分子生物学实验:从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因_0
分子生物学实验
从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因
一、实验思路与
:
目的基因的获取是基因工程的重要步骤,也是研究基因的进化、功能等的必要手段。本实验设计从基因组DNA提取开始,通过DNA的提取及质量检测、常用生物信息库的查询、电子延伸、DNAstar软件的使用、PCR仪的编程与使用、载体构建、感受态细胞的制备、重组子的筛选和扩培、质粒的提取与检测等实验,使学生掌握基因克隆的基本思路和
。 谷胱甘肽硫转移酶(GSTs,EC 2.5.1.18)是分子量为25-29kD的同源或异源二聚体酶类。其作用是将将谷胱甘肽转移到各种有毒物质的亲电分子上去。GSTs在机体有毒化合物的代谢、保护细胞免受急性毒性化学物质攻击中起重要作用。此外,亲电子致癌物可被GSTs分解,所以
et al.,1997)。谷胱甘肽硫转移酶作GSTs有抑制细胞癌变的功能(Seidegard J,
为一种具有广谱抗氧化活性的物质已用于癌症等疾病的治疗。
编码GSTs的基因是一类古老而且广泛存在的基因家族。植物GSTs家族各成员之间的差异很大,它们只有一个长15个氨基酸的保守域(Marrs,1996)。Droog等人(1995)建议根据序列保守性,免疫交叉反应活性和基因内含子和外显子的结构将植物的GSTs分为三个亚类,I型GSTs有两个内含子,其翻译和转录受诸如脱水(Kiyosue et al.,1993),损伤(Kim et al.,1994),活性氧(Bartling et al.,1993),病原菌攻击或激素(生长素和乙烯)(Zhou and Goldsbrough,1993;Akahashi et al.,1995)的影响。II型GST的序列有9个内含子,此类型的GST序列只在
eyer et al.,1991;Itzhaki and Woodson,1993)。III型GSTs荷兰石竹中发现(M
只有一个内含子,其转录和翻译受各种植物激素(Takahashi et al.,1989,Droog et al.,1993)、病原菌侵袭(Taylor et al.,1990)及重金属(Czarnecka et al.,1988;Hagen et al.,1988,Marrs and Walbot,1997)的诱导。
研究植物GST最初目标在于确定不同作物对除草剂的抗性,但是对其在细胞正常代谢过程中所起的作用知道的较少(John and Kathryn,1998;Mars,1996)。对麦类作物GST的研究主要集中在其抗除草剂的作用上,由抗除草剂诱导的在小麦中
达得到的GST主要是I型的GST,它们只含有一个内含子并将其定位在小麦的第六部分同源群上(Riechers et al.,1994,1996 a,1996 b,1998)。
本实验采用同源序列克隆的方法从小麦基因组克隆小麦GST的基因组序列。
二、具体实验安排
实验一 小麦基因组DNA提取
小麦种子表面消毒后浸泡在蒸馏水中浸泡12小时,露白后转入培养皿中,室温条件下生长至两叶一心时采集叶片,立即用液氮处理后,置于-70?冰箱中保存备用。
总DNA采用Sharp等(1989)提出并经Devos等(1992)改进的酚—氯仿法提取。具体步骤如下:
1) 将适量新鲜叶片液氮低温下磨碎,取适量置于1.5ml离心管中,加beffer(100mM Tris.HCl pH8.0,100mM NaCl,50mM EDTA pH 8.0,2% SDS),65?水浴约1h。
2) 加入酚—氯仿(1?1),混匀后10000rpm离心10min;取上清液加入0.6 倍体积异丙醇,混匀并静置一会儿后,10000rpm离心10min,倒掉液相,
用乙醇将DNA洗1次,弃乙醇,将管倒置晾干。
3) 将DNA溶于(pH 7.0),加酶(10mg/ml),37?保温1h;加氯仿,轻轻混匀后10000rpm离心10min。
4) 取上清液加入2倍体积冷无水乙醇(或95%乙醇),轻轻混匀并静置一会儿后10000rpm离心,轻轻倒掉液相,待DNA干燥后溶于(pH 7.0)。
5) 用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
实验二 DNAstar
软件的使用方法及常用生物信息学网站
1) 序列编辑
如果需要进行引物设计的序列其文件保存类型为Word文档,则需要将该Word文档转换为.txt文件。然后点击DNAstar ? Editseq ? File ? Import ? 键入*.* ? 调出所有文件? 选取需要进行引物设计的序列文件 ? 将其另存为.seq文件类型,即可进行引物设计。
2) 引物设计
点击DNAstar ? Primer Select ? File ? Enter Sequence ? Open ? Add
? Done 。引物参数的选择按如下步骤进行:Conditions ? Primer Characterristics
? 选择Primer Length ? Primer Locations ? 选择Product Length ? Locate ?
PCR Primer Pairs 测序片段同源性比较。
点击DNAstar ? MegAlign ?File ? Enter Sequence ? Open ? Add
?Done ? Edit ? Select All ? Align ? 选择比较方法? View ? Align Report。
常用生物信息学网站
Genebank
基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧
实验三 从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因
根据GeneBank上公布的具有基因组序列的两个小麦GST序列GSTA1(X56012)和GSTA2(X56004)及其它小麦GST的mRNA的保守序列设计如下引物:
引物
名称
Gcds
Foward Gcds
Reverse 引物Gcds开始于起始密码子结束于终止密码子,其cDNA的扩增产物应该包含完整的开放阅读框。 30 5’TTAAAGCAAGGAATCCGGGCTCGCACGAGC3’ 碱基 长度 28 5’ATGTCTCCGGTGAAGGTGTTCGGGCAC3’ 碱基序列 产物长度 gDNA 1.1kb cDNA 900bp
基因组PCR反应体系
以基因组DNA进行基因组PCR。PCR反应总体积为2,反应液组成: 10×Buffer
MgCl2 (25 mmol/L)
dNTP (25 mmol/L)
Taq ()
Primer F()
Primer R()
模板(gDNA)
ddH2O
-
基因组PCR反应程序
扩增条件为95?5min,94?1min,65?1min,72?1min,30个循环,72?10min,然后4?保温。
扩增产物的检测
大于300bp的片段用1.2%的加EB的琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下检测。
实验四 PCR产物的纯化及连接
选用PCR凝胶回收纯化试剂盒进行,按照凝胶回收纯化试剂盒说明
进行。
1) 10.0ul的PCR产物在1.0%的琼脂糖胶上电泳,在紫外灯下用洁净消毒的刀片将目标片段挖出,放入1.5ml离心管中。
2) 向1.5ml离心管中加3倍体积的溶胶液,50C水浴10分钟,待凝胶完全溶解后,倒入回收离心柱中。
3) 向回收柱中加入700ul漂洗液,13000rpm离心1分钟。
4) 倒出离心管中漂洗液,再向回收柱中加入500ul漂洗液,13000rpm离心1分钟。hj
5) 将离心管中的漂洗液倒掉,13000rpm离心2.5分钟。
6) 将回收柱转移至一个新1.5ml离心管上,加入适量ddH2O,静置30分钟。 o7) 13000rpm离心1min,弃纯化柱,离心管
实验五 大肠杆菌感受态制备
[实验目的]通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备。
[实验原理]细菌处于易于吸收外源DNA的状态叫感受态。细菌处于0?的CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经42?段时间短时间热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。
[实验步骤]
1.挑取大肠杆菌单菌落接种于10 mL LB培养基中,37? 振荡培养过夜。
2.按1%接种量接种10 mL LB培养基中,37?快速振荡培养3 h。
3.取1ml培养物,冰浴30 min ,4? 4,000 r/min离心3 min,去上清。
4.加二分之一体积(500μl)的冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液,重新悬浮细菌沉淀,4? 4,000 r/min离心3 min,去上清。
5.加十分之一体积(50μl)的冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液,重新悬浮细菌沉淀,4? 4,000 r/min离心3 min,去上清。
6.加二分之一体积(25μl)的冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液,重新悬浮细菌沉淀,冰浴3 h-24 h,即为大肠杆菌感受态细胞。
7.将上步两管感受态并作一管,即50μl每管,留作下步转化用。
实验六 PCR连接产物的转化
[基本原理]
将质粒DNA导入细菌的过程称为转化(Transformation)。此感受态细菌细胞在CaCl2低渗溶液中膨胀为球状(感受态细菌的制备,见前)。质粒DNA与CaCl2 形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物黏附于细菌表面,经42?短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中,外源基因得到表达。在选择性培养平板上,可选出所需的转化子(即含有质粒DNA的细菌)。钙处理的感受态细胞,一般每微克DNA能获得10,10个转化子。除化学方法转化细菌外,还有电穿孔法(Electroporation),其转化率可高达10,10个转化子/μg质粒DNA。 91056
[实验步骤]
1)LB固体选择培养基的配制
trytone 1g
yeast extract
NaCl
H2O
IPTG (50mg/ml)
X-gal (20mg/ml)
Ampicillin (100mg/ml)
2)转化连接液的配制
E. coli TOP10
PCR连接液
3)应用热激法进行转化
冰浴30 min后,42?热激90 s,马上放回冰上,冰浴2 min;加400 µL LB培养基(37?预热),37?水浴静置15 min;再于37?摇床慢摇振荡培养45-60 min;取50-100 µL涂在含有氨苄青霉素(100 µg/mL)的LB固体培养基上,37?倒置培养过夜。白色菌落即重组质粒。
实验七 重组质粒的提取与检测
质粒提取
1挑取单菌落接种于2 mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中培养,37?培养过夜。.
2.取1.5 mL细菌培养物,加入1.5ml离心管中,8,000 r/min离心1 min。
3.除净上清,加100μL溶液I,剧烈振荡混匀。
4.加200 µL溶液II(现用现配),盖紧管盖,迅速颠倒混匀。
5.加150 µL冰冷的溶液III(冰上预冷),盖紧管盖,颠倒混匀,冰浴10 min。
6.12000 r/min离心10 min,将上清转移到一个新1.5ml离心管中。
7.向上清中加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温作用15 min ,12000 r/min离心10 min 。
8.弃上清,加入200µL 70 %乙醇洗沉淀一次,弃乙醇,将管倒扣在纸巾上凉干。
9.用500µL含100 µg/ml RNA酶的TE溶解沉淀,65?作用30 min。
10.加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1),反复颠倒混合, 12000 r/min离心10 min 进行抽提。
11.反复抽提至两相界面无蛋白出现,再用等体积氯仿-异戊醇(24:1)12000
r/min
离心10 min,抽提一次。
12.取上清,加入2倍体积无水乙醇及1/10倍体积的3 mol/L NaAc(pH5.2),混
匀,-20?放置30min以上,12000 r/min离心10 min;弃上清,用200µL预冷的
70 %乙醇洗沉淀一次,倒扣在纸巾上凉干,用30µL TE溶解沉淀,-20?存放备
用。
质粒检测
1)PCR检测
10×Buffer
MgCl2 (25 mmol/L)
dNTP (25 mmol/L)
Taq ()
Primer F()
Primer R()
质粒DNA
ddH2O
Total
2)酶切检测
反应体系:
NotI(10U/μl)
10×Buffer
质粒DNA
Total
37?恒温过夜,1%琼脂糖凝胶检测。
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