大鼠肝细胞的分离_短期培养及异体移植治疗实验性急性肝功能衰竭

166 C址n J G en S u 攻 , Mav 199 8 , V OI . 13 , N o . 3 大 鼠肝细胞的分离 、短期培养及异体移植 治疗实验性急性肝功能衰竭 彭吉润 于聪慧 魏韬哲 魏玉华 朱继业 冷希圣 目的 研究分离 Sp r agU e 一Daw ley (sD )大鼠肝细胞的方法及短期培养后对细胞活力的影响 , 并研究新 鲜分离的同种异体肝细胞移植对实验性急性肝功能衰竭的治疗作用 。 方法 采用胶原酶原位循环灌注 法分离肝细胞 ; 游离肝细胞在合成 R PM I 164 0 培养基内培养 6 天并测定细胞内生化指标 ;用 D 一氨基半乳 糖将 60 只雄性 SD 大鼠制成急性肝功能衰竭模型并随机均分为移植组和对照组 , 将新鲜离体肝细胞悬 液注人移植组大鼠腹腔内 , 对照组则注人等量生理盐水 , 观察两组长期存活率的差异并进行扩检验 。 结果 游离肝实质细胞 (heP at oc yt e )的纯度可达 95 % , 细胞活率约 85 % 一 95 % , 平均每只大鼠移植肝细 胞 2 . 5 x lo “一 2 . 8 x l沪个 ; 经过短期培养 , 肝细胞内的丙氨酸转氨酶 、碱性磷酸酶仍具有较高活力 , 且肝 细胞仍具有合成蛋白质及胆红素的能力 ; 接受肝细胞移植的大 鼠存活率 (40 . 0 % )显著高于对照组 (13 . 3 % )(尸 < 0 . 0 1)。 结论 用上述方法分离的肝细胞纯度 、细胞活率均较高 , 行同种异体肝细胞移植 对大鼠急性肝功能衰竭有明显的治疗作用 。 关键词 肝细胞 肝功能衰竭 细胞移植 T he 七旧l心 o n , s h o rt 一te恤 c u】tu r e o f h ePat oc yte s an d al lo g rsft tr a盯‘p l朋加6皿 of fr e sh Pre Pa re d r a t be p . a toC yt eS in th e trea tm eut o f m u rine acu te ex P e ri m e n ta l he Pat ic fa il ure Pe 馆 Jio n , Yu C o n g h u i , 俄i几姗丙￡ , 。t 以 . 刀叩。rt me nt of 晓ne ral s“rg ery , Pe op le ’ 5 Hd‘I〕i耐 , Be 如嚼 Me d o l Un ~ ity , 及挤ng 1《X冷科 . o bj ec tiv e T o e val u at e th e e ffi e ac y Of i so la tio n , sh o rt 一 p e ri o d e u lture o n th e v iab ility Of rat h e pat OC yt es 二d th e e ffe c t Of tra n s Pl a n tat io n Of fre s h 一 p r apare d h e p a to e yt e , o n a eu te e x Pe ri m en tal hePat i e fa ilu re Of the rat . M eth · 。ds H e p a加Cyt es we o isol a喇 场 an in 一 situ e ol la g e n a se e ye le p e日汕s io n tee h n iqU e m od i6 ed 止 er se gl en ; Som e of th e iso lat e d h ePat oc yte s w e re e ultu re d i n RP M I 一 164 0 e ul tu re m ed iu m su pPl e m e n te d wi th 20 % n ew bo m c alf , e ru m for s ix d叮s , du ri n g th e 声ri od , th e ac tiv ity of gl u ta m ie 一盯ru v ie tr a n sam inas e (AST ) 阴d al kal in e p hos phat as e (A l尹) a n d the e o n te n t of to tal p ro te in (TP ) an d to tal bi lirub i n (下B il) 10 th e h聊耽yt es * 。 de - te rm i n ed ; s ixty m ai e SD ra ts wi th ac ut e he Pati e fa ilure i n d u eed b y D 一 g al ac tos am i n e we re r a n d o m ly divide d in to t ran o Pl ant ati on gr o u p ( n 二 30 ) an d e o ll tro l脚 u p (n = 30 ) , the fre sh he p at oc yte , we re tran s plan ted in 加拌‘- to n e日Iy to the fo rm e r an d the norm al oal in e to th e lat e r . R 韶ul ts Th e Pu ri ty of the is ola ted hePat oc yte s 。 95 % an d of the m , 85 一 95 % we re vi abl e , ha patoc yt es 如el de d am on nt to 2 . 5 一 2 . 8 xl 0s Per rat ; A几e r sho rt - term e ul tu re , the ac ti vi ti e s Of A ST an d AL[, we re sd ll wi th in no rm al ran 朗 an d th e heP at 二yte s s till sho w ed th e ab ility Of p rot e in 卿 th es is an d bil iru bin sec re ti o n ; Th e lo n g ~ te n n su 了v iv以 rate Of th e tn u . pla n ta ti on 目ro u p (叨% , 12 /3 o ) was 5 1邵ifican , ly 坛沙e r th朋 th a t of :he e on 园 s (13 . 3 % ,刃30 ) (p < 0 . 0 1 ,扩te st ) . C o n c lu -咖n Th e Puri ty a n d viab ility of he Pa to cyte s is Ol at e d 场 the afO re m enti o n e d m e th ed we re hi gh a n d all o gr af t tran o Pl an tati on o f rat h e p at ocv te s effe e ted a 5 1, 讯eant d ee~ e in th e m ort al ity of m u ri n e a eu te e x p e ri me n tal he Pa tie fa ilure . K ey w o r ds H eP a to c yt e U v er fa ilure C e ll tra n s plan tat ion 为 了获得可用于异体移植治疗实验性急性 肝功能衰竭 的肝细胞 , 作者用胶原酶原位灌注 法对大鼠肝细胞进行 了分离 、纯化及短期培养 , 进行了异体移植肝细胞治疗实验性急性肝功能 衰竭的初步研究 。 现报告如下 。 材料与方法 本课题为国家自然科学基金资助项 目 作者单位 : 1侧叉目鸿 北京 医科大学人民医院普通外科 (彭吉 润 、于聪慧 、魏玉华 、朱继业 、冷希圣 ); 河南医科大学第一 附属 医院普通外科 (魏韬哲) 一 、材料 1 . 动物 : 雄 性 孙ra gu e 一D aw ley 大 鼠 , 体重 200 一 30 0 9 , 购 自北京医科大学动物中心 。 2 . 主要试剂 :胶原酶 (Co ll昭e n as e w ) , D NA 中华普通外科杂志 1 998 年 5 且第 13 卷第 3 期 酶 (D N as e l ) 及 D 一氨 基 半乳 糖 (D 一G a la e - to s am i n e )均购 自 5 1脚a 公 司 , R p M I164 0 培养基 为 G IB CO 产品 。 3 . 仪器 : H~ u , 二氧化碳恒温孵育箱 (上 海产 ) , 岛津 CK 一7仪K) 型 自动生化分析仪 (日本 产) , 奥林帕斯 ix 一70 倒置相 差 显 微镜 (日本 产 ) , 科尔 ·帕默恒 温水浴箱 (美 国产 ) , LD S一ZA 型离心机 (北京产 ) , D D B 一 300 型 多通 道电子蠕 动泵(浙江产 )。 二 、肝细胞的分离及纯化 参照 Se glen 的方法并做了部分改进〔’〕。 大 鼠用 2 % 戊巴 比妥钠溶液 30 m g/ k g 体重腹腔注 射麻醉 , 同时腹腔内注射 Zoo U 肝素钠溶液 。 消 毒皮肤后 , 取正 中切 口 切开腹腔 。 显露游离 门 静脉后在距肝门 2 c m 处插人一 18 号导管 , 用 D一an k。 液 (含 0 . 0 1% E D以 、 3 7℃ 、 pH 7 . 4 , 通 以含 9 5 % O : 及 5 % CO : 的混合气体 )以 2 0 m l/ m in 的速度灌入 , 随后 于肝下后腔静 脉插人一 16 号导管放出积血积液 , 并剪开胸腔 , 夹闭肝 上后腔静脉 。 灌注 5 分钟后将灌注液 改为含 0 . 0 5 % C oll a罗n as e 及 0 . 0 1% D N as e l 的 H a n k s 液 (37℃ 、PH 7 . 4 , 通以含 9 5% 0 : 及 5 % CO : 的 混合气体)持续灌注 5 分钟。 取下肝脏 , 置于含 4℃ H a n ks 液的平皿中 , 剪去肝被膜 , 梳下肝细 胞 , 以单层无菌纱布过滤 , 制成混合细胞悬液 。 将灌注剩余的胶原酶溶液加人 悬液 中 , 并 以 Han k。液将总量调至 100 ml , 置于 37 ℃ 恒温水 浴中孵化 10 分钟 , 然后 , 将此悬液 以 100 目及 2(X) 目不锈 钢网过 滤 , 分 装于 3 一 4 个离心 管 中。 以 5 00 rp lrl 离心 2 分钟 , 弃上清 , 以 4℃ H an k , 液重悬 , 清洗并反复离心 3 次 , 再 以 4 ℃ H an ks 液重悬 , 做细胞涂片行 H E 染色判断肝实 质细胞纯度 , 用 0 . 4 % T口p a n Bl u e 染色判断细 胞活率 , 用血细胞记数板记数细胞浓度并计算 细胞产量 。 三 、肝细胞的短期培养 将上述分离 、纯化的肝细胞用合成培养基 (含 RP Mn 64 0 80 nil , 新生小牛血清 20 ml , 地 塞米松 10 一 7M , 牛胰岛素 10 一 SM , 青霉素 loo U / m l ,链霉素 l(X) U /m l)稀释成 0 . 5 x 106 / m l , 在 3 7℃ 、 5 % C0 2 条件下培养 6 天 , 每 2 一 3 天更换 一次培养基 , 每天在倒置相差显微镜下观察其 生长情况 。 四 、细胞生化测定 取 5 x l06 个新 鲜肝细胞加 人 10 % T ri to n 和生理盐水各半 , 将活的肝细胞制成匀浆〔2〕, 用 自动生化分析仪测定活的肝细胞 内的天冬氨酸 转氨酶 (AST ) 、碱性磷酸酶 (A LP ) 、总蛋 白(T P ) 及总胆红素(T 一Bi l) 的含量 , 并于培养后第 1 、 2 、 4 、 6 天各取 同样数 目的肝 细胞 进行 同样 的检 测 。 五 、异体肝细胞移植治疗 实验性急性肝功 能衰竭 用 10 % D 一氨基半乳糖 (l . 7 9 / k g 体重 , 腹 腔内注射 )将 6 0 只雄性 SD 大 鼠诱导成急性肝 功能衰竭模型并随机均分为移植组和对照组 , 于注药后第 48 小时将 Z ml 按上述方法制备的 新鲜离体肝细胞悬液 (细胞数为 2 x ro 7 / m l) 注 人移植组大 鼠腹腔 内 , 对照组则 注人等量生理 盐水 , 观察两组长期存活率的差异 (将存活至两 思以上者视为长期存活 )并进行 扩检验 。 结 果 一 、肝实质细胞活率 、纯度及产量 用上述方法分离 出的肝实质细胞 (H eP at o - c yt e )活率为 85 % 一 95 % , 纯度可达 95 % , 平均 每只大 鼠肝脏可分离出 2 . 5 x 10 8 一 2 . 8 x 10s 个 肝实质细胞 。 二 、细胞培养及细胞内生化测定结果 倒置显微镜下观察 , 经过 24 小时培养 , 大 部分肝细胞即开始贴壁 , 至 48 小时绝大多数细 胞贴壁牢固 , 其形状渐伸展为上皮样并与周围 细胞连接成片 , 只有极少数活力欠佳的细胞悬 浮于培养液中 , 可 于更换 培养基时将其大部吸 除。 经过短期培养 , 肝细胞内的 AST 、A廿 含量 尽管低于新鲜肝细胞 , 但仍有较高活力 。 培养 6 天的肝细胞也仍具有一定 的合成蛋 白和合成 胆红素的能力 (附 )。 三 、肝细胞移植结果 C坛n J G e n Surx , Mav 199 8 , V o l . 13 , N o . 3 移植组的长期存活率为 40 % (12 / 30) , 而对 照组的长期存活率为 13 . 3 % (4乃0 ) , 二者差异 有显著统计学意义 (p < 0 . 0 1 )。 附表 肝细胞内生化测定结果 (n = 6 ) 时间 AST (IU/ L ) ALP (IU几)T 一B il (IU几) ”(g / L ) 新鲜细胞 32 5 0 士 l(X) 8 2 2 土 10 1 . 7 上 1 . 0 1 . 6 士 0 . 4 第 l 天 2 33 2 士 8 2 7 18 土 6 1 . 0 土 0 . 3 1 . 1 土 0 . 3 第 2 天 1 75 1 士 3 8 9 17 士 6 1 . 3 土 0 . 6 0 . 9 土 0 . 2 第 4 天 13 5 8 士 5 3 5 17 士 6 1 . 2 士 0 . 5 1 . 1 士 0 . 4 第 6 天 12 13 土 2 1 6 16 土 7 1 . 4 土 0 . 6 1 . 1 土 0 . 1 讨 论 Se gl en 所描述的两步灌注分离肝细胞的方 法 , 是在进行第二步灌注 之前把肝脏取下〔’〕。 由于该方法容易撕裂肝脏包膜从而影响肝脏的 消化 , 因此 , 我们始终保持了肝脏原位灌注 , 不 但避免了上述危险的发生 , 并且简化了操作步 骤 。 此外 , 我们 在第二灌注液 中加人了 0 . 01 % D N as e l , 目的是为 了减少 已经分离的肝细胞 重新凝聚成 团闭 。 通过上述改进 , 我们得到了 纯度 、活率及产量均较高的肝实质细胞 。 T巧Pa n Bl u e 拒染法只是判断细胞活力的一 种初步方法 , 若要进一步判明所获得的离体细 胞活力 ,则需进行细胞培养 。 上述的肝细胞培 养观察及细胞内生化测定结果进一步证明 , 我 们所得到的肝实质细胞具有较高活力 , 适于进 行肝细胞移植研究 。 尽管在肝细胞培养中对培 养基的选择尚有不同意见 [’, 5〕, 但我们应用 RI, - M n 6 4 0 培养基加人 2 0 % 小牛血清并参照 Di ch 等人 的实验结果加 人 了 10-- “M 牛胰岛素及 10 一 7M 地塞米松 , 使肝细胞生长 良好并保持了 一定的功能困 , 这也是一种培养肝细胞的 可行方法 。 我们的肝细胞移植结果进一步证明同系异 体肝细胞移植对急性肝功能衰竭具有 明显的治 疗作用 , 肝细胞移植逆转急性肝功能衰竭的作 用机理可能有 : (l) 移植肝细胞可能为受体提供 暂时的却是有效的肝脏功能支持 , (2 )移植肝细 胞的裂解产物可能具有刺激和促进病肝再生和 恢复的作用 。 其确切的机理 , 尚需进一步研究 。 参 考 文 献 S心en PO . P况p咧ion of rat liver c ell o . 3 . E n 勺m坦 tic 二- q u ire men ts for t issu e di s碘招 l闭 . E即 Cell R 韶 , 19 7 3 , 8 2 : 3 9 1 . Sh arma BK , Ba e o n BR , Bri tt on RS , e t al . Pr e ven ti on Of h叩- a l〔, ( y一e in ju 侧 an d 11飞、i〔1 p e rox id a ti o , 、b y iron eh e la健o 比 an d al - Ph a 一 10 ‘叩h ero l in is o lat 找1 ir o n 一lo a d e d rat h e pat 佣yt es . H 叩卜 Iol o gy , 19 9 0 , 12 : 3 1 . AI Pin i G , Ph i伍p s JO , V ro m an B , e t al . R 浦x :e n t ad van ees in th e is ol at io n o f liver eel l s . h叩ato lo gy , 199 4 , 2 0 : 4 9 4 . 鄂 征主编 . 组织培养和分子细胞学技术 . 第 1 版 . 北 京 : 北京出版社 , 199 5 . 120 一 1 38 . 王宇明 . 小鼠肝细胞分离培养中应注意的问题 . 细胞生 物学杂志 , 199 2 , 14 : 封三 . D ieh J , V 认d C , G ru nn d N . Lo n 兮term e u ltur e of h印at o - eyt 璐 : e口池e t Of h ormo n e s on en z帅e ac 6 v ities an d m e t戒d ie eaP a e ity . HeP 川 o lo gy , 19 8 8 , 8 : 3 9 . (收稿 : 19 9 7 一1 2一 17 修回 : 199 8 刁2 . 1 1) 〔本文编辑 : 萍 雷) 199 8 年临床营养支持高级学习班通知 为了进一步促进我国临床营养支持的发展 , 解放军普通外科研究所将与 日本味之素公司在南京联合举办三期 “临床营养支持高级培训班” , 时间分别定于 19 98 年 4 月 、 9 月 、 12 月 , 每期 2 周 , 各招 20 名 。 三期培训班均免收食 宿费 、学杂费 , 但往返路费 自理 。 本培训班属提高班性质 , 故要求参训人员必须由单位或专家推荐 , 且证明具备以下条件 : (l) 不低于本科学历 ; (2) 不低于主治医师职称 ; (3) 熟悉营养支持的基础知识 ; (4 )较强的英文阅读能力 。 我们将根据报名信和推荐信 , 择优寄发报到通知 。 来信请详细注明联系地址 、电话或传真 。 报名截止 日期 : 第一期为 1998 年 4 月 1 日 , 第二 、三期为 1 998 年 7 月 31 日(以邮件到达 日为准)。 报名信和推荐信请寄 : 江苏省南京市中山路 305 号 南京总院普通外科研究所 刘永武(邮编 : 21 (X旧2 ) , Fa x : 0 25 一 4 80 39 56 。