物是购买于Invitrogen Custom Primers(弗雷德里克，马里兰州)，探针购买于Biosearch Technologies(诺瓦托，加利福尼亚州)。10μl分生孢子浸渍qPCR扩增在总容积为25μl的包括1.5U AmpliTaq金聚合酶的反应混合剂中进行(应用生物系统，福斯特城，加利福尼亚州)，1×基因Amp PCR缓冲器?(应用生物系统)，3.0μM MgCl2(应用生物系统)，0.5U Amperase尿嘧啶N-糖化基(UNG)(应用生物系统)，200μMdATP，dCTP，dGTP/400μMdUTP(Promega，麦迪逊，威斯康星州)，0.2μM AF7和AF8引物，0.2μM AF9探针。PCR扩增与定量分析在Smart Cycler(Cepheid，硅谷，加利福尼亚州)上进行，由初始UNG老化周期(50?，2分钟)、AmpliTaq金激活间隔(95?，10分钟)组成，随之是重复变性(95?，15秒)50周期和退火/扩展(65?，60秒)。阈值浓度(Ct)分析使用具有二次微商分析曲线的SMART CYCLER软件进行。 结论 在每个特定区域，每过8小时测试的颗粒物质平均空气浓度，使用MIE和重量分析方法进行的实时监控在图3中显示。以MIE检测为基础，8小时平均PM浓度在这3个地点基本相同。8小时平均最高在地点2测试中显示，最高峰收缩(数据未显示)在地点3中测试出来。然而，在过滤器上微粒样本8小时平均重量分析结论(图3)显示出平均室内空气微粒浓度在地点3显著较高。每个过滤器样本颗粒物质质量的重量分析在图4中显示。正如我们所期望的，质量的增长与取样时间有一定联系。在取样地点1与2装载的质量相似，同时在地点3相应样本的趋势显示出较高的质量负荷。 生存性丝状真菌的空气浓度在20-1240CFU/m3，就像每8小时间隔通过N-6取样器测试 4种样本一样，其它生存性微生物的空气浓度为,10-1060 CFU/m3。以在每个地点每8小时颗粒样本中收集到的四种生存性样本的平均值为基础，在地点1与3的丝状真菌浓度相似，比地点2的浓度高些，然而非丝状有机体的平均值在地点1与2相对较低，在地点3较高。每个过滤器上收集的丝状与非丝状有机体的总量在表1中显示。这些数值以通过过滤器提取的空气容积为基础，估计有机体的空气浓度(由使用平均生存性样本结论决定，这些结论符合每个时间间隔)。以群体形态、非丝状群体无法生成包含抗生素的媒介(数据未显示)为基础，我们假设这些群体为细菌。 在任何复制样本分析中qPCR均未发现烟曲霉，以在实地取样特定区域(数据未显示)评估前在内生烟曲霉(例如A过滤器为背景)的级别。这些样本的检测界限与定量界限都为每个过滤器15个分生孢子。当这些样本由qPCR分析时在地点2与3所有背景样本中(表1)使用内部标准检测qPCR抑制。内部标准DNA的检测在这些样本中完全被抑制(地点2-480分钟，地点3-240分钟，地点3-480分钟)，在3种样本中局部抑制(地点2-120分钟，地点2-240分钟，地点3-120分钟)。在抑制等级、颗粒物质质量(r=0.75)及非丝状有机体数量中存在正相关。颗粒物质的质量和非丝状有机体之间也存在正相关(r=0.94)。 表2显示出qPCR分析与直接显微镜计数结论的概要，就如在烟尘测试室中培养的GFP-烟曲霉实地样本重量分析结论。这些样本的检测界限与定量界限为每半个过滤器2个分生孢子。所有样本烟曲霉分生孢子的检测由qPCR进行，除地点3外(表2)。地点3所有样本完全抑制，一些地点2样本局部抑制，当地点1的任何样本由内部标准DNA qPCR分析时抑制未被发现。正如以前提出的，与无抑制的样本颗粒物质质量相比较，抑制与负载相对较高颗粒质量的过滤器相关(表1)。 实地样本培养的每半个过滤器的分生孢子数量的评估，以qPCR列举为基础的每半个过 滤器1898-3448个分生孢子，以直接显微镜计数的每半个过滤器分生孢子2142-4823个分生 孢子，并没有完全被抑制(表2)。这些估计的对比显示分生孢子计数中的qPCR估计比来 自于直接显微镜计数相对较低。 讨论 我们的数据显示出PCR可被质量低至于50μg的颗粒物质抑制，抑制总量与颗粒质量存在必然的关系。这个发现具有真正的暗示性，因为在环境空气取样期间遭遇到颗粒物质的质量量级并不罕见。当一方考虑巴尔的摩室内空气颗粒物质实体的平均浓度被报告为56.5μg/m3(Breysse等2005)，在10lmp流速收集的8小时样本在收集过程中可产生271μg颗粒物质。在我们的研究中这个颗粒物质的数量导致完全PCR抑制。很明显这可减少取样时间或流速以减少收集的颗粒物质数量;然而，由于在此种环境下收集分生孢子可能导致这种方式敏感度的降低。 如前所述，抑制的原因差别很大。同样的，在环境中颗粒物质的成分在很大程度上与浓度、粒子大小和成分相关。因此，确定抑制PCR反应的颗粒物质特殊成分需要依据颗粒物质质量、大小和化学成分的特性。由于颗粒物质的浓度与成分在时间与空间上存在很大差异，每个样本都要考虑这个特性。虽然这种方式是最佳的，但是其成本很高，已超过了研究的预算，此外将其作为常规分析的一部分并不现实。然而，我们能够根据生存性有机体在有限范 围之内表征收集的颗粒物质的特性。我们观察到根据内部标准DNA检测的PCR抑制与每个过滤器收集的生存性非丝状有机体(假定其为细菌)估计数值之间存在正相关。我们也发现非丝状有机体数量与质量之间高度相关。由于细菌的大小与质量较小，细菌占颗粒物质质量的大部分是不可能的。虽然在抑制样本中细菌的数量很重要，但是抑制样本、颗粒物质和/或非丝状有机体之间的关系并没有定论。其他研究者得出细菌细胞与PCR抑制相关(Alvarez等1994;Olive 1989)。与细菌相关的蛋白酶与核酸酶可能引起干扰扩增的生理化学或生化酶影响(Wilson 1997)。 实时监控在典型真实重量分析样本结论中并非必要的，在过滤器装载上并未提供可靠的评估。虽然颗粒物质8小时受力时间平均评估浓度与在地点1与2实地取样中MIE检测一致，在实地取样地点3过滤器上实际测量的颗粒物质真实数量比由MIE提供的实时检测预计的数值要高(表3)。这并不令人意外，因为在地点3(居民区)的条件与地点1与2(办公区)的条件不同。例如，在取样地点3有两只狗与一只猫，然而在地点1与2只有步行者。假设在这些方式中粒子大小导致显著不同是合理的。地点3样本的显微赋值显示出超出10μm的大量粒子，上部粒子大小的最大值由MIE得出(数据未显示)。因为质量大约为直径的立方函数，大于10μm的少量粒子占全部质量的大部分。因此，某些较大粒子被排斥在MIE测试之外，导致这种差别。在地点1与2的重量分析数据与MIE数据间的一致性指出少数大于10μm的粒子在这些特定区域都存在。地点3宠物的活动与每日专业清扫的缺乏造成较大直径粒子的悬浮，因此导致较高的重量分析结论。地点3的条件是地点3与地点1和2生存性样本结论之间显著不同的原因。由于这些较大细胞无法有效的穿越呼吸道，因此他们在很大程度上与肺部病理并不相关。结果，使用不包含大于10μm粒子的选择大小的取样器将会明显减少收集粒子的质量，可能减少抑制。 研究者已指出空气与灰尘表面样本抑制的存在，同时提供了关于此种抑制的本质与范围的最少信息。Roe等(2001)指出当黑色葡萄穗霉孢子在灰尘中培养几毫克，这些灰尘来自于表面，在加热、通风及空气调节(HVAC)系统中收集时比预计PCR低。Keswani等(2005)指出不同类型的抑制、灰尘数量、烟曲霉或黑色葡萄穗霉分生孢子的数量在表面烟尘和HVAC灰尘样本中培养。在这些实验中使用的大量烟尘可能发生冲突，例如室内和办公室中的室内环境空气样本的要求为相对干净。在卡氏肺囊虫的研究中，Maher等(2001)指出在收集室外空气样本中使用过滤器中的有效PCR抑制，在室内样本中的轻微抑制。Alvarez等(1995)指出伴随环境样本收集平均值为103-104CFU/m3，零度解冻细胞消散完全抑制，。然而，这些研究并没有量化抑制的数量，试图将抑制与来源相关联。 内部标准DNA有效应用检测出的分生孢子DNA扩增的物质被完全抑制(表2)。在这些样本中只有一种局部抑制。由内部标准DNA检测的抑制数量稍稍超过一个Ct单位变化的阈值，同时由qPCR检测分生孢子的数量在预期界限内。为显示潜在抑制剂的存在与作用，我们目的性的评估方式并没有包括DNA净化方式的使用以去除抑制剂。我们还观察到商务有效清扫工具的使用在清除由空气中颗粒物质引起的抑制是非常有效的，当在无抑制剂存在时纯净DNA的测试导致高于PCR信号的记录丢失(数据未显示)。 当过滤器中存在较高的颗粒物质，使用光学计数的验证并不是有效的工具。随着颗粒物质数量的增多观察的领域变得模糊，分生孢子的辨认变得困难。在每半个过滤器上装载微粒在100μg之上，精确计数是不可能的。在这些发现的基础上，当在每半个过滤器上颗粒物质的装载大大超过100μg，其他的确认方式也是必需的。 据我所知，在可控环境下qPCR分析中的空气抑制剂作用的检测，这是第一份报告。由于无法准确预计周围空气中烟曲霉等级，我们收集在过滤器上自然生成的颗粒物质，在过滤器中培养GFP-表达烟曲霉分生孢子促进qPCR分析的使用，伴随直接显微计数，在室内环境中吸入评估中的抑制角色评定的目的。我们指出在室内空气环境中发现适度的颗粒物质数量(?50μg)可引起PCR反应局部和/或完全抑制，在抑制发生的同时颗粒物质质量的增长与其有必然的联系。内部标准DNA的应用可确认抑制剂的存在，额外样本处理的需求或样本结论的限定。PCR是确定与量化环境中存在的与有机体相关的核酸很有用的工具;然而，研究者必须知道与控制PCR技术的局限性。 致谢 我们感谢约翰霍普金斯大学彭博公共健康学院Brian Schofield对显微镜方式的帮助。这 项研究部分由城市环境卫生试验项目(ES03818)约翰霍普金斯中心与约翰霍普金斯国立职 业安全与健康研究所教育与研究中心试验计划研究奖金支持(T42/CCT31049-09)。 参考文献: 1、Alvarez,A.J.,Buttner,M.P.,Toranzos,G.A.,Dvorsky,E.A., Toro, A., Heikes, T. 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