黄精多糖酶解物药效学研究

湖北大学 硕士学位论文 黄精多糖酶解物药效学研究 姓名：吕新勇 申请学位级别：硕士 专业：微生物与生化药学 指导教师：陈勇 20080501 于两 要 中药黄精是百合科(Libaceae)黄精属(Polygonatum)多种植物的干燥根茎，在 中国分布很广。在中医中黄精具有补脾润肺，养阴生津等作用，药理学研究证明， 黄精多糖具有免疫激发、增强免疫、延缓衰老、抗病毒等多方面的作用。 本文通过对黄精多糖的酶解，在保持多糖含量相同的前提下，比较不同方法 制备酶解产物与水提物之间活性差异：黄精多糖对小鼠免疫能力的影响(主要测 定指标有碳粒廓清能力、血清溶血素生成能力、T一细胞占细胞总数比例)；黄精 多糖对化疗后修复作用(主要检测指标是免疫器官胸腺、脾脏的脏器指数)；黄 精多糖降血糖实验研究(主要检测指标为四氧嘧啶致高血糖小鼠的血糖值、葡萄 糖的耐受量等指标)；对优选出的黄精多糖酶解物的分子量做了测定。 实验结果证实：黄精多糖酶解后药理活性明显优于水提物，剂量也具有一定 的依赖性：酶解物在免疫，修复作用和降血糖实验研究中，药理活性高于原多糖， 而在所有酶解组中，酶解物II在各实验中均表现较高的药理活性，且与对照组之 间有显著性差异，通过对酶解物11分子量测定，其分子量为2．104 关键词：黄精；多糖； 酶解； 免疫； 降血糖 Abstract RhizomaPolygonatiisthedriedrootsoftheplamPolygonatumsibiricumRed，P． cyrtonemaHuaorP．kingianumCold．etHemsl，whichbelongtoLiliaceae．Itis widelydistributedinChina．Asatraditionalherbalmedicine，ithasbeenusedforthe treatmentofcough，dizzinessandlungtrouble．Somepharmacologicalevidenceshave provedthatpolysaccharidesfromPolygonatumsibiricumexhibitimmunomodulatory， anti—inflammationandantiviralactivity． Thistextbasedonthepremiseofthepolysaccharidecontentinthesame maintaining，Polysaccharidehydrolysis，comparedifferentmethodsofhydrolysate andwaterextractofdifferencebetweenactivity：PolygonatumsibiricumRed polysaccharideontheimmuneabilityofmice(mainlycarbonclearance，serum hemolysinproductioncapacityandT—cellratioofthetotalnumberofcells) PolygonatumsibiricumRedpolysaccharidetaketheroleofrepairafterchemotherapy (mainindicatorsofimmuneorgansthymus，spleenorganindex)；Polygonatum sibiricumRedpolysaccharidehypoglycemicexperimentalstudy(hyperglycemiain micebloodandglucosetolerance)， MolecularweightdeterminationofThe optimizationofPolygonatumpolysaccharidehydrolysis． Wecanseefromstudy：enzymeCanbegreatlyimprovedPolygonatum polysaccharidepharmacologicalactivity．Mostoftheenzymeinthestudy， polysaccharides，andothercomponentsusedintheextraction．Inthispaper,the enzymatichydrolysisIIshowedhigherpharmacologicalactivityandthecontrolgroup betweenthesignificantdifferenc，theweightoftheenzymatichydrolysisIIare2宰104 Keyword：Polygonatumsibiricum：polysaccharide；enzyme；immune； hypoglycemic Ⅱ 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 论文作者签名：吕新勇 日期： 2008年5月15日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服 务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。(保 密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：占南谚 指导教师签名：7∥雪 日期：。却矿．‘．哆 日期：少神6’多，哆 第一章前言 1．1多糖的研究进展 第一部分前言 多糖是由二十多个单糖到上万个单糖通过糖苷键连接成的一类重要的大分 子物质。按来源不同，多糖可分为五大类：真菌多糖、高等植物多糖、藻类地衣 多糖、动物多糖、细菌类多糖，其中以高等植物和真菌中含量最为丰富。多糖 作为一种重要的生物体内的大分子，与核酸和蛋白质一样与生物体的机能密切 相关．过去认为糖类在生物体内的作用主要是作为能源物质，例如动物体内的糖 原和植物中的淀粉；或者是作为结构物质，如植物中的纤维素等。至上世纪中叶， 越来越多的研究表明，糖结合物在信息传递和分子识别过程中起着关键的作用。 随着人们发现多糖对恶性肿瘤、炎症和心血管疾病都有一定的疗效并且具有抗 衰老作用，以及多糖研究手段的提高，国内外对多糖的研究都有空前的发展。 实际上国外对天然药物多糖的研究己经有上百年的历史了，内容包括中草药 来源多糖有效成分的提取、分离、纯化、结构测定、结构改造、糖链合成、应 用治疗以及结构一功能关系研究等等。制备和筛选了一系列天然产物多糖，除 用于研发新型药物和保健食品，还作为粘接剂、稳定剂，化妆品等广泛应用于 工业上。自1930年德国人发现了真菌多糖的抗癌效果，特别是1969年日本千 原报道了香菇多糖的抗肿瘤活性以来，多糖的研究便全面展开，对象包括真菌、 地衣、动植物，范围涉及多糖的化学研究、药学研究、治疗应用等，尤其是真 菌多糖的抗肿瘤研究成为一个热点。其中，一些分子量几千以上，具有很强生 物活性的多糖的研究受到日益重视，它们的生理活性、化学结构以及构效关系 成为多糖研究的前沿阵地，取得了很大的进展。日本十分重视对多糖的研究。 80年代以来，已有数种多糖应用于临床，如香菇多糖、裂褶多糖、云芝多糖O's—K) 及多糖(75)等。近年来，日本学者在常规化学方法的基础上，大量引进现代分 子生物学技术与手段，加强了中药多糖活性决定簇等的化学结构与功能关系的 研究，并在柴胡、当归等中药的研究方面有了一定的突破。美、欧亦十分重视 糖类的研究【¨。1989年日本创刊了《糖科学与糖工程动态》杂志，91年实施“糖 工程前言计划’’。美国能源部1986年创建了复合糖类研究中心，建立复合糖类 湖北大学硕士毕业论文 数据库，到1996年己经收集了4200个糖结构数据【21。欧盟1984．1998年启动 “欧洲糖类研究开发网络"计划，旨在携带欧洲各国的糖类研究。现己确证糖 类作为信息分子在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持 等方面的重要作用．炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常增值和转换、病 原体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程都有 糖类的介引31。国内对多糖的研究起步较晚，但有丰富的中草药资源和雄厚的 传统中医理论，进展甚快【"】。70年代以来，我国在云芝糖肽、银耳多糖、刺五 加多糖、交联淀粉、苦豆子胶、田葺胶、竹黄多糖和黄茂多搪的研究中呈现出 可喜的前景。近20年来，还分别从灵芝、黑木耳、裂褶菌、安络小皮伞、雷丸、 针裂蹄、密环菌、亮菌、斜顶菌、冬虫夏草、猴头菌、竹荪、获等、地黄、金 针菇、魔芋、山药、汉防己、芦荟等中分离得到具有显著生理活性的多糖均一 体。目前，我国对药用多糖的研究仍多偏重于提取、分离、精制、化学组成和 免疫药理等方面，虽然大部分多糖品种尚处于实验阶段，但是也有几种多糖在 生物药领域有了长足的进步，如香菇多糖、黄茂多糖、人参多糖的注射针剂己 作为二类新药面市。但新型的糖生物学及工程学还没有得到应有的重视，和国 外相比仍有一定的差距。 1．2黄精的研究概况 中药黄精是百合科(Libaceae)黄精属(Polygonatum)多种植物的干燥根茎。同 属植物世界上有40多种，我国有30余种。《中国药典》(2000年版一部)规定：以百 合科黄精植物滇黄精(PolygonatumkingianumCoil．etHemsl．)、黄(Polygonatums ibiricumRedoute)或多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHus)的干燥根茎入药。黄精 分布于东北、华北、西北、华东以及河南、湖北、四川、贵州；多花黄精分布于 华东、中南、四川、贵州等地；滇黄精主产云南，四川、贵州、广西等省区也有 分布。 黄精为百合科黄精属植物滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎，作为一种传 统中药，有药食两用性，具宽中益气、益肾填精、滋阴润肺、生津补脾之功效， 主治肺燥干咳、体虚乏力、心悸气短、久病津亏口干等病症。其化学成分主要有： 多糖、甾体皂苷、黄酮类化合物、生物碱、强心苷、木脂素、维生素和氨基酸等 第一章前言 化合物。黄精多糖是黄精生物学活性物质中一个非常重要的成分。药理学研究证 明，黄精多糖具有免疫激发、增强免疫、抗病毒等作用【6J． 现代药理学研究证明，黄精具有增强免疫、降低血脂及血糖、延缓衰老等多 种药理作用。对黄精属植物化学成分的研究开始于1927年，B．GAAL另A玉竹Eof cinaleAll中分离得到粘质液对黄精化学成分的研究表明，黄精含有川体皂，黄酮类 化合物、多糖、生物碱、木脂素、凝集素、氨基酸及微量元素，其中对甾体皂苷 和多糖的研究最为广泛。近年来，对黄精多糖的研究取得一些很有意义的进展， 药理学研究证明，黄精多糖具有免疫激发、增强免疫、延缓衰老、抗病毒、延长 实验动物寿命，提高学习、记忆能力等多方面的作用。 1．2．1黄精的生物活性 近年来，国内对黄精的药理作用的研究较为广泛，证明黄精具有增强免疫、 降低血脂、血糖、延缓衰老等多种药理作用。黄精多糖是黄精中主要的生物活 性成份，对黄精多糖的药理研究表明，其具有免疫激发、增强免疫、延缓衰老、 抗病毒等作用同。黄精及黄精多糖的作用归纳如下： 增强免疫抗衰老功能 黄精具有免疫激发和免疫促进作用，能增强免疫功能。朱瑾波等人18J研究发 现黄精能促进正常小鼠、S120荷瘤小鼠和MNNG诱癌大鼠脾细胞产生IL-2，增 强NKC和CTL活性。薄芯等报道【9J，黄精可提高受环磷酰胺处理小鼠的骨髓 造血机能，使其白细胞和红细胞数值上升，骨髓嗜多染红细胞微核率下降，提 高小鼠腹腔巨噬细胞的功能。黄精粗多糖能明显促进正常小鼠和对抗环磷酰胺 所致小鼠胸腺和脾脏的重量增加，对小鼠网状内皮系统吞噬功能有明显的激活 和增强作用【10l，提示黄精多糖的升白细胞作用可能是通过促进脾脏间质细胞的 增生，发挥代偿性髓外造血功能所致【lll。体外实验表明【121．黄精多糖PSP可直接 作用于红细胞，增强红细胞膜Cab受体活性，使红细胞免疫粘附功能增强【13J延 长寿命：项平f14l的研究表明黄精水煎液能减少家蚕食桑量和减轻家蚕体重，具延 长家蚕幼虫期和家蚕寿命的作用。 徐志南【151等入的实验表明，黄精水提液能提高果蝇的飞翔能力，使果蝇在高 湖北大学硕士毕业论文 温下平均生存时间延长13％^t9％。实验表明【16】，黄精多糖能明显延长雄、雌两 性果蝇的平均寿命和最高寿命，实验结果经统计学处理均有显著差异。 降血糖、降血脂作用 降血脂：张融瑞【17】研究发现黄精水煎剂和乙醇提取物拌和饲料饲喂高脂血症 大鼠，能显著降低其血清总胆固醇(TC)及甘油三醋的含量。黄精煎剂灌服高血 脂兔，在给药后甘油三酷、P一脂蛋白、血胆固醇水平均有明显下降闪。还有 研究表明【18】，一定剂量黄精多糖具有降低高脂血症实验动物的血脂作用和抑制 动脉内膜泡沫细胞形成的药效。 降血糖作用：黄精浸膏或甲醇提取物PI可使正常小鼠、兔、以及由链脉霉素 诱发的高血糖小鼠和兔的血糖降低。加腾笃【19】报道，黄精的甲醇提取物可使正 常鼠及链脉霉素诱发糖尿病的小鼠血糖水平下降；给正常兔灌服黄精浸膏，其血 糖水平呈先升后降，对肾上腺素引起的血糖升高，黄精浸膏呈显著的抑制作用。 另有报道[20l，黄精甲醇提取物可使STZ(链服霉素)诱发的高血糖小鼠(胰岛素依 赖型模型．)的血糖降低，同时不改变血清胰岛素水平。此提取物还有抑制肾上腺 素诱发高血糖小鼠血糖的作用。黄精的降血糖作用应该是通过抑制GLUT2，进 而抑制肝糖释放而达到的【211． 抗病原微生物作用 抗菌作用：邵春源发现【22】黄精水浸出液(1：30)对伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、 抗酸杆菌有抑制作用。黄精煎剂对实验性结核病的豚鼠，无论是在感染结核菌 的同时，还是在感染后淋巴结肿大时再给药，均有显著的抗结核病的作用。 抗真菌：黄精醇提取水溶液2％以上浓度对多种真菌具有抑制作用，如荃色毛 癣菌、红色表皮癣菌等，其水抽出物对石膏样毛癣菌和考夫曼一沃尔夫氏表皮 癣菌有抑制作用固】 抗病毒作用：黄精的多糖制剂对兔眼实验性单纯疙疹病毒性角膜炎有显著的 抑制作用【241，曾庆毕等人报道各种黄精多糖制剂组与氯霉素组比较，疗效均有 统计学意义；黄精多糖滴眼液配合黄精多糖注射液结膜下注射和黄精多糖滴眼 液配合黄精多糖口服液两组疗效优于无环鸟普组。 第一章前言 抗肿瘤作用 张峰等【矧黄精多糖对H22实体瘤、$180腹水瘤的生长抑制作用和对荷瘤小 鼠免疫调节作用．小鼠接种H22实体瘤或S180腹水瘤后随机分组，灌胃给予不 同剂量[100、200、400mg／(kg木d)】的黄精多糖，以生理盐水和环磷酰胺为空白对 照组和阳性对照组，计算黄精多糖对小鼠H22实体瘤生长的抑制率，脾脏指数和 胸腺指数，以及S180腹水型荷瘤小鼠的存活时间．结果给予黄精多糖灌胃的荷 瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数显著增加；低、中、高剂量的黄精多糖对H22实体 瘤的抑瘤率分别是(34．93、43．44、56．25)％；中、高剂量的黄精多糖可以显著延 长S180腹水型荷瘤小鼠的存活时间．黄精多糖有显著的抗肿瘤作用和免疫调节 活性． 提高学习、记忆再现能力的作用 黄精水提物溶液【261不但对老年小鼠学习记忆有促进作用，而且对化学药物 所导致的记忆获得、巩固和再现三方面的障碍均有明显的改善效应。实验结果 显示黄精可增加小鼠大脑皮层和海马Ach含量和ChAT活性。通过提高ChAT 活性增加小鼠大脑皮层和海马内乙酰胆碱之含量，是黄精易化学习记忆功能的 主要机制。黄精乙醇提取物【27】能促进正常小鼠的学习能力，明显延长双侧颈总 动脉结扎致急性脑缺血小鼠的生存时间：体外实验，可显著抑制大鼠脑组织丙二 醛的生成。乙醇提取物及其总皂苷均能改善东蓖若碱所致小鼠学习记忆获得的 障碍。黄芳等【28l研究表明，黄精多糖能显著改善老龄大鼠学习记忆及记忆再现 能力，降低错误次数，给药组与阳性对照相比能明显缩短迷宫测试中大鼠的潜 伏时间。 对心血管系统的作用 强心作用：丁安荣报道【291，黄精甲醇提取物对小鼠心房肌的心肌收缩力有显著 增强作用，对心肌磷酸二酷酶和Na+、K+-ATP酶有明显抑制作用。黄精醇制 剂可使离体蟾蛤心脏收缩力增强，但对心率无明显影响，而黄精水提液则使离 湖北大学硕士毕业论文 体兔的心率加快【30】扩张冠脉：黄精醇制剂可增加小鼠冠脉流量p11，黄精水浸膏洛 式溶液可增加离体兔心冠脉流量【321，给兔静脉注射黄精溶液，有对抗神经垂体 素所致使的急性心肌缺血作用。 抗动脉粥样硬化作用：给实验性动脉粥样硬化的兔子肌注黄精赤芍注射液 结果给药组动物主动脉壁内膜上的斑块及冠状动脉粥样硬化程度均较对照组略 轻【33l 抗炎作用 彭成【341等人的研究结果表明，黄精多糖眼药水能消除兔模型结膜充血、水肿、 分泌物增加、角膜混浊、睫状体充血等局部表现；能明显抑SUd,鼠耳廓肿胀、 大鼠足趾肿胀；降低大鼠肉芽肿的重量，减少肉芽肿内渗出；对治疗大鼠免疫 性关节炎的原发病灶和继发病变有显著疗效，提示黄精多糖具有良好的抗炎作 用。 。 小结：现代药理学研究证明，黄精具有增强免疫、降低血脂、血糖、延缓衰 老等多种药理作用。多糖作为其重要的活性成分之一受到广泛关注，药理研究 表明，黄精多糖具有多种生物学活性。 1．2．2黄精多糖成分研究 黄精多糖是黄精化学组成的重要部分，是黄精主要生物学活性成分之一。 孙隆儒等【35】首次从黄精中分离得到正丁基一B．D．吡喃果糖苷，王易芬等【361 从滇黄精中分离得到正丁基⋯PD毗喃果糖苷，并得到了正丁基．p．D．吠喃果糖苷 和正丁基一a．D．呋喃果糖苷。 杨明河等人册分离得到黄精低聚糖甲份子量为1630，由8个果糖和一个葡 萄糖聚合而成)；黄精低聚糖乙(分子量为862，由4个果糖和一个葡萄糖聚合而 成)；黄精低聚糖丙(分子量为474，由2个果糖和一个葡萄糖聚合而成)。3种黄 精低聚糖均由果糖和葡萄糖组成，摩尔比分别为8：1，4：1和2：1。 黄精依次经热水和碱液提取，得到水提粗多糖PSW和碱提粗多糖PSB。粗 多糖PSW和PSB分别用DEAE一纤维素柱和凝胶柱层析等方法反复分离纯化 得到八种水溶性均一多糖及多糖复合物：PSWIb．2，PSW2A-1，PSW2A．2．1， 第一章前言 PSW3A,PSW鸭PSW5B，PSB．1B，PSB2A和一种水不溶性多糖PSWl．a。通过各 种方法，如高效凝胶过滤色谱法、光谱方法rHNMR，CNMR，IR，HMBC， GC．MS，ESI．MS)，糖组成分析、糖残基连接方式分析、部分酸水解、高碘酸 氧化和金属锂选择性降解等，对它们的物理性质(分子量和旋光度)和一级结构 进行了研究。结果表明，黄精水提物中含有中性多糖、酸性多糖和糖蛋白复合 物，其主要特征是均含有较高含量的半乳糖，且连接方式大部分以1，4．连接为 主。碱提多糖中含中性糖和酸性糖，它们的主要特征是含大量1，4一连接的木 糖。 1．2．3多糖的提取 首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同决定在提取之前是否作预处理， 对于动物多糖一般采用丙酮、乙醚、乙醇进行预处理，目的是脱脂。脱脂后的残 渣或不需要脱脂的原料常用水作溶剂来提取多糖[38J,此外用碱性水液∞加3，氯 化钠水液作提取溶剂，也有用水、3％的碱溶液、10％的碱溶液依次提取H¨，所 得的多糖提取液有的可直接过滤或者用离心法除去不溶物。 除蛋白：除蛋白的技术主要应用于动物多糖的提取，以新鲜组织或丙酮脱脂脱 水的组织或丙酮脱脂脱水为原料，可用水或盐溶液提取部分粘多糖。但因大部分 粘多糖是与蛋白质结合的，需用酶降解蛋白质部分或(和)用碱使多糖蛋白质问 的键裂开以促进粘多糖在提取时的溶解啪m·枷。在碱性提取的同时用蛋白酶处理 组织，可将提取过程简化Ⅲ朋3。多糖中的游离蛋白质可用蛋白沉淀剂如三氯乙 酸、鞣酸等除去‘38，蛔，少量蛋白则用Sevag法除去‘47～例。 去离子：去离子是为以后进一步纯化及色谱分析作准备，最古老的去离子方法 是透析法，必需选择一种规格适宜的透析膜以免样品损失，透析方法不仅能去盐也 可以除去各种小分子物质[483。使用柱离子交换法如用G．25以达到去离子作用， 本法比较简单，但是增大了溶液的体积，影响多糖的沉淀结果。纤维滤器透析法 是根据膜技术而新发展起来的，以这种方式对大多数样品进行浓缩速度很快，而 且温和，所以即使发生失活也是很小的。利用不同孔径的膜有可能使大小不同的 分子分级。但这个方法的分辨率要比分子筛层析可能达到的小得多。 乙醇沉淀：用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收多糖的简单方法，由于不同 ， 湖北大学硕士毕业论文 性质或不同分子量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它同样也可以用于样品中不同 多糖组分的分级分离。H卯。要根据具体情况使用不同浓度的乙醇，其中需要考虑 的包括多糖的浓度及盐浓度。 分离精制：一般组织中存在多种多糖，因而需要对多糖混合物进行分级分离。 对多糖进行分级分离的方法有多种，其中利用多糖在乙醇中的溶解度不同是一最 为常用的简单而有效的方法m1。根据多糖阴离子电荷密度的不同，可利用季铵 络合物的生成、离子交换色谱和电泳进行分级分离[49～513。根据分子量大小的不 同，用凝胶色谱、超滤等技术进行分级分离也是工业生产常用的方法口8，镭’52]。 纯度检查：建立一种成功的纯化方案需要消耗大量的时间和物资，人们不可 能简单地证明某物是纯的；与此相反，在某种条件下样品被分成两部分，各表现 不同的行为，因而证明其不纯倒是容易的事情，最好的纯度标准是建立多项指标， 每一项指标测定一种不同的特性。“多糖纯度"标准不能用通常化合物的纯度标 准来衡量，因为即使多糖纯品其微观也并不均一。测定多糖纯度的方法有功能团 分析、比旋度、水解后糖组分分析、纸色谱和高效液相色谱、超离心和高压电泳、 超离心分析法等。现在色谱技术已经得到较快的发展，应用也很方便，建议应用 三种以上的色谱系统证明样品的纯度E5310电泳(醋酸薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝 胶电泳、玻璃纤维纸电泳等)所检查的带，一般均宽‘47，49—2’54]。层析则以各种 凝胶的柱层析较好B8’55J，必须得单一对称狭窄的峰，高效液相层析配以适合糖 分析柱，则效果更好巧们。 1．2．4多糖定量检测方法的概述 直接测定多糖含量：多采用高效毛细管电泳法、高效液相色谱法和酶法等进 行多糖含量的测定。 利用组成多糖的单糖的性质进行测定：其中利用单糖缩合反应而建立的方法 最多，具体方法如下： 显色剂一酸法：多糖在酸作用下水解、脱水生成糖醛类化合物，与酚类、芳 胺类等缩合成有色化合物。根据所用强酸和显色剂的不同，这类方法主要有9 种：2％葸酮硫酸溶液、硫酸；二苯胺醋酸溶液、盐酸；间苯二酚乙醇溶液、盐 酸；地衣酚乙醇溶液、盐酸；5％苯酚水溶液、硫酸；2％Q一萘酚乙醇溶液、 第一章前言 硫酸；色氨酸、硫酸；3％水合卜半胱氨酸盐酸盐、硫酸；咔唑、硫酸。也有 采用苯酚—硫酸法加酶联免疫测定仪快速测定多糖含量的。 滴定法：取多糖水解液，加入指标剂，滴定经标定过的溶液，根据样品水解 液消耗体积，计算其含量。常用的滴定方法有斐林氏滴定法、间接碘量滴定法、 氧化还原滴定法等。如还原滴定法测香菇多糖、灵芝多糖、螺旋多糖。 DNS法(3，5二硝基水杨酸比色法)：利用与多糖水解产物还原糖共热后还 原成棕红色氨基化合物，于540rim处有特征吸收。 重量测定法：先用踟％的乙醇提取以除去单糖、低聚糖、生物碱等干扰性 成分，然后用水提取其中所含的多糖类成分。 生化分析法：将多糖水解，再用自动生化分析仪测定多糖含量，具有灵敏快 速、样品用量少、精密等优点。 石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)：如采用阿利新蓝(AlcianBlue)与尿样 中氨基多糖(GAG)在PH=5．8的醋酸钠溶液中，发生沉淀反应生成GAG铜 复合物。离心，分离沉淀物，以石墨炉原子吸收光谱法测定沉淀物中铜含量， 间接计算GAG含量。 “1．3酶解在中药研究中的应用 酶是由生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂， 能够参与和促进活体细胞内的各种化学、生化反应。酶具有极高的活性和高度 专一性，可在常温、常压和温和的酸碱条件下，高效地进行催化反应，因而受到重 视并得到广泛应用。今天，工业化用酶已涉及医药、食品、饮料、酿造、饲料、 纺织、洗涤、造纸、皮革及废水处理等众多领域。 酶作为中草药物提取液的澄清剂，可改善澄清度，同时提高沉淀速度，加速 过滤进程，实例见表1．1。中药水提取液含有多种类型的杂质，如淀粉蛋白质、 鞣质、果胶、黏液质等，采用常规提取法，在煎煮过程中药材中的蛋白质遇热 凝固、淀粉糊化，影响了有效成分的煎出，并给提取液分离带来困难。针对中 药水提取液中所含的杂质类型，采用相应的酶将其降解为小分子物质或分解除 去，可解决中药水提取液的过滤困难问题，并能改善中药、药酒等液体制剂澄 湖北大学硕士毕业论文 清度、提高制剂纯度以及成品质量的稳定性。 表1．1酶解技术在中药提取中的应用实例 生物转化是指利用酶或有机体(细胞、细胞器)作为催化剂实现化学转化的过 程，又称生物催化，是生物体系(包括细菌、真菌、植物组织、动物组织培养系 或生物体系的酶NN)对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应。生物转 化大多数是在室温、中性环境中作用，减少了产物分解、异构、消旋和重排反 应，反应底物不需要基团保护，具有无毒、无污染、低能耗、高效率、高选择 性、环境友好等特点。 对中药的单一有效成分的转化是将中药中的某一特定有效成分提取出来，经 生物转化后，寻找新的化合物，然后通过对新化合物的药理筛选来确定转化是 否有益。鉴于一些中药具体的活性成分和其作用机制还不是很清楚，有些成分 是口服后经过人体内消化酶的作用、体内微生物的代谢、人体代谢后才起作用， 有些中药是多个成分协同起作用，机械地采用对单一有效成分的转化研究对中 草药的生物转化来说有其不利的一面。不以特定成分为转化目标的中药转化研 究，而是对中草药的全成分进行转化，然后通过药理筛选模型来确定转化前后 药效的变化是否有益，进而研究转化产物能否应用于治疗实践较为适合中草药 的实际情况。这一方法的实质是通过对活性组份中不同成分的变化与活性强度 第一章前言 消长关系的分析来确定某种转化是否有益。 1．4影响多糖活性的因素 相对分子质量大小对多糖生理活性的影响 多糖的活性聚合度和相对分子质量有关，具抗肿瘤活性的B一(1，3)一D 葡聚糖的相对分子质量范围在10方和200万之间，高于或低于此相对分子质量 的多糖一般无活性，中等相对分子质量的多糖活性大于高相对分子质量及低相 对分子质量的多糖，体外研究表明，硫酸葡聚糖相对分子质量为1000时表现出 抗HIV活性，且活性随着相对分子质量的增加而增加，相对分子质量10000时 达到最大。 多糖的分子量、溶解度等能影响其生物活性，如分子量为90000左右的右旋 糖酐具有一定的活性，但它的活性随着大于或小于此分子量而迅速降低。牛膝 多糖是一个从植物中分离提取得到的一种小分子多糖化合物，它具有明显的免 疫增强作用，但无抗病毒活性阳。 Alban等人研究了分子量与硫酸化多糖抗凝血活性的关系，认为多糖与相对 分子质量呈哑铃型曲线关系1671。Blaschek(1992)，Fabre(1984)，Kojim《1986)研究 发现，分子的大小是多糖具备生物活性的必备条件，这可能同多糖分子形成的 高级构型有关，如分子量为9000左右的右旋糖酐具有一定的活性，其活性随分 子量大于和小于此值而迅速降低。一般来说，把较高分子量的多糖降解为较低 的分子量，能显著提高其活性。 裂褶多糖起初由于分子质量太大，影响临床应用效果，经过超声降解后，分 子质量有所降低，临床应用效果大为改善。因为分子质量过低，无法形成，产 生活性的聚合结构，在对海洋多糖卡拉胶构效关系研究中指出，卡拉胶抗病毒 活性在一定范围内随分子量增加而增强。Gao等人报道，硫酸化凝结多糖在相 对分子质量为(7----11)X103内随着相对分子质量升高，其抗凝血活性有增强 的趋势，这说明存在满足多糖活性的最佳相对分子质量范围。从细菌中分离的 某种果聚多糖Lebans，相对分子质量达到2．1X105时抑制肿瘤生长的活性最强 [681。 湖北大学硕士毕业论文 分子量是影响角叉菜多糖抗肿瘤活性的重要因素，对于肝癌H一22而言， 角叉菜多糖分子量适当减小可使抑瘤率升高，但分子量太小又会使抑瘤率迅速 降低，具有适中分子量的角叉菜多糖能保持高的抑瘤率【69J。 目前研究水平初步认为多糖的生物活性与其高级结构、分子量、溶解度等有 关【70l。国内外研究证明，姬松耳多糖的药效与多糖的含量、分子量大小、结构 等有重要关系【71】。综上所述：多糖的活性与分子量之间有着密切的关系。 多糖的活性与某些特定基团有关 香菇多糖本身只有抗肿瘤活性，硫酸化后具有抗HIV活性，能抑制HIV一 1产生的细胞裂变。硬脂酰化和磷酸酰化的甘露聚糖具有抗肿瘤活性是因为取 代基取代了糖链的空间位置，而右旋葡聚糖在棕榈酰化和磷酸酰化后才具有抗 肿瘤活性。 有报道，硫酸化多糖的抗病毒作用与分子量也有很大关系，其分子量为1000 时，能有效的抑制HⅣ一2诱导的合胞体的形成。硫酸葡聚糖的抗HⅣ一1活性 随分子量的增加而增加，在Mw=10000使最大，10000"'500000之间保持最大 活性。硫酸葡聚糖抗其它囊膜病毒能力也有近似的趋势。BruneteauM等从真菌 植物疫霉的细胞壁中分离的具支链的葡聚糖的免疫调节与分子量(Mw)有关， 具有较高的聚合度的葡聚糖有最佳活性。实验表明，肝素分子量在4000～12000 时抗凝血活性最好，多糖分子量越大，分子体积越大，不利于多糖跨越多重细 胞膜障碍进入生物体发挥生物学活性，肝素经过降解后的低分子质量组分能克 服肝素原有的出血和诱导血小板减小等不足，还具有抗血栓活性强，生物利用 率高，体内半衰期长和口服吸收等优点。用化学降解法获得的分子量为6420的 肝素(Or931733)，能有效地抑制HIV和人体巨细胞病毒的复制，且抗凝血活性 比其它多糖好，被认为是理想的艾滋病候选药物。 多糖的空间构象对生理活性的影响 多糖活性与其初级结构和高级结构特别是二维空间构想密切相关，特别是高 级结构，对其生理活性影响甚大。有证据表明，有B螺旋型立体结构的多糖其 抗病毒活性较高【72】。 第一章前言 一般认为，呈屈状螺旋的多糖活性较高，而呈可拉伸带状或皱纹型带状的多糖 活性一般较低甚至没有活性。三股螺旋构型是多糖最具活性的空间构像。茯苓 多糖(Pachyman)是8-1，3．葡聚糖，单线螺旋结构不具活性，如果通过化学方法制备 羧甲基衍生物即羧甲茯苓多糖，或在尿素存在下加热反应得到尿素茯苓多糖，这 两种衍生物便具有显著的抗肿瘤活性，x．衍射分析发现它们的立体结构从单股 螺旋变成三股螺旋。另外，X．衍射分析表明具有抗肿瘤活性的香菇多糖呈三股螺 旋结构，具有免疫活性的裂褶多糖也能形成类似三股螺旋的对称螺旋结构。 当向香菇多糖中添加尿素或二甲亚砜，使其失去其三股螺旋构像，改变空间构 型，其生物活性也随之消失。而向水不溶的裂褶多糖中添加尿素或氢氧化钠，则可 诱导产生规则的空间构像，从而表现出抗肿瘤活性。这些都说明，规则的空间构像 与多糖的生物学活性密切相关。随着化学、物理学、计算机科学、生物学、生 物化学、免疫学等多个学科的发展，随着多糖的资源挖掘的深入，对多糖的结构分 析、结构改造、合成机理及控制、药理作用、构效关系等各个方面都将会有较 大的突破，必将推动多糖类新药的研究与开发。 糖基的组成与糖苷键的类型：不同种类的多糖，其主链糖基组成和糖苷键类型 不同，生物学活性存在较大差异。如香菇多糖是以(1—3)葡聚糖主链结构，具有抗 肿瘤作用及提高细胞免疫及体液免疫功能，而同是葡聚糖主链的淀粉，其糖苷键 为(1—4)键型，却没有生物学活性，这在一定程度上源于二者主链糖苷键的类型 不同。银耳多糖主链为a．(1—3)糖苷键连接的甘露聚糖，具有免疫调节、抗肿瘤、 抗凝血、抗血栓等作用；从酵母细胞壁中得到的甘露聚糖能抑制人体细胞突变和 抗氧化的活性[73)o 冬虫夏草多糖的单糖组成为甘露糖、半乳糖、葡萄糖，其具有提高机体免疫功 能，抑制肿瘤细胞的作用，并能改善化疗引起的不良反应。支链的长度、取代度和 位置：如茯苓多糖由于支链过长而不具有抗肿瘤活性，需经过控制性氧化水解，降 低支链长度，才具有活性。带支链的菌多糖抗肿瘤的生物活性也取决于支链化的 程度，支链化程度超过4个糖基时，就会失去生物活性。支链化程度越大，生物活 性越弱。食药用菌活性多糖B．(1—3)．D．聚糖，分支度在0．2～0．33时生物活性较 强。PMH是一种从PlantagomajorL的叶子中分离出来的多糖，具有抗补体的活性， 移去末端连接到半乳糖上的阿拉伯糖可以增加活性，但移去连接在主链聚半乳 湖北大学硕士毕业论文 糖醛酸上的阿拉伯糖则降低了活性。 据预测，未来十年世界范围内的生化与生物技术药物的开发热点主要集中 在单克隆抗体、反义药物、基因治疗药物、可溶性蛋白质类药物和疫苗的几大 类。根据我国实际国情，生化药物五大领域具有极大潜力，可以深入挖掘，需 要特别重视和加强。其中开发多糖与寡糖类药物是一个热点，多糖类物质具有 广泛的生物活性，如免疫调节、抗炎、抗病毒、降血糖、抗凝血等，目前重点 开发的是真菌和植物来源的多糖。与蛋白质一样，多糖在自然界的存在具有广 泛性和复杂性，且不同序列的多糖片断具有不同的生物活性，因此多糖也是寻 找生化药物的宝库。活性多糖的研究可以从三个方面进行：继续从真菌、植物 中寻找活性多糖，重点是从动植物，特别是中草药中寻找高效的活性多糖；对 已发现的具有活性的多糖进行改造和化学修饰；对大分子活性多糖进行降解， 开发低分子和寡糖药物。 1．5课题的研究内容及思路 1．5．1课题的研究内容 ①黄精多糖及酶解物的制备 鉴于对小极性部分的研究以及脱脂处理的考虑，在进行对原材料进行脱脂处 理，再采用水煮醇沉的方法提取粗多糖换sevag法脱蛋白、1％活性炭脱色处理 得到精制多糖。 ②黄精多糖酶解物的药效学研究 在前期活性筛选的基础上，对黄精水提物，精制多糖和多糖酶解物采用免疫 试验(碳粒廓清实验，半数溶血值法和T-细胞染色法)，化疗后修复作用(脏器 质量法)和降血糖实验(四氧嘧啶法，口服葡萄糖法)，通过比较不同方法酶解 的多糖，在多糖含量相同的情况下，药力活性差异，优选出具有较高药理活性 的酶解物。 1。5。2课题的研究思路 图1．2课题思路 第一章前言 本文在以往文献研究的基础上，提出酶解的方法对多糖的分子量和分支度等理 化性质的改变，酶解方法具有具有无毒、无污染、低能耗、高效率、高选择性、 环境友好等特点。通过对比酶解物和未处理前物质的免疫和降血糖的药理活性， 获得参考指标，确定最佳的酶解物。大分子大分子活性多糖进行降解，开发低分 子和寡糖药物是目前多糖研究的热点之一，但相关文献较少，本文的研究不仅优 选了具有较高药理活性的黄精，同时通过文献已经获知多糖是黄精的主要成分之 一。为确证多糖是主要药理活性部位，我们在实验中建立了黄精水提物组， 作为参考，对比了黄精精制多糖的药理活性确实平行或高于黄精水提物。实验中 有四个酶解组的产物，主要是为了获的最佳的酶解工艺，在实验结果中可以发现， 不同的酶解方法的产物药理活性差异很大。 湖北大学硕士毕业论文 第二部分实验部分 2．1黄精多糖酶解物制备方法 黄精(购于武汉神草中药饮片有限公司，产地湖北，经本院植物学教研室王 万贤教授鉴定为polygonatumran．1anscianensepamp)。将干燥粉碎后的黄精生药 样品称取300g，用1500mL石油醚于60～90℃回流脱脂2次，每次1h，回收石 油醚，药渣挥干溶剂后用80％乙醇1500mL浸溃过夜，于80一90℃回流提取2 次，每次2h．过滤，将药渣用7500mL蒸馏水90℃温浸提取1h，再用1500mL 蒸馏水90"C重复温浸提取30min，过滤合并滤液，减压浓缩至150mL用氯仿萃 取多次以除去蛋白质，再加1％活性炭脱色2次，抽滤，滤液加入95％乙醇使含 醇量达80％，静置过夜后过滤，残渣依次用95％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚 多次洗涤，真空干燥得黄精多糖粉末。 将黄精多糖配制成一定浓度的水溶液。另取适量糖化酶溶于pH4．5的醋酸缓 冲液中，取一定体积的糖液与酶液混合，40℃水浴15min／30min，然后煮沸lOmin 将酶灭活。加入95％乙醇，使醇含量达80％醇沉，静置18小时析出沉淀。将醇沉 物离心于50。C真空干燥，即得黄精多糖酶解物。 表2．1酶解条件 2．2黄精多糖酶解物多糖含量测定 2．2．1仪器与试剂 岛津UV-1601紫外．可见分光光度计。葡萄糖、95％乙醇、无水乙醇、石油 醚、氯仿、乙醚、丙酮均为分析纯，水为重蒸水。硫酸．苯酚试剂：溶解809苯 酚于209水中，置冰箱避光贮存，使用时配制成5％苯酚，并按1：5分别加入 5％苯酚与浓硫酸于样品中。 第二章实验部分 3，5---硝基水杨酸试剂：3．1593，5-二硝基水杨酸和131mL2mol／L氢氧化 钠加到酒石酸钾钠的热溶液中(919酒石酸钾钠溶于250mL水中)，再加2．59重 结晶酚和2．59亚硫酸氢钠于其中，搅拌溶解，冷却后定溶到500mL，溶液为黄 色，贮于棕色瓶中。 2．2．2黄精总多糖含量的测定 根据多糖类在硫酸作用下，先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糠醛衍生物， 然后和苯酚缩合成有色化合物，我们选用分光光度法测定其含量。 标准溶液的配制：精密称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖100mg，置100mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度即得。 标准曲线的绘制：精密吸取标准品溶液0，10，20，40，60，80，100，120， 140uL，依次加蒸馏水使最终体积均为2．0mL，另取2．0mL蒸馏水作空白对照。 各管再加入1．0mL苯酚试液，摇均，迅速滴加浓硫酸各5．0mL，摇均后放置5min， 置沸水浴中加热15min，取出冷至室温，于490．5nm处测定吸收度，绘制标准曲 线。 精密称取干燥恒重的黄精精制多糖100mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶 解并稀释至刻度即得。按上述步骤测定吸光度，换算。 2．2．3黄精还原糖含量的测定 还原糖与3，5．二硝基水杨酸溶液共热后生成棕红色的氨基化合物，在一定 范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成线性比例关系，可用分光光度 法测定还原糖含量。 精确称取黄精提物50mg，用85％的乙醇索氏提取至回流液无色，烘干后溶 解，定容至50mL，作为供试液。 。 标准溶液的配制：精密称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖250mg，置250mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度即得。②．标准曲线的绘制：精密吸取标 准品溶液0，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2，1．4mL分置于25mL具塞试管中，依 次加蒸馏水使最终体积均为2．5mL，另取2．5mL蒸馏水作空白对照。各管中在分 别加入3，5．二硝基水杨酸试剂3mL，将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5 湖北大学硕士毕业论文 分钟，取出后，立即用冷水冷却到室温，定容，摇匀，于485．5nm波长处测吸光 度，绘制标准曲线。 精密称取干燥恒重的黄精精制多糖100mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶 解并稀释至刻度即得。按上述步骤测定吸光度，换算。 2．2．4黄精多糖酶解物多糖含量 在多糖制品的提取和研制过程中，往往需对其原料和制品中多糖的含量进行 测定坝9定多糖常用的方法是将试样经一定的处理后，取样液以苯酚．硫酸法测定 总糖，另以DNS法测定还原糖，以总糖减还原糖所得差值即得多糖(以葡萄糖计)含 量．苯酚．硫酸法测定总糖的原理是利用苯酚．硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中 的己糖、糖醛酸起显色反应，在一定范围内其消光值与糖的含量呈线性关系，从而 达到定量的目的． 黄精多糖含量=(黄精总糖含量．黄精还原糖含量) 2．3免疫实验研究 2．3．1仪器与试剂 实验仪器及试剂：岛津uv一1601紫外可见分光光度计(日本)；pH4．5的醋酸 缓冲液；中华墨汁；都氏试剂；Alsever溶液；生理盐水；Na2C03溶液；补体， 其余试剂均为国产AR级。 染色液： 付品红液：取29付品红加入2NHCl100ml，温水浴溶解后保存于4。C备用。 亚硝酸钠溶液(现用现配)：取0．149亚硝酸钠加入双蒸馏水10ml，振荡溶解。 a-醋酸萘酯溶液：取29a一醋酸萘酯溶于乙二醇单甲醚100ml中，贮于棕色瓶内， 于4℃保存。 ． 0．067Mol／LpH7．6PB液 甲液KH2P049．08溶于1000ml双蒸馏水 乙液KH2P049．479溶于1000ml双蒸馏水 甲基绿复染液：取19甲基绿，溶于100ml双馏水中，4。C保存。 ．1R． 第二章实验部分 应用染色液(孵育液)的配制取lml亚硝酸钠溶液缓慢滴入lml的付品红液中， 边加边摇匀，付品红液由红色变为浅黄色，混合后，静置Imin'--'2min，将此混 合液倒入30ralpH7．6PB液中，充分混合后，再加入a．醋酸萘酯溶液0．85ml，边 加边搅拌，混匀后使用。 实验动物：SPF级昆明种健康雄性成年小鼠，体重20．22g。由湖北省疾病预防 控制中心实验动物研究所提供(实验动物合格证号：SCXK(鄂)2003．0005)。 2．3．2碳粒廓清实验法 取KMd,鼠130只，雌雄各半，随机分13组：生理盐水对照组(等体积)、黄精 水提物、黄精多糖组、酶解多糖I～IV(多糖含量相等)组。每日灌胃给药1次， 连续lOd。末次给药后24h，于鼠尾静脉注入稀释印度墨汁0．1ml／109体重。于注 入墨汁后lmin及6min用毛细管从小鼠眼眶后静脉丛取血0．025m1．立刻滴入2ml 0．1％Na2C03溶液中。以0．025ml正常小鼠血溶于2ml0．1％Na2C03溶液做参照溶 液，于岛津UV一1601紫外可见分光光度计上澳lJ680nm处测定吸光度值，按下式 计算吞噬指数K。 K=(109Al-logA2)／(t2-t1) A1．1min的吸光值、A2．6min的吸光值、t2．第二次取血时间、t1．第一次取血时间 2．3．3溶血素实验法 免疫及给药：选取130只健康KM小鼠，雌雄各半，按体重随机分成13组．分 别为生理盐水对照组(0．2ml／只)、黄精水提物，精制多糖，酶解多糖(I．II．111． Ⅳ)(多糖含量相等)组经口给药，每日1次，连续10d。小鼠处死前4d先用溶血 素测定：小鼠断尾采血，室温下放置1h，离,l二,2000r／minX10min，分离血清．取 经生理盐水稀释100倍的血清1．0ml}Jl至反应管内，再加入O．5ml绵羊红细胞(1：5 稀释)。于每管中加入1．Oml卒F体，将反应管移至37"C恒温水浴中，保温30min， 反应毕．将反应管以2000r／min离,C,,lOmin．取上清液进行血红蛋白测定。同时 做样品空白对照．即用0．5ml生理盐水代替血清样品，其余同样品管。取上述离 心后的上清液1．OmlJJH入3．Oml都氏试剂中，充分摇匀后放置10min，于岛津uv— 湖北大学硕士毕业论文 1601紫外可见分光光度计540nm处比色以测定血红蛋白，计算样品的半数溶血值 HCso。 HCso=(样品吸收度值／SRBC半数溶血时的吸收度值)×稀释倍数。 2．3．4醋酸萘酯染色法 标本的制备 取KM小鼠140只，雌雄各半，随机分14组：正常组、生理盐水对照组(o．2ml ／只)、黄精水提物、黄精多糖组、酶解多糖I～Ⅳ组(见表2)。适应三天后， 除正常组外，其他组小鼠均尾静脉给予环林酰胺0．2ml造模，每日灌胃给药1次， 连续10d。末次给药后24h，尾静脉取血滴片。 染色镜检 于固定的标本片上滴加孵育液，以覆盖为度，37℃染45min'--'60min，蒸馏水冲 洗。 甲基氯复染lmin"-'5mm，蒸馏水冲洗。 自然干燥，镜检。 2．4黄精多糖酶解物对化疗后修复作用研究 2．4．1脏器指数法 取Kid'鼠140只，雌雄各半，随机分14组：正常组、生理盐水对照组(0．2ml ／只’l、黄精水提物、黄精多糖组、酶解多糖I～Ⅳ组(见表2)。适应三天后， 除正常组外，其他组小鼠均尾静脉给予环林酰胺0．2ml造模，每日灌胃给药1次， 连续10d。末次给药后24h，颈椎脱臼处死小鼠，破开腹腔、胸腔，剥取胸腺、脾 脏、肾，称质量。 按下式计算免疫器官胸腺、脾脏等脏器指数并比较各组间的差异． 胸腺指数=胸腺质量／体重*100％． 脾脏指数=脾脏质量／体重*100％ 肝指数=肝脏质量／体重*100％ 第二章实验部分 2．5黄精多糖酶解物降血糖活性研究 2．5．1仪器与试剂 实验仪器及试剂：岛津uv--1601紫外可见分光光度计(日本)；pH4．5的醋酸 缓冲液；生理盐水；葡萄糖试剂盒(中生北控生物科技)及其余试剂均为国产 AR级。 实验动物：SPF级昆明种健康雄性成年小鼠，体重20-22g。由湖北省疾病预 防控制中心实验动物研究所提供(实验动物合格证号：SCXK(鄂)2003．0005)。 2．5．2四氧嘧啶所致高血糖模型 造模方法：小鼠尾静脉注射四氧嘧啶(50mg／kg)，于72h后测定空腹血糖， 弃除血糖值明显较高及较低的小鼠，选血糖水平在16"---21mmol／L的小鼠作为高 血糖模型小鼠。 取造模成功的l(M小鼠140只，雄性，随机分14组(组间血糖平均值差异小 于0．056mmol／L)．①四氧嘧啶组(阴性对照组)：给予等体积蒸馏水灌胃。②正 常组。③其他组分别给予各组提取物高低两个剂量组灌胃，剂量设计同上(见表 3)。经口给药，每日1次，各组于给药七天后空腹由小鼠眼眶静脉取血，葡萄 糖氧化酶法测定血糖。 2．5．3口服葡萄糖耐量测定方法 取l(M小鼠130只，雄性，随机分13组．①模型组。②其他组分别给予各组 提取物高低两个剂量组灌胃，剂量设计同上，对照组灌胃给予等体积蒸馏水。给 药前禁食12小时测空腹血糖。给药后4小时各组均灌