反复自然流产的免疫病因学诊断及治疗

的变化，担当起实现最终彻底清除衄V的重任。 目前，尽管我们对慢性乙肝免疫发病和免疫耐受机制的认识有了长足进展，可供选择的 临床抗病毒治疗也越来越多，但慢性乙肝的发病机制复杂，对它的认识仍然非常有限， 临床治疗效果仍不尽人意，因此仍然需要加强对慢性乙型肝炎基础和临床方面的研究，继续 阐明慢性乙肝免疫耐受机制，加强抗病毒治疗过程中的免疫应答监测，制定更为有效、合理 的抗病毒治疗方案，发展新型的、适合临床使用的免疫调节治疗，进一步提高慢性乙肝 的临床疗效，以达到最终的临床痊愈目标。 反复自然流产的免疫病因学诊断及治疗 李大金 复旦大学附属妇产科研究所， 200011 反复自然流产(RecurrentSpontaneousAbortion，RSA)是一种常见妊娠并发症。 除少数受患夫妇因内分泌、染色体异常及生殖道畸形或占位性病变等因素外，80％以上原因 不明n1。随着生殖免疫学等学科的兴起与发展，RSA发病与免疫功能异常的关系得到妇产科 临床的足够重视，并取得明显进展。本文就反复自然流产的免疫流行病学、免疫病因学、 免疫发病机理、免疫学诊断及治疗等研究进展，结合我们自己的研究经验，综述如下。 1反复自然流产的免疫流行病学评价 对RSA的免疫病因构成进行归纳显示：在所有RSA病因中，封闭抗体缺乏占了病 因构成的大部分，而且可能是原发性流产和继发性流产的共同病因n1。我们以正常生育组发 生率进行校正，则原发性流产及继发性流产的免疫病因组成如下： 1．1 RSA的免疫病因组成 在RSA患者中，封闭抗体缺乏占31．7％；透明带抗体阳性占20．4％；磷脂抗体阳性占 12．5％；ABO血型抗体阳性占11．5％，仍有23．9％的患者原因不明。在自身抗体及同种抗体异 常方面，仅有l例患者(1／88)为磷脂抗体与透明带抗体复合阳性：其余均为单一指标阳性 【2】 1．2原发性流产的免疫病因组成 在原发性流产中，封闭抗体缺乏占31．4％；透明带抗体阳性占20．4％；磷脂抗体阳性占 8．5％；ABO血型抗体阳性占8．4％；尚有31．3％的患者原因不明。以上所述的1例磷脂抗体与 7 透明带抗体复合阳性患者来自本组(1／82)，其余均为单一指标阳性乜1。 1．3继发性流产的免疫病因组成 ‘ 封闭抗体独特型一抗独特型抗体网络紊乱占39．4％；磷脂抗体阳性占31．3％；ABO血型 抗体阳性占22．4％；6．8％的患者原因不明。本组病例无l例多个指标复合异常。因此，就免 疫病因组成而言，继发性流产与原发性流产有着明显的区别。这一点应在诊治RSA时应引 起注意‘21。 在RSA病例中，原发性流产129例，继发性流产16例。由此可见，原发性流产占RSA 病例总数的89．0％乜3。因此，占原发性流产病因组成较重的封闭抗体缺乏及透明带抗体异常 增高应引起临床足够重视。 2 RSA的免疫病因分类 尽管原发性流产与继发性流产分类对于RSA免疫学治疗产生过积极意义。但根据RSA 免疫流行病学分析显示，原发性流产与继发性流产的免疫病因组成有较大部分的重叠。如 磷脂抗体及ABO血型抗体异常增高及封闭抗体缺乏既参与原发性流产，又参与继发性流产 的发病过程。显然既往原发性流产与继发性流产的分类，对于临床选择针对性免疫治疗手 段无多大指导意义。因此，我们推荐以下免疫病因分类，以利于临床选择有效免疫治疗措 施，并提高疗效。 2．1母一胎免疫识别低下型 这种类型主要呈现封闭抗体缺乏，是RSA的主要病因类型，原发性流产常表现为封闭 抗体及封闭抗体的独特型抗体共同缺乏；而继发性流产仅表现为封闭抗体的抗独特型抗体 缺乏脚。此种类型宜采用白细胞免疫疗法及静脉免疫球蛋白被动免疫疗法，旨在促使建立封 闭抗体的独特型一抗独特型网络。由于免疫抑制剂将抑制封闭抗体产生，因而削落对胚胎 的免疫保护作用，不适于这种类型的治疗。 2．2母一胎免疫识别过度型 包括自身免疫异常型(如透明带抗体、磷脂抗体等)及同种免疫异常型(母一胎ABO血型 不合)等两类‰利。治疗以免疫抑制剂为主，进而降低母体对胎)h-胎盘单位的损伤作用；禁 用象白细胞免疫等免疫增强疗法；否则会导致母体对胚胎抗原的免疫过度识别，加速对胚 胎的免疫排斥反应。 2．3母一胎免疫识别复杂型 --+部分RSA患者一方面表现为封闭抗体缺乏，显示母一胎同种免疫识别低下；另一 方面亦表现出自身免疫及同种免疫损伤作用异常增高。这一类型在临床上十分棘手，有待探 R 索以诱导母体对胚胎免疫耐受为主导的治疗方案。 3 RSA的免疫发病机理 3．1母一胎免疫识别低下型RSA的免疫发病机理 封闭抗体生物学作用的靶标抗原主要表达于滋养层细胞的TLX抗原。封闭抗体缺乏是 RSA的主要病因已得到普遍承认。然而，有关封闭抗体缺乏导致RSA的发病机理的研究尚不 够完善。 我们应用流式细胞仪分析了封闭抗体对T淋巴细胞表面CD抗原的作用。结果显示，正 常生育组抗CD。邗E、抗CD4-BE及抗CDs—BE明显高于RSA。特别是抗CDs--BE及抗CDt--BE的 生物学作用至关重要。RSA患者可能因滋养层细胞不能有效表达CDs及CD4相关TLX抗原， 因而不能有效刺激母体产生抗CD。--BE及抗CD4一BE，继而对胚胎不能产生免疫保护作用哺3。 我们在研究中还发现，RSA患者外周血CDt细胞及CDt，CDs例明显低于正常生育期妇女； 且外周血免疫活性细胞IL--2活性高于正常生育期妇女№1。这可能因封闭抗体独特型一抗独 特型网络紊乱所介导的免疫活性细胞及其因子的失调。特别是封闭抗体缺乏及封闭抗体的 抗独特型抗体缺乏，将引起母体免疫损伤性细胞及因子异常增高，最终对胚胎产生免疫排 斥作用而导致RSA。 3．2母一胎免疫识别过度型RSA的免疫发病机理 磷脂抗体是引起RSA的重要因素之一。磷脂成份与Bz一糖蛋白结合，暴露了其与磷脂抗 体作用的抗原位点。磷脂抗体与之结合后，可介导血小板与血管内皮细胞粘着，从而促使 血栓形成。随着胎盘血管血栓形成的加重，引起胎盘梗死，导致流产伍，31。因此，由磷脂抗 体引起的RSA常表现为继发性流产。 ABO血型抗体是RSA的另一因素。异常增高的血型抗体，或作用于滋养层细胞，或通过 胎盘进入胎儿体内，导致胎儿一胎盘单位多器官组织细胞的损伤。若胎儿一胎盘单位免疫 损伤严重，则发生流产。此种病因的RSA亦常表现为继发性流产b1。 透明带自身抗体是不孕症的重要原因之一。本文首次发现透明带抗体亦是RSA的原因。 由于透明带自身抗体对含透明带的孕卵产生损伤作用。孕卵即使着床也因前期的损伤作用 而不能正常发育。这种情形仅可能发生在孕早期。因此，透明带抗体引起的RSA常为原发 性流产‘引。 3．3母一胎免疫识别复杂型RSA的免疫发病机理 免疫识别复杂型RSA是一种十分复杂但不多见的RSA。一方面呈现母一胎免疫识别下； 另一方面呈现母体自身免疫及同种免疫功能异常增高。上述两方面的变化实际上体现了母 9 体对胚胎免疫保护作用的削弱，及母体对胚胎免疫损伤作用的增强。可能是临床上最难处 理的一种类型。我们在研究中发现，白细胞免疫疗法能使部分阳性磷脂抗体阴转(未发表)， 提示这两方面变化存在相互联系。 4反复自然流产的免疫学诊断 由于RSA病因组成复杂，其诊断步骤应瞄准分析导致RSA的病因，方能对其治疗有所 裨益。在进行RSA的免疫病因诊断前，需首先除外非免疫性病因，如黄体功能不健、夫妇 双方染色体异常、生殖道畸形或生殖道占位性病变等。 4．1封闭抗体及其抗独特型抗体的检测与分析 封闭抗体在RSA的免疫病因学诊断中占有重要地位。因此，建立封闭抗体的分析方法 是进行RSA免疫病因学诊断与治疗的必备条件。现就国内外封闭抗体及其抗独特型抗体的 一系列检测方法介绍如下： 4．1．1补体依赖性细胞毒试验本法首先由McIntyre等建立‘利。基本原理是女方血清内 存在封闭抗体与男方外周血淋巴细胞结合，并在补体介导作用下致细胞死亡，经台盼蓝或 伊红染色，可在光学显微镜下或在倒置相差显微镜下评判结果。 4．1．2队玫瑰花环抑制试验EA玫瑰花形成试验是检测人外周血B淋巴细胞表面Fc受 体的传统方法。首先由Power等改进用来检测封闭抗体抽1。先将女方血清与男方外周血淋巴 细胞共育，经洗涤后，加结合了相应抗体的指示红细胞共育，然后在光学显微镜下分析结 果。若女方血清中存在封闭抗体，则影响指示红细胞与男方B淋巴细胞的结合。然而，由 于B淋巴细胞表面的受体与抗体Fc段的结合对实验条件的要求较为严格，培养条件及缓冲 液稍有差异，将大大影响实验结果，必须引起注意。 4．1．3单向混合淋巴细胞反应封闭试验混合淋巴细胞培养是检测两个体MttCII类抗原 相容性的一种筛选方法。最早由日本学者Takeuchi改进用来检测封闭抗体阳1。实验时，男 方淋巴细胞先经丝裂霉处理，让其失去免疫反应能力，但保持免疫刺激能力，然后分别在 含有AB型血清及女方血清的培养条件下，与女方淋巴细胞混合培育6天，在培养结束前18 小时，加3H--TdR。分别收获相应细胞，于闪烁仪测量其CPM值。结果以l一含女方血清的 CPM值／含AB型血清的CPM值，即以封闭效率(BE)表示。 为了纠正国内外使用的单向混合淋巴细胞反应封闭试验的不合理性，我们对该法进行 了改进。将男方刺激细胞与女方待测血清预孵育，然后分离结合了封闭抗体的刺激细胞， 将经或未经封闭抗体作用的男方刺激细胞分别与女方反应细胞在25％正常AB型血清同等培 养条件下培养6天。改进后方法测得正常生育组与原发性反复自然流产组封闭效率阳性率 10 为57．1％及12．3％，均数为7．53±10．30及-55．51±13．41。改进后方法的准确度(81．7％)、灵 敏度(87．8％)及特异性(57．1％)均高于改进前。在分析白细胞免疫疗法免疫效果时发现，改 进后的方法更能准确反应患者体内封闭效率逐渐上升趋势。改进后的封闭效率在评价反复 自然流产治疗的临床疗效时优于改进前n训。 4．1．4封闭抗体抗独特型抗体分析正常妊娠时，母体可产生与TLX抗原作用的封闭抗 体(Abl)并因此而产生与Abl作用的抗独特型抗体(Ab2)。Abl与Ab2处于相互作用的动 态平衡状态中，Abl主要参与胎盘局部免疫反应，即与滋养层细胞表面的TLX抗原形成保护 作用，使胎儿胎盘均免受母体NI(细胞等的攻击。而Ab2则对Abl起双向调节作用，使体 内Abl水平达到相对稳定状态；另外，Ab2由于有滋养层细胞抗原的“内影像”结构，因 而它不仅在母胎免疫界面局部，而且在体循环与那些对胎儿胎盘单位有害的免疫活性细胞 (如Tc及NK细胞)及有关因子(如IL-2等)产生作用，进而构成胎儿胎盘单位的重要免疫保 护网络。为了观察在反复自然流产(RSA)中独特型抗体一抗独特型抗体网络的作用，我们分 别测定了正常生育组、原发性RSA、继发性RSA的封闭抗体效率(Abl)和抗独特型抗体(Ab2)， 以及原发性RSA免疫治疗前后Ab2的变化。结果发现：正常生育组的AbI和Ab2分别为 7．53％和10．7％：而原发性RSA分别为-55．51％和-42．68％：继发性RSA则分别为29．98％和 一30％，免疫治疗前后，原发性RSA患者体内的Ab2水平有明显差异，并随着免疫次数的增多， Ab2水平有逐渐增高趋势。结果表明：原发性RSA主要是因为体内缺乏TLX的封闭抗体及 其抗独特型抗体，而继发性RSA仅显示封闭抗体的抗独特型抗体缺乏。因此封闭抗体的Ab2 可区分RSA临床型并作为RSA诊疗的重要指标n¨。 4．1．5FCM分析封闭抗体对CD抗原的作用为了评价封闭抗体对cD抗原可能的作用，我 们建立了以下分析方法：在男方淋巴细胞中加等量鼠抗人CD。、CD。及CDs单克隆抗体，再分 别加等量女方血清及正常AB型血清孵育30分钟、洗涤，加等量荧光的羊抗人IgG孵育、 洗涤、固定，以流式细胞仪客观分析。先分别计算出加女方血清及加AB型血清的配偶T淋 巴细胞CD3+、CD4+及cD。+细胞比例；然后计算各自封闭效率旧。 4．2透明带抗体的测定 我们的研究结果表明，透明带自身抗体参与RSA的发病‘引。采用BA--ELISA法，主要步 骤如下：将热溶解的猪卵透明带抗原经Sephadex--G100柱层析包被酶标板。待测血清经猪 11 红细胞吸收后，按1-100稀释加入酶标板(0．1ml／孔)，孵育l小时，依次洗涤加生物素化 抗人免疫球蛋白抗体、HRP酶标亲和素及TMB底物后，加终止液于酶标仪判断结果。 4．3磷脂抗体的检测 磷脂抗体是RSA的重要原因之一。根据国内外研究资料，主要采用ELISA法进行 检测n2’1劓。酶标板经牛心磷脂包被，以含20％成年牛血清的PBS封板，加入1：100稀释的 待测血清，孵育1小时。洗涤，加HPH一抗人IgG，(样本及酶标抗体均以含10％成年牛血 清PBS稀释)。洗涤后加底物、终止液于酶标仪标判断结果。 4．3ABO血型抗体的检测 国内研究资料表明，夫妇间ABO血型不合，因此产生的ABO血型抗体参与RSA发病n制。 采用间接血凝法，凝集效价≥1：128作为阳性差别标准。 5反复自然流产的免疫治疗 根据RSA的免疫病因分类，RSA由母一胎免疫识别低下型、母一胎免疫识别过度型及母 一胎免疫识别紊乱型三类组成。本文分别不同免疫病因学类型的治疗方案介绍如下： 5．1母一胎免疫识别低下型RSA的免疫治疗 5．1．1供者白细胞静脉免疫疗法输注红细胞血型一致的红白细胞混悬液4个单位，及配 偶白细胞皮内加静脉免疫疗法，白细胞总数平均为2．74X107／次。两组均间隔4周免疫一 次，免疫3次为一疗程，末次免疫后2周复查封闭抗体。MLR—BE仍未升高者加强免疫一次， 直至封闭抗体明显升高n目。 5．1．2配偶白细胞皮内免疫疗法新鲜抽取配偶外周血50ml，分离单个核白细胞，约2 --3X107，对女方进行多点皮内注射，每间隔4周免疫一次，3次为～个免疫疗程。末次免 疫后2周复查封闭抗体，如仍未升高者，加强免疫一次，直至产生较高封闭抗体水平n田。 在发现患者封闭抗体升高后，安排受孕：并于妊娠35天加强免疫一次，此后每间隔4 周加强免疫一次，直至孕16周。妊娠16周后一般不需要加强免疫。 5．1．3白细胞免疫治疗的作用机制 白细胞免疫疗法能刺激RSA患者产生足够的封闭抗 体，这是在随后发生的妊娠能得以成功的主要理论依据。研究结果显示，经3—5次白细胞 免疫后，患者封闭抗体及其独特型抗体水平明显升高。其升高的封闭抗体主要作用于母胎 界面局部，从而发挥保护胎儿胎盘单位的作用。封闭抗体的抗独特型抗体由于与滋养细胞 等抗原的“内影像”结构，因而它不仅在母胎免疫界面局部，而且在体循环与那些对胎儿 胎盘单位有害的免疫活性细胞(如Tc及Nl(细胞等)及有关因子(如IL-2等)产生作用，进而 构成胎儿胎盘单位的重要免疫保护网络。我们在前期研究工作中发现，白细胞免疫疗法能 12 使患者CDt细胞及CDt／s比例明显上升，IL-2活性明显下降。这种外周免疫功能的变化，可 能通过抗封闭抗体独特型抗体所介导，有利于促进母体对胚胎的免疫保护及抑制母体对胚 胎的免疫损伤，最终有利于妊娠成功n¨71。 5．2母一胎免疫识别过度型RSA的免疫治疗 5．2．1母一胎免疫识别过度型RSA的中西医结合治疗国外对磷脂抗体导致的妊娠失败 主要采用阿司匹林或肝素治疗能获得～定临床疗效n别。我们对透明带抗体阳性的患者治则为 滋补肾阴、清泻虚火。治疗采用中成药知柏地黄丸，每次69，每天3次。对磷脂抗体或ABO 血型抗体阳性的患者治则为清热利湿，养血活血，标本兼治。服法：于孕前服用，每天l 剂，直到孕晚期。对于磷脂抗体阳性患者需加用小剂量阿司匹林50mg，每晚1次n引。 在中西医结合治疗过程中，分析异常增高的自身或同种抗体的变化规律，我们发现，透 明带抗体阳性患者经知柏地黄丸治疗后，其抗体水平呈现下降趋势，受孕后亦维持在低水平。 对于磷脂抗体及血型抗体阳性的RSA患者采用清热利湿养血活血治疗后，各自的抗体水平呈 现明显的下降；但受孕后再次反跳性升高，此时需适当增加中西药药物剂量，受孕中相应的 抗体再次转为阴性‘191。 5．2．2母一胎免疫识别过度型RSA中西医结合治疗的作用机理对于磷脂抗体阳性的RSA 患者，本文应用中药复方，旨在抑制患者体内磷脂抗体的产生，并抑制磷脂抗体对胚胎的 损伤作用，以西药阿司匹林，旨在拮抗磷脂抗体介导的血栓形成，从而达到改善胎盘血流量， 及胎儿血循环的作用。对于ABO血型不合患者应用中药复方治疗，主要在于抑制母体产生ABO 血型抗体，以及血型抗体对胎儿的损伤作用。应用知柏地黄丸治疗由透明带抗体异常升高引 起的RSA，一方面是降低抗体水平，另一方面在于改善患者的生殖能力，最终有利于胚胎 在母体内存活m1。 5．2母一胎免疫识别复杂型RSA免疫治疗 此型在RSA不多见，但其病因复杂，是临床十分棘手的一种病因类型。这类RSA患者 体内呈现自身免疫倾向。这种自身免疫倾向尚影响正常母一胎免疫调节网络的正常建立。 其本质为母体自身的免疫调节紊乱，造成母一胎免疫调节紊乱。 我们的研究结果表明，白细胞免疫疗法不但不增加磷脂抗体产生，相反可使部分磷脂 抗体阳性的RSA患者转为阴性，并获得妊娠预后。从这个意义上说，白细胞免疫疗法仍然 适应这种类型RSA患者，若加用小剂量阿司匹林，可能获得更好临床疗效。推荐的中医治 则为清热利湿，益肾活血。对此型RSA患者，尚未见中药复方治疗成功的报道。坚持以上 中医治则，可能获得较好Ii65床疗效。 13 5．3环孢霉素在RSA治疗中的价值 环孢素A(CsA)自20世纪70年代应用于临床以来，作为免疫抑制剂发挥了重要的作 用；是目前公认的抑制移植排斥反应最为有效的药物。我们课题组前期体外研究发现，低 浓度CsA(10—4～1．0umol／L)可以明显抑制滋养细胞凋亡，并促进其增殖、迁移与侵袭； 体内实验发现，妊娠失败模型孕鼠经CsA治疗后，母一胎界面IFN—Y分泌降低，IL-IO分泌 增加，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞扩增，胚胎吸收率下降。这些结果提示CsA对母一胎 界面具有良好调节作用，可改善滋养细胞生物学功能，并有利于母一胎界面Th2型免疫偏移 和免疫耐受产生。 CsA通过MAKP／RKl／2信号通路促进人早孕期滋养细胞表达SDF-1／CXCR4，上调的 SDF一1／CXCR4反应轴增强滋养细胞增殖与侵袭功能。CsA可同时促进人早孕期DSC与滋养细 胞共同分泌M】IIP9与MMP2，这有助于共培养系统中滋养细胞与DSC的协作与交流，进一步增 强滋养细胞侵袭能力。CsA可促进人早孕期滋养细胞、DSC和DIC共培养系统IL-IO的分泌， 同时抑制IFN—Y产生。母一胎界面整体水平IL-IO上调，IFN—Y下调，将有助于产生Th2 型免疫偏移。 因此，CsA的药理作用机制远远超过人们迄今为止的认识，它可能成为一种新型保胎制 剂，为临床治疗反复自然流产等免疫相关妊娠疾病提供了一种新的策略。 6．反复自然流产治疗的随访 6．1妊娠再次失败 对再次妊娠失败患者进一步分析失败原因。必须胚胎死亡早期获得流产物或胚胎来源 的细胞，分析胚胎染色体及致使性基因缺陷。对患者夫妇作进一步系统检讨及检查，完善 此前疏漏的检查内容。 6．2妊娠成功 孕期检查：对于早期妊娠失败患者，一般孕早期hCG>IO万u／ml；B显示宫内妊娠，可见胚 胎心血管搏动，预示着本次妊娠成功。于妊娠中晚期，跟踪母胎健康状况，记录病理性妊娠 情况。产后随访新生儿及婴幼儿成长及健康状况。 14 反复自然流产的免疫病因学诊断及治疗 作者： 李大会 作者单位： 复旦大学附属妇产科研究所，200011 本文读者也读过(10条) 1. 吴金萍.王桂贤.李昭荣.WU Jin-ping.Wang Gui-xian.LI Zhao-rong 不明原因反复自然流产的免疫病因及治疗 进展[期刊]-国外医学（妇幼保健分册）2005,16(4) 2. 劳一平.彭凌湘.LAO Yi-ping.PENG Ling-xiang 反复自然流产与生殖道感染[期刊论文]-中国临床新医学 2009,2(5) 3. 刘伟 子痫前期与免疫学[会议论文]-2007 4. 武美丽.柳肃芬.闫有圣.孙鹏 反复自然流产病因分析[期刊论文]-中国优生与遗传杂志2007,15(11) 5. 张娟 反复自然流产免疫因素及研究进展[期刊论文]-中国实用医药2010,05(32) 6. 王旭东 下调Livin基因表达对结肠癌细胞耐药的影响[会议论文]-2009 7. 顾艳伟.孙玉秀.GU Yan-wei.SUN Yu-xiu 反复自然流产的病因学研究进展[期刊论文]-中国误诊学杂志 2007,7(3) 8. 施文浩.张薇.王志勇.段飞茹 卵巢早衰的中西医研究新进展[期刊论文]-中国中医药现代远程教育2009,7(11) 9. 李大金.李超荆 生殖免疫学中西医结合研究进展[会议论文]-2001 10. 郭海艳.俞炳耀.周文达 免疫不孕中抗精子抗体ELISA检测的研究进展[期刊论文]-江西医学检验2007,25(4) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_7183442.aspx