第三章 基因工程制药

null第三章 基因工程制药第三章 基因工程制药null*Why biotechnology?Dolly the sheepnull 1997年英国科学家把白脸母绵羊的乳腺上皮细胞进行特殊的培养，再将其细胞核吸出移到黑脸绵羊去核的卵细胞中，在试管中培养成小胚胎，然后植入到另一黑脸母绵羊的子宫中，结果这头黑脸代理母亲生出了白脸绵羊“多利” null*Plants as Pharmaceutical factoriesWhy biotechnology?nullGenetic engineering (遗传工程、基因工程)--the technique of removing, modifying, or adding genes to a DNA molecule in order to change the information it contains. By changing this information, genetic engineering changes the type or amount of proteins an organism is capable of producing, thus enabling it to make new substances or perform new functions.基因工程null基因工程是在分子水平上对基因进行操作的技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使之在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作。 它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质(DNA)提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的 DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中进行正常的复制和表达。 它是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。基因工程null为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。 基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。基因工程技术的应用特点null传统制药存在的问： 因材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； 从动物脏器中提取，造价太高，或因来源困难而供不应求； 由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的主要特点： 能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质； 甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。基因工程与制药null可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障； 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 基因工程技术生产药品的优势For fun? For real?For fun? For real?null目前已经研制成功约200多种基因工程药物和疫苗，其中销售额最大的是红细胞生成素（EPO）、人胰岛素、人生长激素、干扰素（IFN）、粒细胞集落刺激因子等，每种药品的年销售额高达数百亿美元。第一节 基因工程制药基本环节第一节 基因工程制药基本环节基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞) 目的基因的获得和表达 基因表达系统的选择：主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易 此阶段的工作主要在实验室内完成 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制 工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术 生物传感器等一系列仪器仪表的和制造、电子计算机的优化控制等 此阶段主要将实验室的成果产业化、商品化 制备基因工程药物的一般程序制备基因工程药物的一般程序基因工程药物的上游技术基因工程药物的上游技术基因克隆载体 质粒载体 重组DNA技术的有关工具酶及其应用 核酸制备技术 制备纯净、高质量的 载体DNA和待克隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作基因工程药物的上游技术基因工程药物的上游技术1.用碱抽提法分离质粒DNA 原理：细胞pH12.0-12.6线状DNA变性，cDNA不变性，加酸恢复pH到中性，变性的染色体DNA交织成网而沉淀，上清用酚处理使蛋白变性，用醇沉淀质粒DNA。 A.质粒DNA的小量制备 B.质粒DNA的大量制备 null基因操作的工具基因操作的工具基因工程的核心是DNA重组技术，即在体外通过对DNA分子进行人工操作（包括剪切和拼接）从而对基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。 基因操作的工具 基因的剪刀——限制性内切酶 基因的针线——DNA连接酶 基因的运输工具——（运）载体 基因操作中常用的工具酶基因操作中常用的工具酶null限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶（ Restriction enzyme ）：一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶。限制性内切酶：类型限制性内切酶：类型I型 能够切开DNA的两条链，但是它切割距离认知位达数千个碱基序列之远，切割产物无特异性。 II型 能识别双链DNA分钟中4~8 bp组成的特定序列并进行切割，切割产物是特异性的。 在基因工程中的使用最广泛。 III型 可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距25-27 bp。限制性内切酶：命名限制性内切酶：命名限制性内切酶与1980年Robers进行系统划分归类，属名和种名相结合进行命名: EcoRI:限制性内切酶如何工作限制性内切酶如何工作红线说明了从哪里限制性内切酶从哪里开始切割DNA. 所有的识别位点都是对称的：单条核酸序列内以对称点为中心，两侧碱基互补的核心序列区域，在该DNA区域内，从不同方向阅读不同单链时其序列一致。（即回文序列）限制性内切酶如何工作？限制性内切酶如何工作？识别序列DNA 序列粘性末端限制性内切酶 EcoRI 切DNA成片段限制性内切酶：末端类型限制性内切酶：末端类型5' overhangsBlunts3' overhangs限制性内切酶：举例限制性内切酶：举例已经有超过200种酶被发现了，许多已经用于商业用途。用限制性内切酶切断DNA用限制性内切酶切断DNA将DNA和限制性内切酶在小型的EP管中混合在一起，然后放入37℃孵育。 在孵育以后可以用来分析DNA或者进行其他的反应，比如细菌的转化。总体积约为20 μl。大多数的限制性内切酶（不是所有的）反应都是在37℃下孵育1小时。 DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是指能将双链断裂的DNA连接在一起的酶。 催化两条分别具有5’-磷酰基末端与3’-羟基末端的DNA单链连接形成磷酸二酯键的酶。 T4 DNA连接酶是经常用来连接拥有粘性末端DNA片段的DNA连接酶。 T4 DNA连接酶以ATP为能源，它也可以连接平头末端，不过要求更高的浓度。 聚合酶聚合酶聚合酶（polymerase）:酶催化反应中以DNA或RNA为模板，将核苷酸连续加至3’-OH引物末端，合成方向为5’→3’。可分为DNA聚合酶和RNA聚合酶。 大肠杆菌DNA聚合酶I： 5’→3’DNA聚合酶活性， 5’→3’外切酶活性， 3’→5’外切酶活性，及RNA H酶活性 Klenow酶： 5’→3’DNA聚合酶活性， 3’→5’外切酶活性 T4噬菌体DNA聚合酶： 5’→3’DNA聚合酶活性， 3’→5’外切酶活性 聚合酶聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶： 5’→3’DNA聚合酶活性， 3’→5’外切酶活性 Taq DNA 聚合酶：是从耐热菌T. aquaticus中分离得到。 5’→3’DNA聚合酶活性， 3’→5’外切酶活性；最适宜反应温度为75~80 ℃，主要用于PCR反应扩增DNA。 反转录酶：在反转录病毒中分离得到，催化以RNA作为模板的DNA合成反应。 5’→3’DNA聚合酶活性 其他工具酶：末端脱氧核苷酸转移酶（TDT），RNA酶等载 体载 体载体载体载体是指凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因DNA并具有运载外源DNA导入宿主细胞能力的片段。 载体来源包括质粒，病毒等 克隆载体：只能够进行转录，但不能翻译：他们可以在靶细胞中复制，但不表达。克隆载体只用来扩增目的基因。 表达载体：只含有强启动子，外源基因在启动子控制下转录，并表达外源蛋白。 突变载体 报告载体 噬菌体载体载体的关键要素载体的关键要素复制子：又称为复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素。分为 松弛型复制子：复制与宿主蛋白质合成功能无关，宿主染色体DNA复制受阻时，质粒任可复制，拷贝数很多。 严紧型复制子：复制与宿主蛋白合成有关，低拷贝。主要用于克隆多拷贝质粒大量表达目的蛋白质导致宿主死亡的目的基因。 选择标记：由质粒编码的选择标记赋予宿主细胞新的表型，用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞。常见的是抗性选择标记。 氨苄西林（amp），四环素（tet），氯霉素（cm），卡那霉素（kan），新霉素（neo）载体的关键要素载体的关键要素可诱导启动子：短的DNA序列，能够增强临近基因的表达。 多克隆位点（MCS）：短的DNA序列，包含多个限制性酶切位点。载体载体克隆载体克隆载体克隆载体：将外源基因引入宿主细胞，并使其大量扩增 质粒（Plasmids）：插入大小0.01-10 kb 噬菌体（ Bacteriophages）：插入大小10-20 kb 柯斯质粒（Cosmids）：插入大小20-50 kb（柯斯质粒是人工构建的，包含λ 噬菌体的cos基因的克隆载体） 酵母人工染色体（YACs）：插入大小500 kb克隆载体克隆载体质粒载体质粒载体质粒：是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子。 有的质粒可以整合到宿主基因组中 很多人工构建的质粒被用来作为克隆载体 大小：5,000-400,000 bp pBR322: 早期代表性载体，能在E. coil中复制 pBR322: 早期代表性载体，能在E. coil中复制 复制起点能允许独立的复制 用于多种限制性内切酶的单酶切位点 (例如BamH I等) 四环素抗性基因 氨苄抗性基因表达载体表达载体必须与宿主细胞相兼容（比如原核细胞使用原核载体，真核细胞使用真核载体） 需要一个好的复合体： 强启动子 启动子是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列，其功能是转录出目标基因的mRNA，是决定外源基因在原核生物中表达效率的关键因素。 核糖体结合位点 既SD序列，由Shine和Dalgarno发现，是mRNA上的核糖体结合位点，位于mRNA起始密码子AUG上游3~10bp处3~11bp长度的序列表达载体表达载体终止子 终止子序列是基因3’ 末端能被RNA聚合酶识别并停止转录功能的特定DNA序列。终止子序列由富含A/T的序列和富含G/C的序列组成，富含G/C区域具有回文对称结构，转录后形成的mRNA具有茎环的二级结构，与RNA聚合酶作用使之构象变化，终止RNA的合成。 亲和标签或增溶序列 多酶切位点表达载体表达载体启动子 阿拉伯糖启动子（pBAD），T7噬菌体启动子（pET），Tac/Trc启动子，λ噬菌体PL或PR启动子，lac 标签 6个His标签用于亲和层析（Ni） FLAG标签 DYKDDDDK 钙调蛋白结合肽（CBP）-26个氨基酸残基 谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签 纤维素结合区域（CBD）标签 凝胶电泳凝胶电泳经常跑向红色电极方向凝胶电泳凝胶电泳nullnull电泳电泳凝胶成像系统凝胶成像系统null目的基因的常用制备方法目的基因的常用制备方法目的基因的常用制备方法目的基因的常用制备方法常用的方法主要包括 化学合成法 PCR法 基因文库法 鸟枪法 cDNA法化学合成法化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 化学合成法化学合成法人工化学合成基因的限制： 不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆小分子肽的基因。 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。 费用太高。 PCR 法PCR 法PCR是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性地扩增DNA。 变性—退火—延伸，（循环） PCR可以在体外特异性地扩增目的基因片段，并可以在设计引物时引入合适的酶切位点和标签结构等。 凡经过PCR扩增制备的目的基因片段，在克隆后必须进行测序分析。基因文库法—鸟枪法基因文库法—鸟枪法基因文库（gene library）：是指某一特定生物体全部基因组的克隆集合，包括所有外显子和内含子序列。 鸟枪法（shotgun）:就是将生物体全部基因组通过酶切分成不同的DNA片段，与载体连接构建重组子，转化宿主细胞，从而形成生物体全部基因组DNA片段的克隆。cDNA 文库法—逆转录法cDNA 文库法—逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 1、mRNA purification a.细胞内RNA的组成和含量: DNA:95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5% b.真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。 3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)null纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图cDNA 文库法 —— 逆转录法2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使 oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。 3、cDNA第二链的合成： 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）cDNA 文库法 —— 逆转录法载体DNA与目的基因的连接载体DNA与目的基因的连接载体DNA与目的基因的连接载体DNA与目的基因的连接两个DNA片段的5’-磷酸基团和3’-羟基在连接酶催化下形成磷酸二酯键。 载体DNA与目的基因的连接可以分为以下几种： 粘性末端DNA片段与载体DNA的连接 平头末端DNA片段与载体DNA的连接 影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素 粘性末端的连接效率高于平头末端 目的基因与载体的浓度和比例 连接温度，时间，酶的活性 提高重组效率 重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞将重组DNA导入宿主细胞，使重组DNA分子进行扩增和目的基因的表达。 宿主细胞分为 原核细胞 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链球菌等 真核细胞 酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞 导入方法包括 转化、转染、显微注射、电穿孔（电转）重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞转化（Transformation）：外源DNA被改造的细胞或细菌摄入和合并。 转导（Transduction）：使用病毒载体对细胞遗传物质进行转移。 接合（Conjugation）：直接将DNA从一个细胞转移到另一个细胞，通常由质粒介导。接合?接合F’ transfer Plasmid transfer (F plasmid)Hfr transfer Chromosome transfer (Hfr strain) (High frequency of recombination)Plasmid-containing donorDonor with integrated plasmid转导?转导Chromosomal segments Plasmids转化Naturally competent: Neisseria, Haemophilus?转化重组DNA导入宿主细胞氯化钙转化法： 对数生长期的大肠杆菌经冰浴的CaCl2低渗溶液处理，其细胞通透性增加，成为感受态细胞， 加入重组质粒，重组质粒与Ca2+形成复合物并黏附于细菌细胞膜表面， 经42℃热休克处理，细胞膜通透性增加，重组质粒DNA进入感受态细胞。 转染法： 以λDNA或粘尾质粒作为载体构建的重组DNA经外壳的包装成为具有感染能力的λ噬菌体颗粒，能将重组DNA注入大肠杆菌内进行扩增。重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞电穿孔转化法：感受态细胞在高压电脉冲作用下，产生瞬时可逆性穿孔和吞噬作用摄取目的基因DNA。细胞膜在电压冲击下破裂 细胞膜的重组产生大的空隙，可以使DNA分子进入 一般在细菌、酵母和动物细胞转化时使用重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞 电转仪重组DNA导入宿主细胞重组DNA导入宿主细胞显微注射法 DNA-磷酸钙转染法 DEAE葡聚糖转染法 阳性脂质体介导的基因转染 细胞融合法DNA重组: 简介DNA重组: 简介用限制性内切酶切开质粒。在供体细胞中用相同的限制性内切酶切断基因。DNA重组: 简介DNA重组: 简介将基因插入到质粒中。 将两者连接起来。将质粒插入到接受细胞中。 现在细胞有了重组DNA。null重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定1. 载体遗传标记法 抗生素抗性筛选法：抗生素抗性基因是最常见的筛选标记，包括Amp, Tet, Cm, Kan, Neo。含有转化子被赋予拮抗抗生素的表型的重组子能在含有康生物的环境中生长，从而达到被鉴定筛选的目的。 互补筛选法：重组子转化宿主细胞，载体的表达产物与宿主细胞中营养缺陷型突变发生互补作用，从而实现重组子的筛选。最常见的为蓝白斑筛选。 pUC载体含有lacZα 基因，该基因编码E. coil β-半乳糖苷α氨基端的α互补肽段，与宿主细胞编码的缺陷型β-半乳糖苷酶α实现互补 ，也叫α互补。互补筛选法互补筛选法在IPTG的诱导下，含有该类载体的宿主细胞可以分解培养基上的 X-gal，形成蓝色菌落。 当外源基因插入lacZα基因内部的多克隆位点，X-gal的培养基的重组子由于lacZα基因的插入而失活菌落呈白色。 一般配合抗性筛选使用。载体遗传标记法载体遗传标记法营养缺陷性筛选法：载体携带某些营养成分的编码基因，而宿主细胞因该基因突变而不能合成该生长所必需的营养物质。因此只有含转化子的菌落才能够在缺少该营养物质的培养板上生长从而实现筛选。 噬菌斑筛选法：经噬菌体载体包装的外源重组DNA转染宿主细胞，转化子在固体培养板上出现清晰的噬菌斑，不含外源DNA的空载体不能装配成噬菌体颗粒形成噬菌斑，从而实现筛选的目的。核酸分子杂交法核酸分子杂交法菌落原位杂交：又称为探针原位杂交法，制备与目的基因某一区域同源的探针序列，根据核酸杂交原理，探针序列特异性地杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光集团进行定位检测。 DNA印迹分析：也叫Southern杂交。将待检测DNA混合物进行凝胶电泳分离，分离后的DNA片段转移至硝酸纤维素膜，与放射性核素标记的DNA探针进行杂交，以检测目的DNA片段。 RNA印迹分析：用DNA探针检测特定序列的RNA，分析该基因表达及mRNA的分子量大小。重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定限制性内切酶图谱法：从初步筛选的转化子中提取重组DNA，选择合适的限制性内切酶进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定分子量大小，含有目的基因DNA片段酶切产物的为阳性克隆。 DNA序列测定法：很多生物技术公司利用大型全自动的测序仪器提供商业化的测序服务。 方法：双脱氧终止法。 目的基因表达产物测定法：通过检测蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定重组子限制性内切酶图谱法限制性内切酶图谱法原核细胞及真核细胞表达特点及选择原核细胞及真核细胞表达特点及选择基因表达基因表达克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。 宿主细胞的选择宿主细胞的选择宿主细胞的基本要求： 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA技术操作； 产物的产量、产率高，且易提取纯化。 宿主细胞的分类宿主细胞的分类原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等； 真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。 原核细胞表达的特点及选择原核细胞表达的特点及选择1、大肠杆菌： 表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。 特点： A、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内 产物，提 取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难。 B、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体(inclusion body)，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复姓处理才能恢复其生物活性。原核细胞表达的特点及选择原核细胞表达的特点及选择C、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。 由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。 原核细胞表达的特点及选择原核细胞表达的特点及选择2、枯草芽孢杆菌： 分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。 3、链霉菌： 重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。 外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式胞内表达两种方式： 非融合蛋白的胞内表达：非融合蛋白是指表达的外源蛋白的N端不含任何大肠杆菌的多肽序列，将外源基因5’端直接位于翻译起始位点ATG之后。构建模式为原核启动子→SD序列→起始密码子ATG→外源基因→终止密码子。但是易产生包涵体。 融合蛋白的胞内表达：所谓融合蛋白是指将外源基因融合至某种特定原核结构基因下游，表达的外源蛋白N端含原核多肽。构建模式为原核启动子→SD序列→起始密码子ATG→原核结构基因→外源基因→终止密码子。融合蛋白可以通过化学方法或蛋白酶法切除融合蛋白中原核多肽形成具有天然生物活性的外源蛋白。外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式分泌表达： 分泌性表达通过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽序列的下游实验。信号肽和外源蛋白的融合蛋白在跨过内膜或外膜后，信号肽酶切去信号肽，外源蛋白被分泌到细胞周质空间或胞外。因此可直接从培养液中分离得到外源蛋白。 大肠杆菌中的基因表达大肠杆菌中的基因表达载体：表达载体必须具备的条件 载体能够独立的复制； 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后， 以使克隆的外源基因得以表达； 具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别； 具有Repressor，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录； 具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因， 而不转录无关的基因。 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列， 以便转录后能顺利翻译。大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素外源基因的表达产量----单位体积产量------细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相关。细胞浓度与生长速率、外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动态平衡，只有保持最佳的动态平衡才能获得最高产量；单个细胞的产量又与外源基因的拷贝数、基因表达效率、表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。因此必须从以下因素入手，寻找提高外源基因表达效率的有效途径：大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素外源基因密码子的使用： 密码子分为偏好密码子和稀有密码子 外源基因中使用大肠杆菌的偏好密码子，蛋白质合成迅速，错配率较低；如果外源基因中使用较多大肠杆菌的稀有密码子，蛋白质合成就会受到抑制，发生密码子错配。 解决方法：多核苷酸定点突变对稀有密码子进行同义突变。 mRNA结构： mRNA一级结构影响外源蛋白翻译效率； 翻译起始区的二级结构也影响外源蛋白的表达效率； 大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素表达载体的构建： 大肠杆菌表达载体一般需满足一下条件，高拷贝数，适用范围广，稳定性高，表达产物易纯化 外源蛋白稳定性：大肠杆菌表达的外源蛋白易被蛋白水解酶降解。 采用融合蛋白表达载体； 利用信号肽； 特异性突变； 位点特异突变，改变二硫键位置； 宿主蛋白酶缺陷 真核细胞表达的特点及选择真核细胞表达的特点及选择酵母 繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。 丝状真菌 很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺。真核细胞表达的特点及选择真核细胞表达的特点及选择昆虫细胞表达系统 利用昆虫细胞和杆状病毒载体表达外源蛋白。 哺乳动物细胞 由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或 类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。真核细胞表达的特点及选择真核细胞表达的特点及选择虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系统。 甲醇酵母基因表达系统是目前应用最为广泛的酵母表达系统。 巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）是基因工程中应用最为广泛的酵母表达系统。 酵母表达系统酵母表达系统巴斯德毕赤酵母优点： 高表达量：外源蛋白在毕赤酵母中可获得g/L表达量水平以上 高稳定性：外源基因被整合至毕赤酵母染色体上避免丢失现象 翻译后修饰功能：包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成和O-及N-糖基化、脂类添加等 分泌表达：培养基中含有毕赤酵母自身蛋白较少，主要为分泌表达的外源蛋白 影响酵母表达系统中表达的因素影响酵母表达系统中表达的因素包括外源基因结构，表达形式及信号肽的选择，启动子的选择，转化子的拷贝数，甲醇诱导浓度、时间、温度、外源蛋白的降解等。 外源基因结构： 外源基因mRNA5’端非翻译区（5’UTR）的核苷酸序列和长度影响mRNA的翻译水平。使用酵母偏爱密码子有利于提高外源蛋白表达量。 表达形式及信号肽的选择： 外源蛋白表达形式包括胞内表达和分泌表达。分泌表达型酵母可利用自身信号肽和酵母信号肽获得较好的表达效果。信号肽包括：α因子信号肽，酸性磷酸酶信号肽等。影响酵母表达系统中表达的因素影响酵母表达系统中表达的因素启动子 启动子有乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子、PGAP（三磷酸甘油醛脱氢酶启动子）、PFLD1（依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶启动子）等。多数毕赤酵母选择AOX1，AOX2启动子。 转化子的拷贝数 诱导条件 甲醇诱导浓度、时间、温度的选择影响外源蛋白的表达效率 外源蛋白的降解 通过选择蛋白水解酶缺失的宿主菌进行表达、或添加蛋白胨，调节pH值抑制蛋白水解酶活性毕赤酵母表达载体毕赤酵母表达载体毕赤酵母表达载体毕赤酵母表达载体pPIC9K: 9276 nucleotides 5' AOX1 promoter fragment: bases 1-948 5' AOX1 primer site: bases 855-875 a-Factor secretion signal(s): bases 949-1218 a-Factor primer site: bases 1152-1172 Multiple cloning site: bases 1192-1241 3' AOX1 primer site: bases 1327-1347 3' AOX1 transcription termination (TT): bases 1253-1586 HIS4 ORF: bases 4514-1980 Kanamycin resistance gene: bases 5743-4928 3' AOX1 fragment: bases 6122-6879 pBR322 origin: bases 7961-7288 Ampicillin resistance gene: bases 8966-8106毕赤酵母表达的蛋白糖基化毕赤酵母表达的蛋白糖基化昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是利用昆虫的细胞和杆状病毒载体表达外源蛋白。有以下优点： 可以表达较大的外源基因 可以实现不同生物来源的外源基因的表达 蛋白质翻译后加工功能与高等生物类似 杆状病毒具有宿主专一性，对植物和脊椎动物无致病性 外源基因与昆虫表达载体连接构建成重组的昆虫表达载体，重组载体不能直接感染昆虫细胞，必须通过共转染的方式，在昆虫细胞内发生同源重组，将外源基因的表达单元整合到杆状病毒基因组中，成为重组病毒，感染细胞进行复制。 两种形式的昆虫杆状病毒两种形式的昆虫杆状病毒哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物表达系统中表达外源蛋白，蛋白质正确折叠，实现精确的N型和O型糖基化等多种蛋白质翻译后的加工功能，因此外源蛋白在结构、理化性质及生物功能最为接近天然的高等生物蛋白质。 表达载体可以分为病毒载体和质粒载体。 病毒载体通过病毒颗粒的外壳蛋白与宿主细胞膜相互作用介导外源基因进入细胞内。 质粒载体根据物理或化学的方法将外源基因导入细胞，质粒载体还可以分为整合型和附加型载体。蛋白表达系统蛋白表达系统哺乳动物表达系统昆虫细胞表达系统大肠杆菌表达系统处理以及成本蛋白质的质量表达过程的速度约有60-70% 的重组蛋白药品是在哺乳动物细胞内表达的基因重组蛋白的分离纯化和分析鉴定基因重组蛋白的分离纯化和分析鉴定基因工程药物或生物技术产品特点基因工程药物或生物技术产品特点目的产物在初始原料中的含量较低; 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大； 目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性； 种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质； 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。基因重组蛋白的分离纯化基因重组蛋白的分离纯化目标产物的分离纯化 目标产物的初级分离，主要是在发酵后将目的产物从培养液中分离出来 目标产物的纯化，是在分离的基础上运用各种具有高选择性的纯化手段，是产物按要求进行纯化。 分离纯化技术应满足的条件： 技术条件要温和 选择性好 回收率高 分离和纯化之间衔接 过程要快基因重组蛋白的主要分离技术基因重组蛋白的主要分离技术离心：在转子高速转动所产生的离心力的驱动下，利用固体和液体间的密度差来进行分离。 优点：速度快，分离效率高 缺点：设备投资大，能耗大 沉淀：利用蛋白质在不同条件下的溶解度不同，通过某些方法降低某一蛋白的溶解度，使它们在短时间内形成蛋白聚集体，再用离心方法将其与溶液中其他蛋白质分离开来。 等电点沉淀法：当溶液的pH为某一值的时候，在等电点pI时，蛋白质所带净电荷正好为零，等电点附近的蛋白质分子便有利于相互作用、凝聚并沉淀。 盐析法：蛋白质的溶解度会随着溶液中盐离子的浓度增加而降低。常用试剂为硫酸铵（原因溶解度大）。null基因重组蛋白的主要分离技术基因重组蛋白的主要分离技术膜分离：膜分离技术是指用半透膜作为选择性障碍层，使溶液中某些组分通过，而截留其他组分的分离方法。 渗透和透析：渗透是一个扩散过程，利用膜两侧渗透压的差异使溶剂产生流动。 反渗透、超滤和微滤：反渗透是通过外加的高于溶液渗透压的压力，使溶液中的水透过膜，而溶液中的溶质则全部被截留，从而使溶液进一步浓缩。 电渗透：电渗透是在电位差的驱动下，用离子交换膜从溶液中分离离子的过程。利用电渗透法，可使溶液中的蛋白与离子分离，从而达到脱盐的目的。null半透膜细胞超滤装置（ Millipore ）基因重组蛋白的主要分离技术基因重组蛋白的主要分离技术双水相萃取 其原理是水相中加入溶于水的高分子化合物如聚乙二醇和葡聚糖，形成密度不同的两相体系。由于两相中均含有较多的水，故成为双水相。常见的双水相系统有聚乙二醇（PEG）/无机盐、PEG/葡聚糖等。 影响双水相萃取分配系数的因素很多，如无机盐的浓度、聚合物的分子量、pH及温度等。 由于无机盐中的正、负离子在双相中的分配系数不同，因此会在双相中形成电位差。 增加聚合物的分子量，可以降低蛋白质的分配系数，但还能增加细胞碎片在盐中的分配系数。 不同蛋白质分子有不同的等电点 温度变化也会影响分配系数基因重组蛋白的主要分离技术基因重组蛋白的主要分离技术基因重组蛋白的主要纯化技术基因重组蛋白的主要纯化技术基因重组蛋白的纯化主要采用层析法 离子交换层析（ion exchange chromatography） 离子交换层析是最常用的层析方法之一，它是利用蛋白质等电点的差异，来实现不同蛋白质间的分离和纯化。 离子交换柱根据其不同电荷载量以及蛋白质分子上交换官能团的不同可分为阴离子交换柱、阳离子交换柱、两性离子树脂和选择性离子交换柱。 null离子交换层析-原理图离子交换层析离子交换层析null离子交换层析-洗脱图基因重组蛋白的主要纯化技术基因重组蛋白的主要纯化技术亲和层析（affinity chromatography，AC） 亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附。相互作用包括酶与激活剂、抑制剂、底物，抗原与抗体，激素或配体与受体，蛋白质与DNA、RNA上某些特定区域。与亲和色谱中起可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的支撑物称为载体。 包括如下5个步骤： 配基固定化 亲和吸附阶段 洗涤阶段 洗脱解离阶段 再生阶段 亲和层析亲和层析利用分子间的特异结合能力1- 配基固定化以及亲和吸附2- 缓冲液洗涤柱子除去非特异性结合3- 洗脱解离，使目的蛋白与配体解离 亲和层析亲和层析null基因重组蛋白的主要纯化技术基因重组蛋白的主要纯化技术凝胶过滤层析 又称分子筛层析，其基本原理是根据生物分子的大小来实现目的蛋白分离纯化。在凝胶过滤层析中所用的凝胶是一种惰性的不带电荷具有三维空间结构的多孔网状物质，凝胶的每个颗粒的微细结构就如一个筛子，当样品随流动相一起，首先被洗脱下来，而较小的分子进入部分凝胶网孔内，所以流出的速度相对慢。小分子中分子大分子凝胶过滤层析凝胶过滤层析基因重组蛋白的主要纯化技术基因重组蛋白的主要纯化技术凝胶过滤层析——洗脱图基因重组蛋白的主要纯化技术基因重组蛋白的主要纯化技术反相色谱（reversed phase chromatography, RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography, HIC） 反相色谱是利用溶质分子中非极性集团与非极性固定相之间相互作用力的大小，以及溶质分子中极性基因与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小的差异进行分离。有机相中蛋白易变性。 疏水色谱与反相色谱相似，主要利用蛋白质分子表面的疏水区域（非极性氨基酸的侧链，如丙氨酸等）和介质的疏水基团（苯基或辛基）之间的相互作用。在高盐离子浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介质的疏水基团产生疏水性作用而被吸附，盐离子浓度降低时蛋白质的疏水作用也随之减弱，不同蛋白质被逐步洗脱下来，疏水性越强，洗脱的时间越长。蛋白在分离过程中仍保持其天然构象。选择分离纯化方法的依据选择分离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物的发酵液的体积很大，但浓度较低，因此纯化前进行浓缩，可用沉淀和超滤的方法浓缩。 根据分离单元之间的衔接选择 先将含量最多的杂质分离出去，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段 色谱分离次序 根据分离纯化工艺的要求来选择 具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性 尽可能减少组成工艺的步骤 分离纯化工艺所用的时间要尽可能的短 工艺和技术必须高效基因重组蛋白的分析和鉴定基因重组蛋白的分析和鉴定1、蛋白质含量的测定（曲线） 紫外（UV）吸收光谱： 蛋白质含有芳香族氨基酸，在280 nm处有特征吸收峰。 BCA法： 原理是在碱性溶液中，蛋白质分子将二价铜离子还原成一价铜离子（双缩脲），后者与试剂中的二辛可酸形成在562 nm处有最大吸光度的紫色复合物。10 min以内完成。 Lowry法（福林-酚法）： 原理是基于蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物可以还原磷钼酸-磷钨酸时产生蓝色。易被干扰 基因重组蛋白的分析和鉴定基因重组蛋白的分析和鉴定考马斯亮蓝法： 原理是将考马斯亮蓝G250溶于pH＜1的酸性溶液时，溶液呈红褐色，当溶液中有蛋白质存在时，与蛋白质结合的考马斯亮蓝恢复为原先的蓝色，在595 nm处有最大吸光度。 优点是步骤简便易操作，缺点是抗干扰能力弱，与缓冲液的相溶性较差。 SDS-凝胶染色与扫描分析 考马斯亮蓝R250染色，脱掉背景色以后，用扫描仪扫描。蛋白质纯度的鉴定蛋白质纯度的鉴定蛋白质的纯度一般指是否含有其他杂蛋白 目前鉴定蛋白质纯度的方法常见的有 电泳法 非变性电泳、SDS-PAGE、等电点聚焦、毛细管电泳 质谱法 电子喷雾法、基质辅助激光解吸离子化、 色谱法 反相HPLC、凝胶过滤、离子交换、亲和层析 末端氨基酸分析法 N末端序列分析 C末端序列分析蛋白质纯度和分子量的鉴定蛋白质纯度和分子量的鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 该方法不仅能快速准确的鉴别蛋白质的纯化程度，还能推算出蛋白质的分子量，结合凝胶城乡扫描装置还能算出蛋白质溶液的浓度。 SDS-PAGE检测蛋白质分子量 在SDS存在下，蛋白质表面带有大量负电荷呈杆状分子，在这种情况下电泳，蛋白质根据分子大小进行分离，聚丙烯酰胺凝胶起到了一个分子筛的功能。如加入一定量的β-巯基乙醇，可使蛋白质的二硫键被还原，此时电泳的条带均为单一的多肽链分子。 蛋白质纯度和分子量的鉴定蛋白质纯度和分子量的鉴定蛋白质纯度和分子量的鉴定蛋白质纯度和分子量的鉴定蛋白质纯度和分子量的鉴定蛋白质纯度和分子量的鉴定IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。 1为诱导前，2～6分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。 蛋白质纯度和分子量的鉴定蛋白质纯度和分子量的鉴定质谱法（mass spectrum） 基质辅助激光解吸离子化（MALDI-TOF） 电子喷雾离子化（ESI） 原理：待测样品经过分离装置（如高效液相色谱）或其他仪器。样品流出所形成的细小液滴在外加电场作用下带电，并被吸附到质谱仪的进出口，当溶剂挥发时，液滴被干燥，直径减小，单位面积的电荷密度增加，当电荷密度增加到一定程度时，产生的强大电场使液滴中的粒子逸出至气相中，并在外加电场的作用下运动，从荷质比（m/z）的分析就能确定待测蛋白的分子量。 蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定蛋白质的等电点（pI）是蛋白质上静电荷为0时的pH。测定蛋白质等电点常用方法是等电聚焦法。 等电聚焦是利用蛋白质在一定pH条件下所带的净电荷不同，通过外加电场作用，在线性pH梯度下移动，当pH等于某一数值时，该蛋白质分子不再移动，此处凝胶的pH就是该蛋白质的等电点。 蛋白质序列分析蛋白质序列分析N端氨基酸序列分析：目前N端测序在自动氨基酸测序仪上进行，其基本原理就是Edman法 第一步是偶联反应，其原理是异硫氰酸苯酯（PITC）与多肽或蛋白质的α-氨基发生反应，生成苯氨基硫代甲酰基衍生物。 第二步是环化裂解反应，在45~55℃，无水有机酸中，苯氨基硫代甲酰基衍生物的硫原子与碳原子发生关环反应，使肽链断裂，并产生一个五元环的氨基酸衍生物—苯胺基噻唑啉酮（ATZ） 第三步是转化反应，生成乙内酰硫脲衍生物。蛋白质或者多肽和PITC反应，只有N端氨基酸的PTH衍生物释放出来，通过反相HPLC进行分离分析，而原来的多肽少了N端的一个氨基酸，开始进行下一轮的与PITC的反应。蛋白质序列分析蛋白质序列分析C端氨基酸序列分析：C端测序对确认表达蛋白质的C端是否正确，以及判断在表达、纯化过程中是否发生了必不可少的加工有很大的帮助，因此基因重组蛋白还有必要测定C端的几个氨基酸序列。 C端测序目前多采用化学试剂与蛋白质或多肽的α-羧基反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC分离鉴定。基因重组蛋白质的分析与鉴定基因重组蛋白质的分析与鉴定蛋白质的二硫键分析： 蛋白质中二硫键的数量可以根据相关的半胱氨酸残基的数量，通过还原反应和烷基化反应前后的质量差异来确定。 蛋白质活性的测定 酶促活性检测、待测蛋白与其他蛋白质或核酸结合能力、或与配体的结合能力等来测定 通过蛋白对细胞、组织和器官等生物功能的影响来鉴定 免疫测定法 基因重组蛋白是一种抗原，均可制备相应的抗体或单克隆抗体，因此，可以用放射性免疫分析法（RIA）或酶标法（ELISA）测定其免疫学性质。第二节 基因工程药物研发中的特殊性要求第二节 基因工程药物研发中的特殊性要求基因工程药物临床安全性评价的特殊性基因工程药物临床安全性评价的特殊性化学药物的安全性评价已经建立了比较完善的体系。而蛋白质类药物由于下述特点造成了其在临床前安全性评价的不适用性。 结构确证不完全性 种属特异性 多功能性 免疫原性 基因工程药物临床安全性评价的特殊性基因工程药物临床安全性评价的特殊性蛋白质类药物安全性担忧的性质和来源 药理作用的放大或延伸 免疫毒性 杂质或污染物引起的毒性 受试物的纯度 表达蛋白的宿主细胞的污染会导致安全性评价结果复杂性 相关动物的选择 给药剂量的选择 免疫原性 遗传毒性和致癌性 药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题真核细胞表达制品的安全性问题理论上，存在与生物制品中的微量的DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其他病理变化。null基因工程药物稳定性研究的相关问题基因工程药物稳定性研究的相关问题药物浓度 蛋白质类药物在低浓度下出现制剂不稳定现象 温度 蛋白质类药物一般对热敏感 湿度和水分 冻干制剂水分含量要求1%~3% 氧 许多蛋白质药物怕氧化 光照 许多蛋白质对光敏感基因工程药物稳定性研究的相关问题基因工程药物稳定性研究的相关问题pH 不同pH条件下，蛋白质结构可能完全不同 设计稳定，需考虑以上因素。基因工程药物的修饰与改造（蛋白质工程）基因工程药物的修饰与改造（蛋白质工程）基因工程药物的修饰与改造基因工程药物的修饰与改造为了提高蛋白质药物的稳定性，解除其抗原性，提高其生物学活性，延长蛋白质类药物半衰期，人们越来越重视克服蛋白质药物应用中的缺点，对药物进行人工改造，以扩大其在实际应用中的适用范围。构建突变体构建突变体基因定点突变技术：能够在基因水平上对所编码的蛋白质分子进行改造。位点特异性突变大体可分为三种类型： 通过寡核苷酸介导的基因突变 盒式突变或片段取代突变 利用PCR，以双链DNA为模板进行基因突变 常见方法 向蛋白质药物表面引入糖基侧链 形成缓释的微沉淀物构建突变体构建突变体首先设计一对互补引物，在引物中含有预期的突变位点。 然后以待突变质粒为模板，用这两个引物和DNA聚合酶进行PCR扩增反应 构建得到含有预期突变微点的双链质粒，该质粒中存在缺口 构建突变体构建突变体白介素-2（IL-2） 胰岛素 EPO以融合蛋白的形式表达药物基因以融合蛋白的形式表达药物基因许多蛋白质药物与原核生物的蛋白质融合后，能保留原有的免疫原性。一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白，其免疫原性能得到加强。用这种融合蛋白免疫动物所制备的抗体，能够用于检测原来的多肽药物，也可用于药代动力学研究，药物受体研究以及药物产品的检测。 有些情况下，采用融合蛋白的形式表达外源基因是不得以而为之。一些多肽药物在原核细胞中不稳定，难以获得高表达。这些蛋白与菌体蛋白融合后得到稳定，但融合蛋白需经过后处理才能释放出有活性的外源多肽。 多肽药物的纯化通常较为困难，但与特定的原核蛋白融合后，不仅能稳定所表达的产物，还能用识别蛋白的配体进行亲和层析纯化。如GST-融合基因，所产生的融合蛋白可用谷胱甘肽亲和柱一次性纯化。融合蛋白融合蛋白人血清白蛋白（HSA） HSA具有维持血液渗透压，运输营养物质以及其他重要生物物质的作用。 HSA又是许多内源银子和外源药物的载体，药物和HAS结合以后，可以降低其生物利用度，并延长药物在体内的半衰期，且具有抗氧化作用。 Albuferon-α: HSA+IFN-α Albuferon-β: HSA+IFN-β Albuleukin: HSA+IL-2 Albugranin: HSA+G-CSF Albutropin: HSA+rHGH融合蛋白融合蛋白HSA的重组蛋白类药物使蛋白质药物克服了半衰期短、清除率高的缺点，在保持原有药物活性的基础上，延长了蛋白质类药物的半衰期，降低了体内清除率，实现蛋白质类药物的长效治疗。蛋白质药物的PEG化蛋白质药物的PEG化Why? 蛋白质药物由于免疫原性强，毒副作用大，限制了其在临床上的应用，同时由于蛋白质药物的血浆半衰期短，临床使用不得不加大给药计量和加快给药频率以获得显著的临床效果。 HOW? 通过对主链的切割、剪接以及化学基因的引入，从而实现对蛋白质理化性质和生物活性的改变。 WHAT? 糖及糖的衍生物、生物大分子、双功能试剂以及高分